0 引言

獼猴桃（ActinidiachinensisPlanch.）屬于落葉藤本植物，原產(chǎn)于我國長江中下游地區(qū)。我國是世界弼猴桃生產(chǎn)大國，而貴州省地處我國弼猴桃屬植物最集中分布的西南地區(qū)腹地，是全國弼猴桃生產(chǎn)的特色優(yōu)勢區(qū)域1]。經(jīng)過多年發(fā)展，貴州省弼猴桃種植面積已超過3.49萬 ，躍居全國第三[2]。然而，由于極端天氣頻發(fā)和種植品種單一，弼猴桃在生產(chǎn)過程中常常面臨著多種病害威脅，其中弼猴桃葉斑病危害最為嚴重，給弼猴桃產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展帶來了巨大挑戰(zhàn)[3]。該病害導(dǎo)致弼猴桃葉片出現(xiàn)斑點或斑塊，受感染的葉片易褪綠變黃、皺縮枯萎，使植株光合作用和營養(yǎng)吸收能力降低，造成果實產(chǎn)量和品質(zhì)嚴重下降[4]。引起獼猴桃葉斑病的病原菌種類復(fù)雜，包括弼猴桃假尾孢菌、可可毛色二孢菌，以及鏈格孢、多主棒孢和莖點霉屬等多種真菌[5]。

目前，對弼猴桃葉斑病的主要防治方法以化學(xué)藥劑防治為主。因此，篩選高效、低毒、低殘留的化學(xué)藥劑用于弼猴桃葉斑病的防治，對保障弼猴桃產(chǎn)業(yè)健康可持續(xù)發(fā)展意義重大[6。研究通過組織分離法獲取1株弼猴桃葉斑病菌，根據(jù)形態(tài)學(xué)觀察和系統(tǒng)發(fā)育分析對其進行鑒定，并通過室內(nèi)毒力測定，篩選有效防控該病原菌的藥劑，以期為弼猴桃葉斑病的科學(xué)防控提供參考依據(jù)。

1試驗材料與方法

1.1 試驗材料

2023年6月，在貴州省黔東南凱里市下司鎮(zhèn)花橋村重蔭坡弼猴桃園 采集“紅陽”品種具有典型葉斑病癥狀的病葉8片，帶回貴州大學(xué)農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全實驗室進行病原菌的分離純化。

供試藥劑包括 80% 戊唑醇水分散性粒劑（陜西美邦藥業(yè)集團股份有限公司）， 10% 苯醚甲環(huán)唑水分散性粒劑（河北興柏農(nóng)業(yè)科技股份有限公司），25% 咪鮮胺乳油（江蘇輝豐生物農(nóng)業(yè)股份有限公司）， 70% 代森聯(lián)可濕性粉劑（巴斯夫歐洲公司），25% 嘧菌酯懸浮劑（先正達南通作物保護有限公司）， 70% 丙森鋅可濕性粉劑（德國拜耳作物科學(xué)公司）。

1.2 研究方法

1.2.1 病原菌的分離與純化

采用組織分離法對病原菌進行分離培養(yǎng)。在無菌超凈臺上，用無菌接種刀切取病原交界處的組織塊，根據(jù)TAN等的研究方法進行分離純化直至獲得單一形態(tài)的菌落。

1.2.2 病原菌的致病性測定

參照郭睿文等8的方法，用菌塊分別對健康的離體和活體弼猴桃葉片進行接種，以檢測病原菌的致病性，完成柯赫氏法則檢測。

1.2.3 病原菌的形態(tài)學(xué)鑒定

用接種針挑取菌落邊緣的菌絲制片，通過光學(xué)顯微鏡（LEICADM500）觀察分離菌株的菌絲和分生孢子的形態(tài)、大小、顏色等特征，并結(jié)合相關(guān)文獻初步確定病原菌所屬類群。

1.2.4病原菌的分子生物學(xué)鑒定

按照真菌DNA提取試劑盒（Biomiga）說明書提取病原菌基因組DNA，并用通用引物ITS、Alta1（F：5'-ATGCAGTTCACCACCATCGC-3'，R：5'-ACGAGGGTGAYGTAGGCGTC-3'）和GAPDH（F：5'-CAACGGCTTCGGTCGCATTG-3'，R：5'-GCCAAGCAGTTGGTTGTGC-3'進行PCR擴增。由北京擎科生物科技有限公司對擴增產(chǎn)物進行測序。然后，將所得序列在GenBank數(shù)據(jù)庫中進行比對，并利用MEGA11軟件采用最大似然法（ML）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹[10]

1.2.5 病原菌的室內(nèi)毒力測定

采用菌絲生長速率法測定6種殺菌劑對病原菌的室內(nèi)毒力[11]。采用十字交叉法測量菌落直徑并拍照。抑制率 （%）=100%× （對照菌落擴散直徑-處理菌落擴散直徑）/（對照菌落平均直徑-菌餅直徑）。以供試藥劑有效成分質(zhì)量濃度（ $＼mathrm{＼mg/L}$ 的對數(shù)值為自變量 （x） ，抑制率的概率值為因變量 （y） ，建立殺菌劑的毒力回歸方程式和計算相關(guān)系數(shù) ，并由毒力回歸方程計算EC50值。

1.2.6 數(shù)據(jù)處理與分析

采用Excel2010、GraphpadPism9.5等軟件對試驗數(shù)據(jù)進行處理和統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果與分析

2.1病原菌分離鑒定

對弼猴桃病葉進行組織分離純化，共獲得1株分離株，命名為YB7。在PDA培養(yǎng)基上 恒溫培養(yǎng)6d后，發(fā)現(xiàn)菌株YB7菌落邊緣規(guī)則，氣生菌絲呈發(fā)達的白色絨毛狀，菌落中心為暗褐色，邊緣為灰白色（圖1A和圖1B）。顯微鏡觀察結(jié)果顯示，菌株YB7的分生孢子呈倒棒狀、橢圓形或卵圓形，暗褐色，表面具橫隔或縱隔，呈壁磚狀結(jié)構(gòu)，橫隔較粗，末端喙短，孢子大小為（17.715＼～69.373） $＼upmu＼mathrm{m}＼times$ （10.042～43.118 ） $＼upmu＼mathrm{m}$ （圖1C）。菌絲及分生孢子梗至暗褐色，具橫隔（圖1D）。根據(jù)上述形態(tài)特征，將YB7初步歸類于鏈格孢屬真菌。

注：菌株YB7在PDA培養(yǎng)基上 恒溫培養(yǎng)6d的菌落正面（A）和反面（B），YB7菌株的分生孢子（C），YB7菌株的菌絲和分生孢子梗（D），標尺為 ${50＼upmu＼mathrm{m}}$ 。

將YB7菌株的ITS、AIta1和GADPH序列串聯(lián)，以StemphyliumcallistephiEEB1055為外群構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。結(jié)果表明，菌株YB7與Alternariaalter-nataCBS109455聚于一支，支持率為 97% （圖2）。因此，綜合形態(tài)學(xué)觀察和系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果，將菌株YB7鑒定為交互鏈格孢菌。

2.2 病原菌致病性測定

將YB7菌塊接種至離體的健康弼猴桃葉片4d后，其可引起葉片正面（圖3B）與背面（圖3D）出現(xiàn)圓形規(guī)則的黑褐色病斑，癥狀與果園弼猴桃葉斑病癥狀（圖3A）一致。將YB7菌塊接種到盆栽弼猴桃的健康葉片上6d后，也可在接種部位觀察到黑褐色規(guī)則病斑（圖3C），而只接種PDA培養(yǎng)基的空白對照未發(fā)病。這表明菌株YB7是弼猴桃葉斑病的病原菌。

注：A一果園自然發(fā)病葉片；B一離體葉片接菌正面發(fā)病癥狀（第4天）；C—盆栽獼猴桃人工接菌發(fā)病癥狀（第6天）；D一離體葉片接菌反面發(fā)病癥狀（第4天）。其中白色和黑色箭頭分別代表PDA空白對照接種部位和菌株YB7菌塊接種部位。

2.36種殺菌劑對YB7的室內(nèi)毒力測定

如表1所示，通過構(gòu)建毒力回歸方程發(fā)現(xiàn)， 25% 咪鮮胺乳油對YB7菌株的室內(nèi)毒力最強，其EC50值為 0.05mg/L 10% 苯醚甲環(huán)唑水分散性粒劑的EC50值為 ，對YB7菌株也具有較好的抑菌作用；其次是 80% 戊唑醇水分散性粒劑和 70% 丙森鋅可濕性粉劑，其EC50值分別為 2.81mg/L 和8.39mg/L 25% 嘧菌酯乳油和 70% 代森聯(lián)可濕性粉劑對交互鏈格孢菌的抑菌效果相對較差，EC50值分別為 22.29mg/L 和 23.36mg/L 。綜上所述， 25% 咪鮮胺乳油和 10% 苯醚甲環(huán)唑水分散性粒劑的抑菌效果最明顯，是理想的藥劑選擇，其他藥劑作用次之。

3結(jié)束語

研究通過組織分離法，并結(jié)合形態(tài)學(xué)特征和多基因聯(lián)合分析，明確了引起貴州省黔東南州凱里市下司鎮(zhèn)花橋村弼猴桃園葉斑病的病原菌為交互鏈格孢菌。鏈格孢屬真菌是一類具有較強適應(yīng)性的常見暗色真菌，能引起蘋果霉心病、梨黑斑病、甜櫻桃黑斑病等病害，給高經(jīng)濟價值的果樹產(chǎn)業(yè)生產(chǎn)造成了嚴重的產(chǎn)量和經(jīng)濟損失[12]。且每年6—7月貴州省降雨量較大，氣候潮濕，加速了弼猴桃葉斑病的發(fā)生。

化學(xué)防治具有快速高效、機械化操作和使用方便等特點，是病害防治的首選手段，但是在化學(xué)防治中盲目用藥會導(dǎo)致污染環(huán)境。因此，高效殺菌劑的篩選對于防控農(nóng)業(yè)病害精準用藥具有重要意義。其中戊唑醇、苯醚甲環(huán)唑、咪鮮胺、代森聯(lián)、嘧菌酯、丙森鋅均屬于高效、廣譜性殺菌劑，并且對鏈格孢屬真菌均具有較好的抑菌效果。研究表明，70% 的丙森鋅對柑橘鏈格孢菌抑菌效果最好，EC50值為 $0.2475～＼upmu＼mathrm{g/mL}^{[13]}$ ；梨黑斑病鏈格孢菌對咪鮮胺、苯醚甲環(huán)唑的敏感性較高，EC50值為 ；嘧菌酯對芍藥黑斑病鏈格孢屬真菌交互鏈格孢菌的菌絲抑制作用明顯[15]；2g/L43% 的戊唑醇對蘋果葉斑病鏈格孢真菌菌絲的生長有較強的抑制作用，抑菌率達 ；殺菌劑代森聯(lián)對草莓鏈格孢屬真菌病害相對防效最好[7]。然而，關(guān)于弼猴桃葉斑病菌交互鏈格孢菌防治藥劑的研究相對較少，為避免盲目使用化學(xué)藥劑，研究選取了6種殺菌劑，分別為 25% 咪鮮胺乳油、 10% 苯醚甲環(huán)唑水分散性粒劑、 80% 戊唑醇水分散性粒劑 .70% 丙森鋅可濕性粉劑 25% 嘧菌酯懸浮劑和 70% 代森聯(lián)可濕性粉劑，進行室內(nèi)毒力測定，并明確了 25% 咪鮮胺乳油和 10% 苯醚甲環(huán)唑水分散性粒劑對交互鏈格孢菌具有較好的抑菌作用。結(jié)果將有助于為交互鏈格孢菌引起的弼猴桃葉斑病的科學(xué)防治提供參考依據(jù)。

參考文獻：

[1]楊亞蒙，韋靜波，郭紅娜，等.獼猴桃周年管理[J].果農(nóng)之友，2024（9）：38-40.

[2]戚鈺.獼猴桃MYB44-like轉(zhuǎn)錄因子的功能研究及獼猴桃葉斑病新致病真菌的分離鑒定[D].成都：四川大學(xué)，2021.

[3]RAJANP，NATRAJP，KIMM，etal.Climate change impacts on and response strategies for kiwifruit production： a comprehensive review[J].Plants，2024，13（17）：2354.

[4]張凱東.獼猴桃棒孢葉斑病菌生物學(xué)特性研究及室內(nèi)藥劑篩選[D」.南昌：江西農(nóng)業(yè)大學(xué)，2021.

[5]秦雙林，王園秀，蔣軍喜，等.江西奉新縣獼猴桃葉斑病病原菌鑒定[J].江西農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，2016，38（3）：488-491.

[6]杜亞敏.引起獼猴桃枝枯和葉斑的間座殼菌種類鑒定及致病性研究[D」.武漢：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)，2020.

[7]TAN H，ZHAO Z B，F(xiàn)AN R，et al.Diaporthe hispaniae causes leaf black spot disease of kiwi crop in Guizhou Province，China[J].Crop Protection，2024，190：107095-107095.

[8]郭睿文，何利欽，莊啟國，等.紅陽獼猴桃葉斑病病原鑒定及室內(nèi)藥劑篩選[J」.資源開發(fā)與市場，2016，32（6）：741-744，753，770.

[9]李朋華.部分鏈格孢屬真菌的形態(tài)學(xué)及多基因鑒定[D].鄭州：河南農(nóng)業(yè)大學(xué)，2016.

[10]黃露，安星宇，熊鑫，等.貴州紅陽獼猴桃棒孢葉斑病病原菌分離鑒定及防治藥劑篩選[J].中國果樹，2023（5）：84-87，97，142.

[11]石金巧，張榮全，何立楠，等.獼猴桃葉斑病防治藥劑篩選[J].農(nóng)藥，2021，60（4）：294-296.

[12]康子騰，姜黎明，羅義勇，等.植物病原鏈格孢屬真菌的致病機制研究進展[J」.生命科學(xué)，2013，25（9）：908-914.

[13]趙永安，胡軍華，姚廷山，等.柑桔鏈格孢菌殺菌劑的室內(nèi)篩選[J].中國南方果樹，2012，41（1） ：36-37，41.

[14]賈藝凡，趙延存，李朝輝，等.3種梨樹鏈格孢病菌的鑒定、遺傳多樣性及其對殺菌劑的敏感性[J].江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2024，52（10）：137-144.

[15]陶航，扎依娜·瑪合巴提，張燁，等.芍藥黑斑病病原菌鑒定及其對殺菌劑敏感性分析[J].園藝學(xué)報，2021，48（1）：173-182.

[16]柴兆霞.蘋果葉斑病病原菌鑒定及殺菌劑篩選[J].甘肅林業(yè)科技，2024，49（2）：36-40.

[17]忻雅，肖文斐，阮松林，等.不同殺菌劑和誘導(dǎo)劑對草莓病害及產(chǎn)量的影響[J].江西農(nóng)業(yè)學(xué)報，2021，33（1）：28-32.