江心雨，蘇云燕，胡春洪*，張龍江

作者單位 1.蘇州大學(xué)附屬第一醫(yī)院放射科，蘇州 215008；2.南京大學(xué)醫(yī)學(xué)院金陵醫(yī)院醫(yī)學(xué)影像科，南京 210002

0 引言

阿爾茨海默病（Alzheimer's disease, AD）是以β-淀粉樣蛋白沉積和tau蛋白糾纏為主要病理特征的進(jìn)行性神經(jīng)退行性疾病[1-3]，β-淀粉樣蛋白被認(rèn)為是AD發(fā)病過(guò)程中最關(guān)鍵性的因素。其在人體的清除途徑主要有三條：泛素-蛋白酶體系統(tǒng)和自噬溶酶體系統(tǒng)[4-5]的腦內(nèi)降解、血液循環(huán)清除[6-8]及膠質(zhì)淋巴系統(tǒng)（glymphatic system, GS）清除[9-10]。而膠質(zhì)淋巴系統(tǒng)在清除大腦中的β-淀粉樣蛋白中起著重要作用[11-12]。其中，星形細(xì)胞端足上水通道蛋白4（aquaporin 4, AQP4）在膠質(zhì)淋巴通路中尤為關(guān)鍵[13-15]。動(dòng)態(tài)對(duì)比增強(qiáng)（dynamic contrast-enhanced, DCE）-MRI 技術(shù)近年來(lái)已逐漸用于探索腦膠質(zhì)淋巴系統(tǒng)在多種神經(jīng)退行性疾病中的作用，研究者通過(guò)DCE-MRI 評(píng)估肌萎縮側(cè)索硬化轉(zhuǎn)基因小鼠在疾病早期的腦膠質(zhì)淋巴系統(tǒng)功能[16]。為了評(píng)估膠質(zhì)淋巴功能，BEN-NEJMA 等[17]在14 月齡的Tet-Off APP（AD）小鼠和年齡匹配的同窩對(duì)照中使用DCE-MRI。HARRISON 等[12]也通過(guò)DCE-MRI 證明了tau 病小鼠模型中膠質(zhì)淋巴系統(tǒng)CSF-ISF 交換受損。然而高分辨率DCE-MRI 尚未在年輕APP/PS1小鼠中進(jìn)行廣泛研究。

在9.4 T系統(tǒng)下獲得的小鼠大腦高質(zhì)量高分辨率擴(kuò)散MRI 數(shù)據(jù)集，包括迄今為止獲得的最高空間分辨率（25 μm 各向同性，126 個(gè)擴(kuò)散編碼方向）和最高角分辨率（50 μm各向異性，384個(gè)擴(kuò)散編碼方向），在小鼠中可用于表征組織微觀結(jié)構(gòu)和結(jié)構(gòu)連接性[18]。本研究擬采用9.4 T DCE-MRI 技術(shù)觀察轉(zhuǎn)基因AD小鼠腦膠質(zhì)淋巴系統(tǒng)CSF 流入量與年齡的關(guān)系，探索疾病早期階段（8 月齡前，腦膠質(zhì)淋巴系統(tǒng)利用最強(qiáng)的時(shí)期，以期望作為AD 早期治療的窗口期。本研究評(píng)估AQP4隨年齡變化表達(dá)模式的改變，并進(jìn)一步抑制AQP4 功能，驗(yàn)證AQP4 在腦膠質(zhì)淋巴系統(tǒng)中的關(guān)鍵作用，這對(duì)了解AD發(fā)病機(jī)制具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物模型制作

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物選取雌性2、4、6、8 月齡APPswe/PSldE9（APP/PS1）轉(zhuǎn)基因小鼠和野生型（wild-type,WT）小鼠各1只（江蘇省集萃藥康），該轉(zhuǎn)基因小鼠模型通過(guò)插入APP和PSEN1基因增加β-淀粉樣蛋白的產(chǎn)生，以模擬神經(jīng)退行性疾病AD[19]。對(duì)于AQP4 的藥理學(xué)抑制，將N-（1, 3, 4-噻二唑基）煙酰胺[N-（1, 3,4-Thiadiazolyl） nicotinamide, TGN-020）（上海藍(lán)木化工有限公司，中國(guó)）溶解在β-環(huán)糊精（上海藍(lán)木化工有限公司，中國(guó)）中以增加溶解度。將TGN-020 溶液和β-環(huán)糊精溶液（250 mg/kg，20 mL/kg 體質(zhì)量）腹腔注射于2 月齡WT 小鼠。所有動(dòng)物于無(wú)特定病原體（specific pathogen free, SPF）屏障環(huán)境飼養(yǎng)。本實(shí)驗(yàn)于2022 年8 月開始在東部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院進(jìn)行。實(shí)驗(yàn)方案由蘇州大學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（批準(zhǔn)文號(hào)：202208A0515）。

1.2 DCE-MRI

1.2.1 手術(shù)準(zhǔn)備

動(dòng)物準(zhǔn)備，用2%異氟烷（深圳瑞沃德生物科技股份有限公司，中國(guó)）和氧氣混合麻醉小鼠，向大池（cisterna magna, CM）注射對(duì)比劑釓噴酸葡胺（Gadopentetate dimeglumine, Gd-DTPA）（上海藍(lán)木化工有限公司，中國(guó)）[20]。將動(dòng)物放置在定制的立體定位架中，在顱底和第一節(jié)椎骨的枕骨邊緣之間的中點(diǎn)處進(jìn)行中線切口。暴露CM 后，通過(guò)50 μL 玻璃微量進(jìn)樣器（氣相尖頭，上海安亭微量進(jìn)樣器廠，中國(guó)）以1 μL/min的速度注射8 μL濃度為75 mM 的低分子量順磁對(duì)比劑Gd-DTPA 溶液，進(jìn)針深度1.5 mm。為了避免漏液，將微量注射器再放置5 min后拔針。

1.2.2 MR圖像采集

使用O2與2%異氟烷（深圳瑞沃德生物科技股份有限公司，中國(guó)）混合，以400 mL/min 的流速誘導(dǎo)麻醉。在MR圖像采集過(guò)程中，異氟烷濃度最初設(shè)定為2%，隨后在需要時(shí)降低，以保持（100±10）次/min的穩(wěn)定呼吸率。此外，使用體溫調(diào)節(jié)系統(tǒng)（Thermo Fisher scientific，美國(guó)）將體溫保持在37.0 °C～37.5 °C 之間。獲取磁共振圖像后，將小鼠單獨(dú)放在加熱墊上回收并標(biāo)記，然后返回各自的籠子。

在30 cm孔徑的9.4 T MR設(shè)備上（BioSpec 94/30，布魯克，德國(guó)）上采集小鼠的MR圖像。T2WI_TurboRARE掃描參數(shù)：TR 3500 ms，TE 33 ms，F(xiàn)OV 20 mm×20 mm，平均次數(shù)為2，層厚0.7 mm，層間距0 mm。T1WI_FLASH 掃描參數(shù)：TR 17.5 ms，TE 4 ms，F(xiàn)OV 19.2 mm×12.8 mm，平均次數(shù)為3，層厚0.1 mm，層間距0 mm。每15 min 進(jìn)行一次DCE-MRI 掃描，并在對(duì)比劑注射后30 min 開始掃描直至150 min 結(jié)束，共完成8次掃描。

1.3 數(shù)據(jù)處理

選取背側(cè)第三腦室和第三腦室及第四腦室與導(dǎo)水管交界處為3 個(gè)感興趣區(qū)，通過(guò)ITK-SNAP（version 3.8.0, http://www.itksnap.org）開源軟件，由一位3 年閱片經(jīng)驗(yàn)醫(yī)師采用盲法對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行手動(dòng)勾畫，勾畫時(shí)避開腦室邊緣，并由另一位具有10 年放射科工作經(jīng)驗(yàn)的副主任醫(yī)師審核，共同確定最終感興趣區(qū)（圖1），并測(cè)量其信號(hào)強(qiáng)度均值，在每只小鼠每個(gè)感興趣區(qū)上取30、60、90、120 min 共4 個(gè)時(shí)間點(diǎn)的均值為作為此感興趣區(qū)并代表此月齡的CSF 流入信號(hào)強(qiáng)度均值。兩組之間采用t檢驗(yàn)進(jìn)行比較，顯著性水平設(shè)為P＜0.05，所有統(tǒng)計(jì)測(cè)試均使用GraphPad Prism 9.5（GraphPad Software，美國(guó)）。

圖1 感興趣區(qū)（ROI）勾畫示意圖。所有小鼠均選擇背側(cè)第三腦室（ROI體積范圍0.03～0.05 mm3），第三腦室（ROI 體積范圍0.02～0.04 mm3），第四腦室與導(dǎo)水管交界處（ROI體積范圍0.01～0.02 mm3）3個(gè)部分為ROI，并測(cè)量每個(gè)ROI在4個(gè)時(shí)間點(diǎn)的平均信號(hào)強(qiáng)度，代表此月齡的CSF流入信號(hào)強(qiáng)度均值。Fig.1 Region of interest (ROI) delineation diagram.Three ROIs are selected in all mice: the dorsal 3rd ventricle (ROI volume range is 0.03-0.05 mm3), the 3rd ventricle (ROI volume range is 0.02-0.04 mm3), and the junction of the 4th ventricle and aqueduct (ROI volume range is 0.01-0.02 mm3).The mean signal intensity of each ROI at four time points is measured, representing the signal intensity of CSF inflow at this month of age.

1.4 病理標(biāo)本制作

在MRI 采集后直接收集大腦組織[12]。通過(guò)腹膜內(nèi)注射60 mg/kg/BW 戊巴比妥（Selleckchem，美國(guó)）對(duì)小鼠進(jìn)行深度麻醉，然后用冰冷的磷酸鹽緩沖鹽水（武漢塞維爾生物科技有限公司，中國(guó)）和4%多聚甲醛（Sellekchem，美國(guó)）進(jìn)行經(jīng)心灌注。取出大腦組織，并在4%多聚甲醛中固定24 h，隨后包埋切片。切片在0.3%的硫黃素（上海源葉生物，中國(guó)）染色溶液中染色[21]；隨后通過(guò)Anti-Aquaporin 4 Rabbit pAb（Servicebio，中國(guó)）一抗和CY3 標(biāo)記山羊抗兔IgG（Servicebio，中國(guó)）二抗，對(duì)AQP4 以及Anti-CD31 Mouse mAb（Servicebio，中國(guó)）一抗和Fluor 488 標(biāo)記山羊抗小鼠IgG（Servicebio，中國(guó)）二抗對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞進(jìn)行免疫熒光染色。使用組織切片數(shù)字掃描儀（Pannoramic MIDI，3D HISTECH，匈牙利）拍攝Th-S斑塊、AQP4/CD31的免疫熒光圖像，并使用數(shù)字切片瀏覽軟件（Caseviewer 2.4，3D HISTECH，匈牙利）進(jìn)行圖像采集。Paxinos 和Franklin 的第二版小鼠大腦立體定位坐標(biāo)被用作感興趣區(qū)域定位的參考。

2 結(jié)果

2.1 APP/PS1 組和WT 組對(duì)膠質(zhì)淋巴通路利用的組內(nèi)分析

鞘內(nèi)輸注Gd-DTPA 于30、60、90、120 min時(shí)的圖像（圖2～4）發(fā)現(xiàn)，APP/PS1 組腦CSF 流入信號(hào)強(qiáng)度均值從2至4月齡增加（2月齡為1 464.42±298.24；4月齡為2 711.67±1 270.25；P=0.18），4至6月齡在較高水平保持相對(duì)穩(wěn)定（4 月齡為2 711.67±1 270.25；6 月齡為2 632.25±729.65；P=0.93），6 至8 月齡降低（6 月齡為2 632.25±729.65；8 月齡為1 688.83±436.44；P=0.13）（圖2和圖4）。WT組腦CSF流入信號(hào)強(qiáng)度均值在2至4月齡增加（2月齡為2 579.58±911.70；4月齡為3 991.58±1 133.04；P=0.17），4 至6 至8 月齡逐漸下降（6 月齡為1 663.25±473.07；8月齡為1 305.92±382.86；P=0.37），其中4至6月齡下降顯著（P=0.034）（圖3和圖4）。

圖2 Gd-DTPA 鞘內(nèi)注射后連續(xù)采集T1加權(quán)圖像。APP/PS1組CSF流入信號(hào)強(qiáng)度均值先升高（2 至4 至6 月齡）后降低（6 至8 月齡）。Gd-DTPA：釓噴酸葡胺；CSF：腦脊液；APP/PS1：阿爾茨海默病模型。Fig.2 T1 weighted images are continuously collected after intrathecal injection of Gd-DTPA.The mean signal intensity of CSF inflow in the APP/PS1 group first increased (2 to 4 to 6 months) and then decreased (6 to 8 months).Gd-DTPA: Gadopentetate dimeglumine; CSF: cerebrospinal fluid; APP/PS1: Alzheimer's disease model.

圖3 Gd-DTPA 鞘內(nèi)注射后連續(xù)采集T1 加權(quán)圖像。WT 組CSF 流入信號(hào)強(qiáng)度均值先升高（2至4月齡）后降低（4至6至8月齡）。Gd-DTPA：釓噴酸葡胺；WT：野生型；CSF：腦脊液。Fig.3 T1 weighted images are continuously collected after intrathecal injection of Gd-DTPA.The mean signal intensity of CSF inflow in the WT group first increased (2 to 4 months) and then decreased (4 to 6 to 8 months).Gd-DTPA: Gadopentetate dimeglumine; WT: wild-type; CSF:cerebrospinal fluid.

圖4 不同月齡APP/PS1 組和WT 組CSF 流入信號(hào)強(qiáng)度均值變化。APP/PS1組CSF流入信號(hào)強(qiáng)度均值從2至4月齡增加，4至6月齡在較高水平保持相對(duì)穩(wěn)定，6 至8 月齡降低。WT 組CSF 流入信號(hào)強(qiáng)度均值在2至4月齡增加，4至6至8月齡逐漸下降。其中4至6月齡降低顯著，從而導(dǎo)致6 月齡APP/PS1 組 CSF 流入信號(hào)強(qiáng)度均值超過(guò)WT 組。APP/PS1：阿爾茨海默病模型；WT：野生型；CSF：腦脊液。Fig.4 Changes in the mean signal intensity of CSF inflow in APP/PS1 group and WT group at different ages.The mean signal intensity of CSF inflow in the APP/PS1 group increased from 2 to 4 months old, remained relatively stable at a higher level from 4 to 6 months old, and decreased from 6 to 8 months old.The mean signal intensity of CSF inflow in the WT group increased from 2 to 4 months of age, and gradually decreased from 4 to 6 to 8 months of age.The mean signal intensity decreased significantly from 4 to 6 months of age in the WT group, leading to a higher mean signal intensity of CSF inflow in APP/PS1 group at 6 months of age compared to WT group.APP/PS1: Alzheimer's disease model; WT: wild-type; CSF: cerebrospinal fluid.

2.2 APP/PS1 組和WT 組對(duì)膠質(zhì)淋巴系統(tǒng)利用的組間比較

相同月齡的APP/PS1組CSF流入信號(hào)強(qiáng)度均值低于WT 組出現(xiàn)在2 月齡（APP/PS1 為1 464.42±398.24；WT為2 579.58±911.70；P=0.12）和4月齡（APP/PS1為2 711.667±1 270.25；WT 為3 991.58±1 133.04；P=0.26），而6 月齡（APP/PS1 為2 632.25±729.65；WT 為1 663.25±473.07；P=0.13）和8 月齡（APP/PS1 為1 688.833±436.44；WT為1 305.917±382.86；P=0.32）APP/PS1 組CSF 流入信號(hào)強(qiáng)度均值高于WT 組，其中6 月齡增高幅度更大（圖4）。這與淀粉樣蛋白沉積速率在4 至6 月齡階段放緩相對(duì)應(yīng)。

2.3 病理檢測(cè)結(jié)果

APP/PS1 組淀粉樣蛋白隨年齡的增長(zhǎng)而逐漸積累，2 月齡至4 月齡積累速度相對(duì)較慢，4 月齡至6 月齡基本保持穩(wěn)定，6月齡至8月齡在海馬、皮層加速積累（圖5）。

圖5 免疫熒光硫黃素染色（×19.7）圖顯示了APP/PS1 和WT 小鼠年齡依賴性腦淀粉樣蛋白的積累。在APP/PS1小鼠腦淀粉樣蛋白的積累速率隨著月齡增加，表現(xiàn)出從慢到平穩(wěn)再加速的變化。在WT 小鼠中沒(méi)有淀粉樣蛋白積累。綠色代表淀粉樣蛋白，藍(lán)色代表DAPI。APP/PS1：阿爾茨海默病模型；WT：野生型；DAPI：4', 6-二脒基-2-苯基吲哚。Fig.5 The immunofluorescence Thioflavin staining (×19.7) plot shows the accumulation of age-dependent cerebral amyloid protein in APP/PS1 and WT mice.Amyloid protein gradually accumulated with increasing age, and the accumulation rate in APP/PS1 mice range from slow to stable and then to fast.There is no accumulation of amyloid protein in WT mice.Green represents amyloid protein, and blue represents DAPI.APP/PS1: Alzheimer's disease model;WT: wild-type; DAPI: 4, 6-diamidino-2-phenylindole.

在APP/PS1 組和WT 組中，與2 月齡相比，8 月齡小鼠腦切片均表現(xiàn)出AQP4 的極化程度下降，其中APP/PS1 組隨年齡增大AQP4 極化程度下降幅度更大，與WT 組相比，8 月齡APP/PS1 組AQP4 極化程度降低，2月齡組降低不明顯（圖6）。

圖6 冠狀切片的AQP4免疫熒光染色（粉色）在2月齡和8月齡的APP/PS1 和WT 小鼠的免疫反應(yīng)性（×78.5）。6A：與2 月齡相比，8 月齡APP/PS1組在海馬皮層的血管周圍（CD31綠色）（×78.5）AQP4熒光強(qiáng)度降低。6B：與2月齡相比，8月齡WT組在海馬皮層的血管周圍AQP4熒光強(qiáng)度降低。與WT組相比，8月齡APP/PS1組AQP4信號(hào)強(qiáng)度降低，2月齡組降低不明顯，典型圖示于6A和6B。2和8∶2月齡和8月齡；T：APP/PS1組，W：WT組；Hc：海馬；Cx：皮層；APP/PS1：阿爾茨海默病模型；WT：野生型。Fig.6 Immunofluorescence staining of AQP4 (pink) (×78.5) in coronal sections and its immunoreactivity in APP/PS1 and WT mice aged 2 and 8 months.6A: Compared with the 2-month-old group, the APP/PS1 group aged 8 months shows a decrease in AQP4 fluorescence intensity around blood vessels in the hippocampus and cortex (CD31 green) (×78.5).6B: Compared with the 2-month-old group, the WT group aged 8 months shows a decrease in AQP4 fluorescence intensity around blood vessels in the hippocampus and cortex.Compared with the WT group, the APP/PS1 group shows a decrease in AQP4 fluorescence intensity at 8 months of age, while the decrease is not pronounced in the 2-month-old group, as shown in typical figures 6A and 6B.2 and 8∶2 and 8 months of age; T: APP/PS1 group, W: WT group; Hc: hippocampus; Cx:cortex; APP/PS1: Alzheimer's disease model; WT: wild-type.

2.4 AQP4的藥理學(xué)抑制對(duì)CSF流入影響的分析

用TGN-020 處理的2 月齡WT 小鼠表現(xiàn)出CSF流入信號(hào)強(qiáng)度均值減少（環(huán)糊精處理為3 578.08±1 199.95；TGN-020 處理為1 655.42±377.96；P=0.06）（圖7、圖8）。

圖7 TGN-020 注射后，Gd-DTPA 鞘內(nèi)注射后連續(xù)采集T1 加權(quán)圖像。AQP4抑制組，CSF流入信號(hào)強(qiáng)度均值減少。TGN-020：N-（1, 3, 4-噻二唑基）煙酰胺；Gd-DTPA：釓噴酸葡胺；CSF：腦脊液；AQP4：水通道蛋白4。Fig.7 After TGN-020 injection, T1 weighted images are continuously collected after Gd-DTPA intrathecal injection.In AQP4 inhibition group,the mean signal intensity of CSF inflow decreased.TGN-020: N-(1, 3,4-Thiadiazolyl) nicotinamide; Gd-DTPA: Gadopentetate dimeglumine;CSF: cerebrospinal fluid; AQP4: an aquaporin 4.

圖8 AQP4 抑制前后CSF 流入信號(hào)強(qiáng)度均值變化，2 月齡WT 組經(jīng)TGN-020 處理后，CSF 流入信號(hào)強(qiáng)度均值有減少的趨勢(shì)。TGN-020：N-（1, 3, 4-噻二唑基）煙酰胺；CSF：腦脊液；AQP4：水通道蛋白4；WT：野生型。Fig.8 Changes in the mean signal intensity of CSF inflow before and after AQP4 inhibition.After WT group is treated with TGN-020 at 2 months old, there is a decreasing trend in the mean signal intensity of CSF inflow.TGN-020: N-(1, 3, 4-Thiadiazolyl) nicotinamide; CSF: cerebrospinal fluid; AQP4: an aquaporin 4; WT: wild-type.

3 討論

本研究對(duì)2、4、6、8 月齡APP/PS1 和WT 小鼠進(jìn)行DCE-MRI 掃描，AQP4 抑制后再行DCE-MRI 掃描，并通過(guò)免疫熒光對(duì)AQP4 和β-淀粉樣蛋白染色。結(jié)果顯示隨著月齡增大，APP/PS1 和WT 小鼠均表現(xiàn)出CSF 流入信號(hào)強(qiáng)度均值先升高后降低；WT 組CSF流入信號(hào)強(qiáng)度均值6 月齡較4 月齡出現(xiàn)顯著降低。2 月齡和4 月齡WT 組CSF 流入信號(hào)強(qiáng)度均值高于APP/PS1組，而6月齡和8月齡APP/PS1組CSF流入信號(hào)強(qiáng)度均值高于WT 組，其中6 月齡增高幅度更大，8 月齡相差不明顯。同時(shí)本研究發(fā)現(xiàn)，隨月齡增長(zhǎng)，APP/PS1組腦淀粉樣蛋白的沉積速率呈現(xiàn)出緩慢到平穩(wěn)到加快趨勢(shì)。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)AQP4血管周極化程度隨年齡增大而降低，其中APP/PS1 組隨年齡增大，AQP4極化程度下降幅度更大，使得8月齡APP/PS1組AQP4 極化程度低于WT 組。且對(duì)AQP4 進(jìn)行藥理學(xué)抑制后，CSF流入信號(hào)強(qiáng)度均值降低。研究表明隨著年齡的增長(zhǎng)，大腦結(jié)構(gòu)的損傷速率并不均勻[22]，因此8月齡前等年齡間距的設(shè)計(jì)有助于確定疾病進(jìn)展最緩慢的階段，這對(duì)尋找早期治療的時(shí)間窗至關(guān)重要。

3.1 APP/PS1 組和WT 組對(duì)隨月齡增大對(duì)膠質(zhì)淋巴通路利用的改變

本研究發(fā)現(xiàn)在年輕小鼠（8 月齡前）中，APP/PS1 和WT 組均表現(xiàn)出CSF 流入信號(hào)強(qiáng)度均值先升高后降低，而APP/PS1 組CSF 流入信號(hào)強(qiáng)度均值的降低時(shí)間（6 月開始）較WT 組（4 月開始）晚，且CSF流入信號(hào)強(qiáng)度均值6月齡較4月齡在WT組出現(xiàn)顯著降低，而APP/PS1 組未出現(xiàn)顯著降低，使得APP/PS1組CSF的流入信號(hào)強(qiáng)度均值在4至6月齡保持較高水平，更有利于β-淀粉樣蛋白的清除，這與β-淀粉樣蛋白在4 至6 月齡間沉積速率最緩慢的現(xiàn)象相一致。我們推測(cè)出現(xiàn)這一現(xiàn)象的原因可能是年輕小鼠腦β-淀粉樣蛋白含量積累到一定程度，膠質(zhì)淋巴系統(tǒng)利用下降之前的代償階段示蹤劑CSF 流入信號(hào)強(qiáng)度均值較高，β-淀粉樣斑塊沉積較緩慢。此結(jié)果與KIM 等[23]近期研究互相佐證，腦淀粉樣血管?。–AA）不僅在老年（19～21月齡）小鼠中，而且在年輕（7～9月齡）的小鼠中都會(huì)加重血管周圍清除障礙；且示蹤劑CSF 流入量較高的區(qū)域是β-淀粉樣斑塊負(fù)荷最低的區(qū)域。因此，推測(cè)β-淀粉樣蛋白在此階段沉積速率緩慢可能也是腦自我調(diào)節(jié)代償?shù)慕Y(jié)果或原因：4 至6 月齡APP/PS1 小鼠β-淀粉樣蛋白的沉積量可以更好地激活腦膠質(zhì)淋巴清除途徑。

3.2 APP/PS1組和WT組小鼠對(duì)腦膠質(zhì)淋巴利用對(duì)比

本研究發(fā)現(xiàn)，與年齡匹配的WT 組相比，APP/PS1 組小鼠CSF 流入信號(hào)強(qiáng)度均值較低出現(xiàn)在2、4 月齡，這與BEN-NEJMA 等[17]提出的與對(duì)照組相比AD 組的GS 功能受損，尤其是CSF 流入減少一致。有趣的是，6月齡APP/PS1組，較年齡匹配的WT組小鼠CSF 流入信號(hào)強(qiáng)度均值更高。研究證實(shí)，腦動(dòng)脈的搏動(dòng)作為血管旁CSF-ISF 交換的驅(qū)動(dòng)力[24-26]，受其動(dòng)脈壁順應(yīng)性改變（老齡化）和血管周圍外部因素（如反應(yīng)性星形膠質(zhì)細(xì)胞增生等）[27]影響。8 月齡及以前的年輕小鼠，動(dòng)脈硬化發(fā)生概率較低，由此推測(cè)，6 月齡WT 組的CSF 流入減少，可能是由于星形膠質(zhì)細(xì)胞增生致動(dòng)脈壁順應(yīng)性降低所致。

3.3 AQP4在膠質(zhì)淋巴系統(tǒng)中的重要作用

腦膠質(zhì)淋巴系統(tǒng)作用通過(guò)星形細(xì)胞終足上AQP4通道的表達(dá)來(lái)促進(jìn)[28-30]。AQP4的存在可降低跨質(zhì)膜流體轉(zhuǎn)運(yùn)的驅(qū)動(dòng)力[31]。據(jù)報(bào)道，缺乏AQP4 的動(dòng)物CSF流入減少了70%，ISF溶質(zhì)清除減少了55%[32]。通過(guò)一種已被證明通過(guò)細(xì)胞內(nèi)泛素-蛋白酶體系統(tǒng)在體內(nèi)和體外抑制AQP4 的較為安全的小分子抑制劑-TGN-020[12,33]，對(duì)2月齡WT小鼠（其AQP4表達(dá)受年齡和基因型影響較小）進(jìn)行藥理學(xué)功能抑制。隨后，在本研究中觀察到AQP4抑制導(dǎo)致CSF流入信號(hào)強(qiáng)度均值減少。這與在不同模型中證明的星形膠質(zhì)細(xì)胞AQP4對(duì)腦膠質(zhì)淋巴系統(tǒng)至關(guān)重要[34-36]的結(jié)論相一致。此外，我們發(fā)現(xiàn)與2 月齡相比，8 月齡小鼠AQP4 極化程度下降，且在APP/PS1組中下降幅度更大，與年齡匹配的WT組相比，8月齡APP/PS1組小鼠AQP4極化程度降低。這與研究者發(fā)現(xiàn)的衰老導(dǎo)致AQP4失去足端極化[37]，且AD導(dǎo)致AQP4極化降低[38]相一致。進(jìn)一步驗(yàn)證了AQP4在AD中β-淀粉樣蛋白清除過(guò)程中的重要性。

3.4 本研究的局限性

本研究仍有局限性：首先，樣本量有限，結(jié)果的準(zhǔn)確性需進(jìn)一步驗(yàn)證，未來(lái)將在更大的樣本量下對(duì)轉(zhuǎn)基因小鼠進(jìn)行CSF流入量的定量分析；其次，未對(duì)組織病理學(xué)和行為學(xué)進(jìn)行更多的定量和統(tǒng)計(jì)學(xué)研究，以更準(zhǔn)確地解釋DCE-MRI中獲得的結(jié)果。

4 結(jié)論

本研究描述了腦膠質(zhì)淋巴CSF 流入量與年齡的關(guān)系，并表明早期膠質(zhì)淋巴利用的變化趨勢(shì)為先升高后降低，觀察到6 月時(shí)，膠質(zhì)淋巴功能增強(qiáng)可能會(huì)減緩β-淀粉樣蛋白在AD 轉(zhuǎn)基因小鼠腦中的積聚。因此，推測(cè)此階段可能作為治療AD 的窗口期。隨年齡增大，AQP4極化受損，以及藥物抑制AQP4后導(dǎo)致腦膠質(zhì)淋巴利用受損，提示AQP4水通道可能是調(diào)節(jié)該途徑的一個(gè)新的靶點(diǎn)，后續(xù)我們將深入研究驗(yàn)證。

作者利益沖突聲明：全體作者均聲明無(wú)利益沖突。

作者貢獻(xiàn)聲明：胡春洪設(shè)計(jì)本研究方案，對(duì)稿件重要內(nèi)容做批評(píng)性審閱、修改，獲得了江蘇省重點(diǎn)醫(yī)學(xué)學(xué)科項(xiàng)目資助；蘇云燕參與選題與設(shè)計(jì)，對(duì)稿件重要方面進(jìn)行了關(guān)鍵修改，獲得了江蘇省青年科技人才托舉工程項(xiàng)目資助；江心雨起草和撰寫稿件，獲取、分析和解釋本研究數(shù)據(jù)；張龍江獲取本研究數(shù)據(jù)，并對(duì)稿件重要內(nèi)容進(jìn)行修改；全體作者都同意發(fā)表最后的修改稿，同意對(duì)本研究的所有方面負(fù)責(zé)，確保本研究的準(zhǔn)確性和誠(chéng)信。