李卓 彭祖想 任同軍 韓雨哲

摘?要：為探討在無魚粉飼料中補充限制性氨基酸對鯉（Cyprinus?carpio）抗氧化性能和免疫酶活性的影響，研究設(shè)計了5組等氮等脂的飼料，分別添加不同水平的限制性氨基酸（Met∶Lys=0.318），即0%（G1組）、05%（G2組）、1.0%（G3組）、1.5%（G4組）、2.0%（G5組）。選取初始體質(zhì)量為（55.54±0.09）g的鯉150尾，進(jìn)行了為期8周的養(yǎng)殖試驗。研究結(jié)果顯示，適量補充限制性氨基酸能夠提高鯉的總抗氧化能力（T-AOC）、總超氧物歧化酶（T-SOD）和過氧化氫酶（CAT）活性；同時降低丙二醛（MDA）含量。G4和G5組的T-AOC活性顯著高于對照組（P＜0.05），G2、G3、G4和G5組的T-SOD和CAT活性顯著高于對照組（P＜0.05），G5組的MDA含量顯著低于G1、G2和G3組（P＜0.05）。隨著限制性氨基酸補充水平的增加，鯉肝臟的ACP、AKP和LZM活性也呈上升趨勢。G3、G4和G5組的ACP活性顯著高于對照組（P＜0.05），G4和G5組的AKP和LZM活性顯著高于對照組（P＜0.05）。根據(jù)試驗結(jié)果，可以得出結(jié)論：在本試驗條件下，適量補充限制性氨基酸能夠增強(qiáng)鯉的抗氧化性能和部分免疫酶活性，其中2.0%的限制性氨基酸補充量效果最好。

關(guān)鍵詞：無魚粉；限制性氨基酸；鯉（Cyprinus?carpio）；抗氧化；非特異性免疫

魚粉是一種高質(zhì)量的動物蛋白質(zhì)來源，含有適宜的氨基酸組成，被廣泛用于養(yǎng)殖水產(chǎn)動物。然而，近年來，魚粉的供應(yīng)不穩(wěn)定且價格昂貴，限制了養(yǎng)殖業(yè)的可持續(xù)發(fā)展。因此，研究人員嘗試在實際生產(chǎn)中使用其他動植物蛋白質(zhì)源來替代魚粉，開發(fā)無魚粉的飼料配方。然而，一般的動植物蛋白質(zhì)源缺乏一些必需的氨基酸。為了平衡飼料中氨基酸的組成，研究人員通過添加晶體氨基酸來獲得理想的蛋白質(zhì)來源[1-3]。雞腸粉（CGM）是一種利用新鮮雞腸加工而成的新型高質(zhì)量飼料蛋白質(zhì)源，其粗蛋白質(zhì)和粗脂肪含量接近甚至高于魚粉，但仍缺乏賴氨酸（Lys）和蛋氨酸（Met）等一些必需氨基酸[4-6]。因此，添加適量的賴氨酸和蛋氨酸來平衡雞腸粉中的氨基酸組成，可以充分利用雞腸粉并使其成為理想的蛋白質(zhì)來源。

研究結(jié)果顯示，當(dāng)常規(guī)的動植物蛋白質(zhì)原料高比例或完全替代魚粉時，水產(chǎn)動物的抗氧化狀態(tài)和免疫能力通常會下降[7-9]。這可能是因為動植物蛋白質(zhì)原料中存在抗?fàn)I養(yǎng)因子和（或）缺乏某些必需氨基酸。相關(guān)研究表明，適量添加賴氨酸和蛋氨酸可以提高水產(chǎn)動物的抗氧化能力和免疫力[10-12]。然而，目前還沒有關(guān)于使用雞腸粉作為動物蛋白質(zhì)源開發(fā)無魚粉飼料的相關(guān)報道。鯉（Cyprinus?carpio）是中國重要的淡水經(jīng)濟(jì)養(yǎng)殖品種，在水產(chǎn)養(yǎng)殖中具有重要地位。根據(jù)《2021中國漁業(yè)統(tǒng)計年鑒》[13]的數(shù)據(jù)，2020年中國鯉養(yǎng)殖產(chǎn)量達(dá)到289.67萬噸，較2019年增加了1.14萬噸。因此，開發(fā)無魚粉飼料對鯉養(yǎng)殖具有重要意義。本研究選擇鯉作為研究對象，在不添加魚粉的情況下，主要以雞腸粉作為動物蛋白質(zhì)源，并補充賴氨酸和蛋氨酸。旨在研究不同限制性氨基酸添加水平對鯉抗氧化能力和免疫酶活性的影響，為雞腸粉在淡水魚飼料中的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1?材料與方法

1.1?試驗設(shè)計和管理

試驗使用的鯉魚種購買自遼寧省丹東市當(dāng)?shù)仞B(yǎng)殖場，并在一個尺寸為4.3?m×1.5?m×1.2?m的水泥池中進(jìn)行了為期2周的預(yù)養(yǎng)，以適應(yīng)試驗環(huán)境。在預(yù)養(yǎng)期間，投喂對照組飼料。魚類養(yǎng)殖試驗在大連海洋大學(xué)遼寧省北方魚類生物學(xué)及增養(yǎng)殖重點實驗室的循環(huán)水池（尺寸為4.3?m×3.0?m×1.4?m）中進(jìn)行，并使用了網(wǎng)箱進(jìn)行養(yǎng)殖。選取初始體質(zhì)量為（55.54±0.2）g的鯉150尾，隨機(jī)分為5組，每組有3個重復(fù)，每個重復(fù)中放置10尾魚，共使用15個尺寸為1.3?m×0.8?m×07?m的聚乙烯網(wǎng)箱。養(yǎng)殖周期為8周，從2021年6月19日至8月14日，每日上午9：00和下午17：00各投喂一次，以保持魚類飽食狀態(tài)。每日清理底部一次，并進(jìn)行一次水的置換，置換量約占總水量的1/5。試驗使用的水源為經(jīng)過曝氣處理超過24?h的自來水。試驗期間保持自然光照，水溫維持在（27.0±1.0）℃，溶解氧濃度為（70±0.5）mg/L，pH值為（7.6±0.5）。

1.2?試驗飼料及試驗設(shè)計

雞腸粉由遼寧省鞍山裕豐飼料有限公司提供，其粗蛋白含量為65.47%，粗脂肪含量為1480%。其他試驗飼料原料均在大連當(dāng)?shù)厥袌鲑徺I。根據(jù)表1所示的飼料配方及其蛋氨酸和賴氨酸含量，以雞腸粉和豆粕為主要蛋白源，以豆油為主要脂肪源，配制了5組等氮等脂的飼料，分別命名為G1、G2、G3、G4、G5。參考鯉的營養(yǎng)需求[14]和原料中蛋氨酸和賴氨酸的含量確定蛋氨酸與賴氨酸的比值為0.318，并相應(yīng)添加了限制性氨基酸。各組限制性氨基酸（Met∶Lys=0318）的添加量分別為0%（G1組，對照組）、05%（G2組）、1.0%（G3組）、1.5%（G4組）和2.0%（G5組）。所有飼料原料經(jīng)過60目篩網(wǎng)過濾，混合均勻后，使用制粒機(jī)制成2?mm大小的顆粒飼料。飼料在42?℃烘箱中烘干至水分含量為10%，隨后裝入自封袋中，并儲存在-20?℃的冰箱中保存。

1.3?樣品采集及指標(biāo)測定

試驗結(jié)束后，試驗魚禁食24?h，并使用50?mg/L的MS-222溶液麻醉。從每個網(wǎng)箱中隨機(jī)選取5尾魚，將其肝臟樣品提取至冰盤中，并進(jìn)行混合?；旌虾蟮臉悠费b入管中，在-80?℃保存待測。為了分析鯉肝臟的抗氧化指標(biāo)和免疫酶活性，將肝臟樣品按照樣品質(zhì)量與生理鹽水體積1∶9的比例，在冰水浴中使用玻璃研磨器進(jìn)行研磨。隨后，將研磨后的樣品注入離心管中，在4?℃、3?500?r/min、10?min的高速離心下，取上清液進(jìn)行后續(xù)測定。使用南京建成生物工程研究所提供的試劑盒，測定了鯉肝臟的總抗氧化能力（T-AOC）、總超氧化物歧化酶（T-SOD）、過氧化氫酶（CAT）活性、丙二醛（MDA）含量、肝臟酸性磷酸酶（ACP）、堿性磷酸酶（AKP）和溶菌酶活性（LZM）。

1.4?數(shù)據(jù)處理

試驗數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤（Mean?±?SE）的形式呈現(xiàn)，并使用GraphPad?Prism軟件進(jìn)行圖表繪制。使用IBM的SPSS?25.0軟件進(jìn)行單因素方差分析（One-way?ANOVA），并使用Duncan's方法進(jìn)行多重比較，以分析各處理組之間的顯著性差異。將P值小于0.05的結(jié)果視為具有顯著差異。

2?結(jié)果

2.1?無魚粉飼料中補充限制性氨基酸對鯉肝臟抗氧化能力的影響

根據(jù)表3的結(jié)果顯示，當(dāng)無魚粉飼料中添加限制性氨基酸后，鯉肝臟的總抗氧化能力（T-AOC）、總超氧化物歧化酶（T-SOD）和過氧化氫酶（CAT）活性呈現(xiàn)上升趨勢。具體來說，G4和G5組的T-AOC活性顯著高于對照組（P＜005），而G2、G3、G4和G5組的T-SOD和CAT活性也顯著高于對照組（P＜0.05）。同時，隨著限制性氨基酸補充水平的增加，丙二醛（MDA）含量呈現(xiàn)下降趨勢。此外，G5組的MDA含量顯著低于G1、G2和G3組（P＜0.05）。綜上所述，表3結(jié)果表明無魚粉飼料中補充限制性氨基酸對鯉肝臟的抗氧化能力產(chǎn)生影響。

表3?無魚粉飼料中補充限制性氨基酸對鯉肝臟抗氧化能力的影響

組別總抗氧化能力T-AOC/U·mg-1prot總超氧物歧化酶T-SOD/U·mg-1prot過氧化氫酶CAT/U·mg-1prot?丙二醛MDA/nmol·mg-1prot

G117.53±0.77a108.12±3.72a10.42±0.22a5.67±0.45c

G223.11±0.52ab135.52±1.61b11.89±0.19b4.90±0.36bc

G324.20±0.21ab136.82±1.00b12.18±0.21b4.18±0.37b

G436.28±3.94b172.32±4.79c14.30±0.12c3.86±0.07ab

G536.60±9.58b177.81±2.72c14.67±0.12c2.95±0.18a

注：同列中標(biāo)有不同小寫字母者表示組間有顯著性差異（P<0.05），標(biāo)有相同小寫字母者表示組間無顯著性差異（P>0.05）。

2.2?無魚粉飼料中補充限制性氨基酸對鯉肝臟免疫酶活性的影響

根據(jù)圖1至圖3的結(jié)果顯示，無魚粉飼料中補充限制性氨基酸對鯉肝臟中酸性磷酸酶（ACP）、堿性磷酸酶（AKP）和溶菌酶（LZM）活性具有顯著影響（P＜0.05）。隨著限制性氨基酸補充水平的增加，鯉肝臟中的ACP、AKP和LZM活性呈現(xiàn)上升趨勢。具體而言，G3、G4和G5組的ACP活性顯著高于對照組（P＜0.05），而G4和G5組的AKP和LZM活性也顯著高于對照組（P＜0.05）。

3?討論

3.1?無魚粉飼料中補充限制性氨基酸對鯉肝臟抗氧化能力的影響

水產(chǎn)動物具有抗氧化酶保護(hù)系統(tǒng)，包括T-SOD、CAT和GSH-Px等酶，可以清除過量的氧化自由基，減少脂質(zhì)氧化引起的損害。脂質(zhì)過氧化損傷的生物標(biāo)志物是MDA，可以間接反映細(xì)胞的損傷程度[16]。相關(guān)研究已經(jīng)表明，適量補充賴氨酸和蛋氨酸的飼料可以增強(qiáng)建鯉（Cyprinus?carpio?var.?Jian）[17]、草魚（Ctenopharyngodon?idellus）[18]和黃顙魚（Pelteobagrus?fulvidraco）[19]等水產(chǎn)動物的抗氧化能力。另外，遲淑艷等[20]的研究顯示，適量添加蛋氨酸的飼料可以增強(qiáng)斜帶石斑魚（Epinephelus?coioides）肝臟的SOD和CAT活性，提高其抗氧化能力。Ahmed等[21]的研究發(fā)現(xiàn)，適量添加賴氨酸的飼料可以增強(qiáng)虹鱒（Oncorhynchus?mykiss）中SOD和CAT的活性，降低MDA含量。此外，Huang等[18]認(rèn)為適量添加賴氨酸的飼料可以調(diào)節(jié)草魚的抗氧化酶相關(guān)基因表達(dá)，增強(qiáng)其抗氧化酶活性。本次試驗的結(jié)果與前人的研究相一致，無魚粉飼料中補充限制性氨基酸后，鯉肝臟中的T-AOC、T-SOD和CAT活性呈上升趨勢，MDA含量則呈下降趨勢。這表明適量補充限制性氨基酸可以提高鯉肝臟的抗氧化能力，并降低MDA含量。具體而言，G5組的T-AOC、T-SOD和CAT活性顯著高于其他組，MDA含量顯著低于其他組，這表明2.0%限制性氨基酸補充量對于提高鯉肝臟的抗氧化能力有最佳效果。

3.2?無魚粉飼料中補充限制性氨基酸對鯉肝臟免疫酶活性的影響

魚類屬于低等脊椎動物，非特異性免疫系統(tǒng)在機(jī)體防御中極其重要，免疫酶活性，如ACP、AKP和LZM等，可以反映出機(jī)體的免疫能力[22]。李小軍[23]研究發(fā)現(xiàn)，適量添加蛋氨酸的飼料能夠提高虎龍雜交斑（E.fuscoguttatus♀×E.lanceolatus♂）血清中LZM活性和免疫球蛋白（lgM）濃度，刺激頭腎中HSP70基因的表達(dá)，增強(qiáng)龍虎雜交斑的免疫能力。類似地，李雪吟[24]的研究顯示，適量添加賴氨酸的飼料能夠增強(qiáng)草魚腸道中LZM和ACP的活性，上調(diào)Hepcidin和LEAP-2基因的表達(dá)，增強(qiáng)草魚的免疫能力。在本試驗中，隨著限制性氨基酸補充水平的增加，鯉肝臟中的ACP、AKP和LZM活性呈上升趨勢。G5組的ACP、AKP和LZM活性顯著高于其他組，這表明無魚粉飼料中適量添加限制性氨基酸可以提高鯉肝臟的免疫酶活性。Hu等[25]的研究指出，飼料中賴氨酸的缺乏會上調(diào)草魚皮膚、脾臟和頭腎中IL-1β促炎癥因子基因的表達(dá)，從而引發(fā)炎癥。Yang等[26]的研究也表明，賴氨酸可以作為一種營養(yǎng)物質(zhì)降低大口黑鱸（Micropterus?salmoides）促炎癥因子mRNA的表達(dá)，從而減少炎癥反應(yīng)。另外，賴氨酸的補充還可以在一定程度上增強(qiáng)機(jī)體對氧化自由基的清除能力，降低炎癥反應(yīng)，這與本試驗中抗氧化酶和免疫酶活性的結(jié)果相一致?；谝陨涎芯亢驮囼灲Y(jié)果，可以得出結(jié)論，適量補充限制性氨基酸可以顯著提高鯉的免疫酶活性，并將對鯉的免疫能力產(chǎn)生積極影響。

4?結(jié)論

在本試驗條件下，適量補充限制性氨基酸到無魚粉飼料中能夠增強(qiáng)鯉肝臟的抗氧化能力和部分免疫酶活性，其中2.0%的補充量效果最佳。

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