楊雅雯，夏敏，宋夢(mèng)星，馬占龍

作者單位 南京醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院（江蘇省人民醫(yī)院）放射科，南京 210029

0 引言

動(dòng)脈粥樣硬化（atherosclerosis, AS）斑塊破裂是心肌梗死和中風(fēng)的主要原因[1-4]。斑塊的不穩(wěn)定性主要與斑塊中的炎癥反應(yīng)、新生血管生成、出血、薄的纖維帽及鈣化等有關(guān)，其中最主要的是炎癥反應(yīng)和新生血管[5]。隨著現(xiàn)代醫(yī)學(xué)發(fā)展，AS 的診治水平明顯提高，但是識(shí)別不穩(wěn)定斑塊仍是臨床工作的一大挑戰(zhàn)[6]。研究發(fā)現(xiàn)，過(guò)度激活的RhoA/Rho 激酶（Rho-kinase, ROCK）通路是促進(jìn)斑塊不穩(wěn)定的重要因素。

ROCK 是小G 蛋白家族RhoA 的下游效應(yīng)器，也是一種絲/蘇氨酸激酶，通過(guò)磷酸化下游分子發(fā)揮調(diào)節(jié)作用[7]。ROCK 尤其存在血液循環(huán)中的炎癥細(xì)胞和血管平滑肌細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)內(nèi)[8]，靜息狀態(tài)下，形成自動(dòng)抑制環(huán)，不發(fā)揮生物學(xué)作用[9]。血液循環(huán)中氧化低密度脂蛋白[10]、溶血磷脂酸[11]、凝血酶[12]等可激活內(nèi)皮細(xì)胞中的RhoA/ROCK，高活性ROCK 磷酸化下游分子，導(dǎo)致內(nèi)皮炎性因子釋放及炎細(xì)胞浸潤(rùn)[13]，促進(jìn)斑塊不穩(wěn)定。ROCK被激活后，促進(jìn)中膜平滑肌細(xì)胞向內(nèi)膜增殖遷移、表型轉(zhuǎn)化以及維持高收縮力[14]，導(dǎo)致斑塊進(jìn)展、血管重構(gòu)及血管收縮痙攣。血管重構(gòu)會(huì)增加血管壁張力，血管收縮痙攣誘導(dǎo)斑塊爆破樣破裂，導(dǎo)致心絞痛甚至心肌梗死[15-16]。總之，過(guò)度激活的ROCK 會(huì)加劇斑塊的不穩(wěn)定性，誘發(fā)不良心腦血管事件。ROCK 是AS 負(fù)荷和急性冠脈綜合征的潛在生物標(biāo)志物[17]，是合適的監(jiān)測(cè)靶點(diǎn)。

分子影像學(xué)可無(wú)創(chuàng)性監(jiān)測(cè)細(xì)胞和蛋白質(zhì)水平的病變。對(duì)不穩(wěn)定斑塊的特征（炎癥、新生血管、出血鈣化等）進(jìn)行分子成像可實(shí)現(xiàn)在體無(wú)創(chuàng)監(jiān)測(cè)量化。目前已經(jīng)開(kāi)發(fā)出p-選擇素和黏附因子VCAM-1 的雙靶點(diǎn)探針[18]、CD40 雙模態(tài)探針[19]、profilin-1 抗體納米探針[20]和VEGFR2 的靶向轉(zhuǎn)換納米探針[21]用于斑塊中的炎癥反應(yīng)，血管平滑肌細(xì)胞和新生血管的MRI，并取得預(yù)期結(jié)果。MRI 無(wú)電離輻射、多參數(shù)多序列成像及較高的軟組織分辨率等，已成為一種理想的影像檢查技術(shù)。超小超順磁性氧化鐵納米粒子是有效的磁共振T2成像陰性對(duì)比劑，常用于AS斑塊和腫瘤成像。

關(guān)于靶向ROCK 的分子影像學(xué)研究尚未見(jiàn)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)旨在探索斑塊中ROCK1 的表達(dá)，制備ROCK1 靶向納米探針，探索MRI 可視化AS 斑塊的可行性。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

實(shí)驗(yàn)組為載脂蛋白E 基因敲除（Apolipoprotein-Edeficient, ApoE-/-）雄性鼠（n=60）（北京維通利華動(dòng)物技術(shù)有限公司），高脂飲食（含3%膽固醇和20%脂肪）（南京協(xié)同生物技術(shù)有限公司）。對(duì)照組為C57BL/6雄性鼠（n=20）（南京醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心），普通飲食。兩組小鼠置于相同的飼養(yǎng)環(huán)境。本研究獲得南京醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物福利倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（實(shí)驗(yàn)倫理編號(hào)：IACUC1909029-1）。

1.2 合成納米探針

稱(chēng)取150 mg DSPE-MPEG2000、50 mg DSPE-PEG 2000-COOH，充分溶解于4 mL 三氯甲烷中。加鐵含量為10 mg 的20 nm 油酸修飾的Fe3O4納米顆粒，超聲充分混合；加4 mL 去離子水，超聲充分混合。在70 ℃水浴鍋中旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)10 min，充分除去三氯甲烷，得到透亮的Fe3O4@PEG納米顆粒水溶液。過(guò)220 nm濾膜除去團(tuán)聚體。取360 μL的Fe3O4@PEG納米顆粒水溶液，加96 μL ROCK1 抗體及2 mL MES 溶液，混合均勻。搖床150 rpm 4 ℃ 30 min，加200 μL 乙基碳二亞胺鹽，搖床150 rpm 4℃ 4.5 h。將反應(yīng)好的溶液加入超濾管，放入離心機(jī)（4000 rpm，8 min）除去未結(jié)合抗體，獲得Fe3O4@PEG-ROCK1靶向探針溶液。

1.3 表征及體外成像納米探針

透射電子顯微鏡（Jem-2100F，Jeol）觀察納米粒子的形態(tài)分布。納米粒度電位儀（Nano ZS90，Malvern）測(cè)量?jī)芍軆?nèi)Zeta 電位和水合粒徑尺寸。振動(dòng)樣品磁強(qiáng)計(jì)（Lakeshore7407，美國(guó)Lakeshore 公司）獲得飽和磁化強(qiáng)度。紫外分光光度計(jì)（UV，3600 Shimadzu，日本島津制作所）測(cè)量探針的紫外吸收波譜。

用7.0 T 磁共振掃描儀（Bruker，德國(guó)）測(cè)量Fe3O4@PEG-ROCK1的弛豫性能。將Fe3O4@PEG-ROCK1配制成等體積不同鐵濃度的溶液，等量純水作為對(duì)照，獲得T1 mapping、T2 mapping 值。鐵濃度為橫坐標(biāo)，R1（R1=1/T1）、R2（R2=1/T2）為縱坐標(biāo)，計(jì)算出曲線斜率r1、r2。采用T2-PDWI序列獲得相應(yīng)的加權(quán)圖像。掃描序列與相應(yīng)參數(shù)：T1 mapping，TR 800 ms，TE 11 ms，F(xiàn)OV 2 cm×2 cm，矩陣256×256，翻轉(zhuǎn)角1=90°，翻轉(zhuǎn)角2=180°，層厚0.5 mm；T2 mapping，TR 2500 ms，TE 22 ms，F(xiàn)OV 2 cm×2 cm，矩陣256×256，翻轉(zhuǎn)角1=90°，翻轉(zhuǎn)角2=180°，層厚0.5 mm；T2-PDWI，TR 2500 ms，TE 65、13 ms，F(xiàn)OV 2 cm×2 cm，矩陣256×256，翻轉(zhuǎn)角1=90°，翻轉(zhuǎn)角2=180°，層厚0.5 mm。

1.4 免疫活性和細(xì)胞實(shí)驗(yàn)

使用小鼠ROCK-1 抗體酶聯(lián)免疫分析試劑盒（YJ581147，上海，中國(guó)）檢測(cè)Fe3O4@PEG-ROCK1 免疫活性。設(shè)置四組，即純抗體（n=3）、靶向探針（n=3）、非偶聯(lián)探針（n=3）、煮沸后的靶向探針（n=3）。制作標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品中抗體濃度。

采用MTT 比色法檢測(cè)Fe3O4@PEG-ROCK1 探針的細(xì)胞毒性。使用細(xì)胞為鼠源性巨噬細(xì)胞RAW264.7 細(xì)胞。探針濃度梯度為3.13、6.25、12.50、25.00、50.00、100.00 μg/mL。每組設(shè)置6個(gè)復(fù)孔。

采用普魯士藍(lán)染色觀察RAW264.7細(xì)胞對(duì)探針的攝取。取兩皿生長(zhǎng)狀態(tài)及密度相同的RAW264.7 細(xì)胞，分別加入等量 Fe3O4@PEG-ROCK1與Fe3O4@PEG的培養(yǎng)基，孵育24 h 后行普魯士藍(lán)染色，光學(xué)顯微鏡（eclipse Ci-e，日本尼康）觀察細(xì)胞結(jié)合情況。

1.5 動(dòng)脈粥樣硬化中ROCK1表達(dá)和活性

在第10、16、22、28、34周，隨機(jī)挑選ApoE-/-鼠（n=5），測(cè)量小鼠體質(zhì)量及制備腹主動(dòng)脈ROCK1 免疫染色切片。使用Image J 軟件測(cè)量斑塊中ROCK1 表達(dá)的平均光密度。蛋白印跡檢測(cè)主動(dòng)脈ROCK1 活性。Rho 激酶主要磷酸化肌球蛋白磷酸酶靶亞基1（Myosin phosphatase target subunit 1, MYPT1）為p-MYPT1[19]，因此兩者比值代表Rho 激酶的相對(duì)活性，計(jì)算公式：Rho 激酶的相對(duì)活性=p-MYPT1 蛋白表達(dá)量/MYPT1 蛋白表達(dá)量。方法如下：選取喂養(yǎng)34 周的ApoE-/-鼠（n=5）和C57BL/6 鼠（n=5），過(guò)量麻醉處死，取出腹主動(dòng)脈（長(zhǎng)約1.5 cm），通過(guò)蛋白印跡檢測(cè)MYPT1（22117-1-AP，Proteintech Group，武漢，中國(guó)）和p-MYPT1（AF5445，Affinity Biosciences，美國(guó)）蛋白的表達(dá)。

1.6 體內(nèi)MRI

34 周的ApoE-/-鼠分兩組，組1 尾靜脈注射Fe3O4@PEG（n=10），組2注射尾靜脈注射Fe3O4@PEGROCK1（n=10）。劑量為10 mg/kg。注射納米探針前及注射后8、16 h分別進(jìn)行掃描。使用7.0 T磁共振掃描儀直徑為38 mm 單通道容積線圈。雙回波T2-PDWI 序列參數(shù)：TR 2500 ms，TE 65、13 ms，F(xiàn)OV 2 cm×2 cm，矩陣256×256，翻轉(zhuǎn)角1=90°，翻轉(zhuǎn)角2=180°，層厚0.5 mm，層間距為0 mm，掃描時(shí)間30 min。最后一次掃描結(jié)束后安樂(lè)死處死小鼠，取出腹主動(dòng)脈標(biāo)本。

使用Image J軟件測(cè)量斑塊信號(hào)強(qiáng)度。平掃時(shí)動(dòng)脈壁中最高的信號(hào)被指定為斑塊。在平掃、8 h、16 h圖像的相同層面的相同位置勾畫(huà)相同大小的感興趣區(qū)域，測(cè)出信號(hào)強(qiáng)度。使用對(duì)比噪聲比表示相對(duì)信號(hào)強(qiáng)度。對(duì)比噪聲比=（斑塊組織中動(dòng)脈壁信號(hào)-血液信號(hào)）/噪聲。噪聲由背景空氣中像素強(qiáng)度的標(biāo)準(zhǔn)偏差表示[22]。

1.7 組織化學(xué)

將腹主動(dòng)脈標(biāo)本進(jìn)行石蠟包埋切片（4 μm）。免疫染色用于定位ROCK1 蛋白，普魯士藍(lán)染色用于氧化鐵顆粒（納米磁性顆粒）可視化。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

所有數(shù)據(jù)均使用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。使用SPSS 27.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，使用GraphPad Prism 9軟件繪制統(tǒng)計(jì)圖。樣本量根據(jù)既往課題組經(jīng)驗(yàn)及文獻(xiàn)搜索確定。符合正態(tài)分布的數(shù)據(jù)進(jìn)行參數(shù)檢驗(yàn)，兩組間的比較使用獨(dú)立樣本或配對(duì)樣本t檢驗(yàn)，多組間的比較使用ANOVA 檢驗(yàn)，不符合正態(tài)分布的數(shù)據(jù)使用非參數(shù)檢驗(yàn)，兩組間的比較使用Mann-WhitneyU檢驗(yàn)，多組分析使用Kruskal-Wallis 檢驗(yàn)。P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 納米探針的表征

電鏡圖像顯示Fe3O4@PEG和Fe3O4@PEG-ROCK1為黑色球形顆粒，均勻穩(wěn)定地分散在溶液中，無(wú)團(tuán)聚（圖1A～1B）。兩周內(nèi)Fe3O4@PEG和Fe3O4@PEG-ROCK1的粒徑和峰值Zeta 電位保持穩(wěn)定，且兩者差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[粒徑（27.06±1.52） nm vs.（30.52±2.95） nm，U=3.000，P=0.015；電位（-35.18±0.31） mV vs.（-16.60±3.26） mV，U=0.000，P=0.002]（圖1C～1D）。Fe3O4@PEG紫外吸收峰為225 nm，連接ROCK1抗體后Fe3O4@PEG-ROCK1 紫外吸收峰為253 nm（圖1E），以上這些數(shù)據(jù)表明ROCK1 抗體與Fe3O4@PEG成功偶聯(lián)，保持良好穩(wěn)定性。

圖1 Fe3O4@PEG 納米顆粒（1A）和Fe3O4@PEG-ROCK1納米顆粒（1B）的電鏡圖像，比例：20 nm。兩周內(nèi)測(cè)定Fe3O4@PEG 和Fe3O4@PEG-ROCK1的水合粒徑（1C）、Zeta電位（1D），及紫外吸光度（1E）。ROCK：Rho相關(guān)激酶。Fig.1 The scanning electron micrographs of Fe3O4@PEG nanoparticles (1A) and Fe3O4@PEG-ROCK1 nanoparticles (1B), scale: 20 nm.The hydrated particle size (1C), Zeta potential (1D), and ultraviolet absorbance (1E) of Fe3O4@PEG and Fe3O4@PEG-ROCK1 are measured within two weeks.ROCK: Rho-kinase.

2.2 免疫活性和細(xì)胞實(shí)驗(yàn)

巨噬細(xì)胞吞噬實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，F(xiàn)e3O4@PEG-ROCK1組細(xì)胞內(nèi)可見(jiàn)少量藍(lán)色氧化鐵顆粒，而Fe3O4@PEG組細(xì)胞內(nèi)見(jiàn)大量藍(lán)色氧化鐵顆粒。說(shuō)明靶向探針Fe3O4@PEG-ROCK1 較Fe3O4@PEG 可以降低巨噬細(xì)胞內(nèi)吞作用（圖2A～2B）。

圖2 巨噬細(xì)胞吞噬實(shí)驗(yàn)。2A、2B 分別為Fe3O4@PEG、Fe3O4@PEG-ROCK1 與巨噬細(xì)胞共孵育后行普魯士藍(lán)染色，藍(lán)染顆粒為鐵納米，比例：100 μm；2C 為不同鐵濃度下Fe3O4@PEG-ROCK1的細(xì)胞存活率；2D為Fe3O4@PEG-ROCK1納米顆粒的免疫活性。*表示P＜0.05。Fig.2 Macrophage phagocytosis test.Fe3O4@PEG (2A) and Fe3O4@PEG-ROCK1 (2B) are incubated with macrophages and performed prussian blue staining, the blue particles are iron nanoparticles, scale: 100 μm.2C is cell viability of different iron concentrations of Fe3O4@PEG-ROCK1.2D is the immunological activity of Fe3O4@PEG-ROCK1.*denotes P＜0.05.

細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)顯示，一定鐵濃度范圍內(nèi)，細(xì)胞存活率在80%以上，表明靶向探針在一定的濃度內(nèi)無(wú)毒性（圖2C）。

酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)顯示，各組免疫活性如下：純抗體組（n=3）0.54±0.01，F(xiàn)e3O4@PEG-ROCK1 組（n=3）0.52±0.02，煮沸Fe3O4@PEG-ROCK1 組（n=3）0.27±0.00，F(xiàn)e3O4@PEG 組（n=3）0.24±0.01。純抗體組與靶向探針的免疫活性差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（H=1.667，P=0.571）,靶向探針與非靶向探針的免疫活性差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（H=6.667，P=0.024），以上結(jié)果證明ROCK1 抗體與Fe3O4@PEG 偶聯(lián)后，仍保持抗體活性（圖2D）。

2.3 體外MRI

Fe3O4@PEG-ROCK1 的 r1=0.364 mM-1s-1，r2=162.271 mM-1s-1，r2/r1=446，表明靶向探針可以顯著縮短T2弛豫時(shí)間，具有良好的T2弛豫性能。T2-PDWI圖像顯示，隨著鐵濃度的增加，溶液信號(hào)強(qiáng)度逐漸減低，對(duì)比明顯（圖3A～3B）。靶向探針的飽和磁化強(qiáng)度為0.086 8 T，磁化曲線過(guò)原點(diǎn)，說(shuō)明探針具有超順磁性（圖3C）。這些結(jié)果表明Fe3O4@PEG-ROCK1 是良好的磁共振陰性對(duì)比劑。

圖3 MRI 等體積不同鐵濃度的Fe3O4@PEG-ROCK1 的圖像（3A）、Fe3O4@PEG-ROCK1 弛豫曲線（3B）、Fe3O4@PEG-ROCK1磁化曲線（3C）。Fig.3 MRI are performed on equal volumes of Fe3O4@PEG-ROCK1 with different iron concentrations (3A), the relaxation curve of Fe3O4@PEG-ROCK1(3B) and the magnetization curve of Fe3O4@PEG-ROCK1 (3C).

2.4 動(dòng)脈粥樣硬化中的ROCK1的表達(dá)和活性

APOE-/-鼠體質(zhì)量明顯增加，明顯高于C57BL/6健康鼠，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[（31.54±0.46） g vs.（28.89±0.44） g，U=0.000，P＜0.001](圖4)。ROCK1 免疫染色顯示，隨著斑塊增大，ROCK1的陽(yáng)性表達(dá)區(qū)也增大，主要分布在斑塊的肩部、內(nèi)膜下及壞死炎癥區(qū)（圖5B～5E）。皮爾遜相關(guān)性分析（圖5A）顯示ROCK1 的表達(dá)與斑塊面積呈正相關(guān)（n=30）（r=0.959，P＜0.001）。蛋白印跡（圖6A～6B）顯示，晚期AS 小鼠血管組織（n=10）中ROCK1活性明顯高于健康鼠（n=10）（0.30±0.02 vs.0.24±0.02，U=1.000，P＜0.001）。以上這些數(shù)據(jù)表示隨著AS進(jìn)展，ROCK1蛋白的表達(dá)量及活性增加。

圖4 不同周齡ApoE-/-小鼠和C57BL/6鼠的體質(zhì)量（g）。圖5 斑塊中ROCK1陽(yáng)性表達(dá)面積對(duì)應(yīng)的平均光密度值（5A）及不同周齡ApoE-/-小鼠腹主動(dòng)脈斑塊切片的ROCK1免疫染色（圖5B～5E）。5B～5E對(duì)應(yīng)16、22、28、32周，比例：100 μm。Fig.4 Weight of ApoE-/- mice and C57BL/6 mice at different weeks (g).Fig.5 Mean optical density values of ROCK1 expression in plaques (5A) and ROCK1 immunohistochemical images of abdominal aorta of ApoE-/- mice at different weeks (5B-5E).5B-5E correspond to 16、22、28 and 32 weeks, respectively.Scale: 100 μm.

圖6 蛋白印跡及其統(tǒng)計(jì)圖。6A：ApoE-/-鼠和健康C57BL/6鼠的主動(dòng)脈ROCK1活性的蛋白印跡圖。C4～C5：C57BL/6鼠，M11～M13：ApoE-/-鼠；6B：蛋白印跡測(cè)得的P-MYPT1/MYPT1 的統(tǒng)計(jì)圖，p-MYPT1/MYPT1 表示ROCK1活性。***表示P＜0.001。MYPT1：肌球蛋白磷酸酶靶亞基1。Fig.6 Western blots and their statistical plots.6A: Western blot of ROCK1 activity in ApoE-/- mice and C57BL/5 mice.C4-C5: C57BL/6 mice, M11-M13: ApoE-/- mice; 6B: Statistical plot of P-MYPT1/MYPT1 measured by western blot.P-MYPT1/MYPT1 indicates ROCK1 activity.*** indicates P＜0.001.MYPT1: myosin phosphatase target subunit 1.

2.5 體內(nèi)MRI和組織學(xué)結(jié)果

如圖7～圖9 所示，注射納米探針前，F(xiàn)e3O4@PEG組（n=10）和Fe3O4@PEG-ROCK1 組（n=10）小鼠斑塊信號(hào)強(qiáng)度差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（8.25±1.39 vs.7.81±3.22，t=-1.680，P=0.099）。注射納米探針后，兩組斑塊信號(hào)強(qiáng)度均下降，與Fe3O4@PEG 組（n=10）相比，F(xiàn)e3O4@PEG-ROCK1 組（n=10）斑塊信號(hào)降低更明顯（8 h，5.37±1.79 vs.3.91±2.26，U=392.000，P=0.001）（16 h，6.68±2.39 vs.4.61±2.80，U=463.000，P=0.001），8 h 最明顯，斑塊內(nèi)可見(jiàn)片狀信號(hào)丟失區(qū)域。普魯士藍(lán)染色顯示斑塊內(nèi)有藍(lán)色鐵顆粒沉積，F(xiàn)e3O4@PEG-ROCK1組（n=10）多于Fe3O4@PEG組（n=10）（0.54±0.02 vs.0.34±0.01，U=36.000，P=0.002），且主要分布斑塊的內(nèi)膜下和壞死區(qū)域。免疫組化主要用于蛋白的定位，ROCK1表達(dá)陽(yáng)性區(qū)域與普魯士藍(lán)中的探針沉積區(qū)域?qū)?yīng)。

圖7 兩組小鼠注射Fe3O4@PEG 和Fe3O4@PEG-ROCK1的磁共振圖像。Fig.7 Magnetic resonance images of mice injected with Fe3O4@PEG and Fe3O4@PEG-ROCK1.

圖8 兩組的普魯士藍(lán)染色圖和免疫組化圖。圖9 兩組小鼠的斑塊信號(hào)強(qiáng)度的統(tǒng)計(jì)圖（9A）及斑塊中普魯士藍(lán)沉積量（9B）。**P＜0.01。Fig.8 Prussian blue staining and immunohistochemical staining of the two groups of specimens.Fig.9 Plaque signal intensity (9A) and prussian blue deposition in the plaques (9B) of the two groups of mice.**P＜0.01.

3 討論

本實(shí)驗(yàn)首先建立AS 模型小鼠，采用免疫組化及蛋白印跡分析ROCK1 在斑塊中的表達(dá)及活性。其次制備及表征Fe3O4@PEG-ROCK1。最后將Fe3O4@PEG-ROCK1用于AS斑塊的可視化MRI。關(guān)于ROCK 作用的研究主要在細(xì)胞水平，本研究發(fā)現(xiàn)ROCK1 在斑塊中高表達(dá)和高活性，證明靶向探針聯(lián)合MRI實(shí)現(xiàn)在體檢測(cè)斑塊中ROCK1活性可行。

3.1 選擇ROCK1作為成像靶點(diǎn)

大量研究表明，ROCK活性增高會(huì)引起血管收縮痙攣、促炎因子釋放、炎癥細(xì)胞募集，加重炎癥反應(yīng)，加劇斑塊的不穩(wěn)定性[23]。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，ROCK1 在AS中呈高表達(dá)及高活性，在斑塊中主要分布在內(nèi)膜下、肩部和壞死區(qū)域，與ROCK1 在斑塊中的促炎癥壞死作用有關(guān)。GAO 等[24]證明ROCK 活性增高會(huì)導(dǎo)致內(nèi)皮功能障礙、加劇炎癥反應(yīng)。CHEN 等[25]的一項(xiàng)頸動(dòng)脈斑塊基因研究表明，與炎癥和免疫反應(yīng)相關(guān)的中心基因是Rho GTP 酶激活蛋白。既往研究表明，ROCK 基因缺陷小鼠心血管疾病發(fā)病率減少[26]，靶向抑制ROCK表現(xiàn)出一定的治療效果[27]，提示ROCK是AS的潛在治療靶點(diǎn)，也是合適的成像靶點(diǎn)。

3.2 評(píng)價(jià)Fe3O4@PEG-ROCK1 作為靶向探針和陰性對(duì)比劑

MRI 陰性對(duì)比劑一般以超順磁性氧化鐵物質(zhì)為主，能縮短組織的T2 弛豫時(shí)間，減低信號(hào)[28]。本研究在USPIO表面修飾油酸和PEG，能增加穩(wěn)定性和延長(zhǎng)體內(nèi)循環(huán)時(shí)間[29]。Fe3O4@PEG 與ROCK1 抗體偶聯(lián)，制成功能化探針Fe3O4@PEG-ROCK1，使其定向結(jié)合ROCK1 分子，增加目標(biāo)區(qū)域結(jié)合量。這與既往研究中靶向探針制備方法類(lèi)似[30]。巨噬細(xì)胞的內(nèi)吞作用是營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)清除、免疫監(jiān)視和治療藥物遞送的關(guān)鍵調(diào)節(jié)途徑，可影響納米探針的穩(wěn)定性及靶向成像效果。本實(shí)驗(yàn)中，巨噬細(xì)胞對(duì)Fe3O4@PEG-ROCK1的攝取遠(yuǎn)低于Fe3O4@PEG，說(shuō)明Fe3O4@PEG-ROCK1可下調(diào)巨噬細(xì)胞的吞噬清除，進(jìn)而更好地結(jié)合靶點(diǎn)，發(fā)揮成像作用。但是WEN等[31]制備的氧化低密度脂蛋白的靶向探針被泡沫細(xì)胞大量吞噬，QIU 等[28]制備的黏附因子的靶向探針被巨噬細(xì)胞大量吞噬，可能是靶向分子在細(xì)胞中分布不同。黏附因子和氧化低密度脂蛋白分別在巨噬細(xì)胞和泡沫細(xì)胞中大量表達(dá)，而ROCK與體內(nèi)多種細(xì)胞作用發(fā)揮調(diào)控功能。

生物相容性是納米探針應(yīng)用臨床的重要參數(shù)[32]。Fe3O4@PEG-ROCK1穩(wěn)定性良好，兩周之內(nèi)粒徑尺寸和電位無(wú)明顯波動(dòng)，電鏡圖顯示分布均勻，無(wú)團(tuán)聚。ROCK1 抗體連接到Fe3O4@PEG 表面仍保持免疫活性。細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)顯示一定鐵濃度范圍內(nèi)Fe3O4@PEG-ROCK1 的細(xì)胞存活率在80% 以上。Fe3O4@PEG-ROCK1 的弛豫值為162.3 mM-1s-1，優(yōu)于目前大部分的磁性材料[29]，是良好的分子探針和MRI對(duì)比劑。

3.3 評(píng)價(jià)Fe3O4@PEG和Fe3O4@PEG-ROCK1體內(nèi)成像

Fe3O4@PEG 無(wú)特異性，在斑塊中的沉積量取決于巨噬細(xì)胞的非特異性吞噬[29]，磁共振信號(hào)改變反映斑塊中的炎癥反應(yīng)。而Fe3O4@PEG-ROCK1 定向結(jié)合斑塊及血管壁中的ROCK1 分子，信號(hào)改變反映ROCK1 含量，鑒于ROCK1 在AS 發(fā)生發(fā)展以及預(yù)后中的重要作用，靶向ROCK1 成像有利于ROCK1 活性的精準(zhǔn)體外監(jiān)測(cè)。相關(guān)研究表明靶向探針在目標(biāo)區(qū)域的沉積量可以達(dá)到四倍[33-34]。本實(shí)驗(yàn)中，對(duì)比8、16 h斑塊信號(hào)，F(xiàn)e3O4@PEG-ROCK1組較Fe3O4@PEG組信號(hào)下降更明顯，說(shuō)明Fe3O4@PEG-ROCK1在斑塊及血管壁中沉積量更多。Fe3O4@PEG 組斑塊信號(hào)在16 h 時(shí)增加，可能是Fe3O4@PEG 在體內(nèi)被巨噬細(xì)胞快速地非特異性地吞噬代謝，繼而導(dǎo)致斑塊信號(hào)的快速變化。WU 等[35]研究表明小鼠巨噬細(xì)胞Fe3O4-NPs 的攝取在8 h 達(dá)到最大值，在12～24 h 內(nèi)細(xì)胞內(nèi)含量下降，可能與細(xì)胞的胞吐作用有關(guān)。

3.4 斑塊ROCK1分子靶向MRI的臨床價(jià)值

本研究是第一項(xiàng)針對(duì)ROCK1 的分子影像學(xué)研究，證明了在體監(jiān)測(cè)斑塊的 ROCK1 活性的可行性。這有助于識(shí)別不穩(wěn)定斑塊、評(píng)估斑塊生物學(xué)特性，有利于實(shí)現(xiàn)高危斑塊的早期識(shí)別及危險(xiǎn)事件的早期預(yù)防診治。不穩(wěn)定斑塊與薄纖維帽、大的脂質(zhì)核心、炎癥反應(yīng)、新生血管、鈣化等相關(guān)[5]。既往類(lèi)似研究靶向特異性分子反映不穩(wěn)定斑塊某一方面，如血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子在維持和調(diào)控血管的形成及血管新生等生理過(guò)程發(fā)揮重要作用，相關(guān)的靶向磁共振信號(hào)改變反映新血管生成的情況[21]。P-選擇素和黏附因子是參與內(nèi)皮細(xì)胞介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)過(guò)程的重要因子，信號(hào)改變反映斑塊炎癥活性[18]。ROCK 與不穩(wěn)定斑塊的因素密切相關(guān)，靶向ROCK 成像更能反映斑塊的綜合信息。

3.5 研究的局限性

本實(shí)驗(yàn)研究還需進(jìn)一步完善：第一，實(shí)驗(yàn)所用的樣本量較少，可能導(dǎo)致結(jié)果可靠性下降，應(yīng)擴(kuò)大實(shí)驗(yàn)樣本量進(jìn)行下一步驗(yàn)證；第二，沒(méi)有研究ROCK 抑制劑的治療作用以及相關(guān)MRI，補(bǔ)充這一部分能進(jìn)一步驗(yàn)證本文的研究結(jié)果且對(duì)靶向探針的臨床應(yīng)用有更直觀的展示；第三，靶向探針在體內(nèi)循環(huán)時(shí)間更長(zhǎng)可能會(huì)產(chǎn)生毒性及進(jìn)一步改善探針的生物相容性和降低毒性。

4 結(jié)論

本研究構(gòu)建靶向探針Fe3O4@PEG-ROCK1，該探針?lè)€(wěn)定性好，特異性強(qiáng)，保持良好生物活性和磁敏感性。Fe3O4@PEG-ROCK1 可在體監(jiān)測(cè)斑塊中ROCK1 的表達(dá)，有利于高危斑塊的風(fēng)險(xiǎn)預(yù)測(cè)和無(wú)創(chuàng)監(jiān)測(cè)。

作者利益沖突聲明：全體作者均聲明無(wú)利益沖突。

作者貢獻(xiàn)聲明：楊雅雯構(gòu)思設(shè)計(jì)本研究的方案，起草和撰寫(xiě)稿件，獲取、分析和解釋本研究的數(shù)據(jù)；馬占龍構(gòu)思設(shè)計(jì)本研究的方案，對(duì)稿件的重要內(nèi)容進(jìn)行修改，獲得國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目的資助；夏敏、宋夢(mèng)星構(gòu)思設(shè)計(jì)本研究的方案，獲取、分析本研究的數(shù)據(jù)，對(duì)稿件重要內(nèi)容進(jìn)行修改。全體作者都同意最后的修改稿，同意對(duì)本研究的所有方面負(fù)責(zé)，確保本研究的準(zhǔn)確性和誠(chéng)信。