龐華 智靜濤 邊建華 劉文杰

膀胱癌是泌尿系統(tǒng)常見的惡性腫瘤,近年來(lái)發(fā)病率呈上升趨勢(shì),男性發(fā)病率高于女性,中老年群體發(fā)病率高于年輕群體,手術(shù)、化療和免疫治療是主要治療方法,但會(huì)導(dǎo)致其預(yù)后不良,且復(fù)發(fā)率高[1-2]。因此,尋找新的有效的治療手段迫在眉睫。中醫(yī)藥具有增效減毒作用,在治療腫瘤方面應(yīng)用越來(lái)越廣。膀胱癌屬尿血、血淋及癃閉范疇,以止血涼血、瀉火清熱和散結(jié)利濕治療為主[3]。

銀杏內(nèi)酯B 是一種從銀杏葉中提取的二萜內(nèi)酯,具有抗氧化、抗炎、清除自由基功效,此外銀杏內(nèi)酯B還有抗腫瘤活性,能有效抑制腫瘤細(xì)胞增殖,誘導(dǎo)其凋亡,還可提高化療藥物的有效性,降低耐藥發(fā)生,增強(qiáng)放療敏感性[4]。Wang等[5]報(bào)道銀杏內(nèi)酯B通過(guò)beclin-1依賴性自噬抑制肺癌細(xì)胞增殖,銀杏內(nèi)酯B 還可誘導(dǎo)人結(jié)腸癌SW480 細(xì)胞的凋亡[6],銀杏內(nèi)酯B還可以通過(guò)上調(diào)mi R-223-3p抑制ZEB1蛋白翻譯,從而抑制膀胱癌細(xì)胞的侵襲性[7],但其抗癌的作用機(jī)制尚不完全明確。

核轉(zhuǎn)錄因子-κB(nuclear transcription f actor-Κb,NF-κB)通路是活化的NF-κB 進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)與DNA 結(jié)合,通過(guò)調(diào)控靶基因的轉(zhuǎn)錄,參與多種腫瘤增殖、凋亡等生物學(xué)行為,當(dāng)外界刺激導(dǎo)致NF-κB通路被激活時(shí),IKK 將NF-κB 家族的抑制蛋白IκB磷酸化,從而抑制蛋白失去活性,進(jìn)一步導(dǎo)致NFκB核轉(zhuǎn)錄因子發(fā)生解離后進(jìn)入細(xì)胞核后并且發(fā)揮對(duì)應(yīng)的生物學(xué)機(jī)制[8-9]。據(jù)報(bào)道,苦參堿通過(guò)抑制toll樣受體4(toll-like receptor,TLR4)/NF-κB 通路減弱膀胱癌小鼠模型的腫瘤生長(zhǎng)和誘導(dǎo)凋亡[10],但銀杏內(nèi)酯B 是否可以通過(guò)調(diào)控NF-κB 信號(hào)通路影響膀胱癌J82細(xì)胞的生物學(xué)行為尚未可知。基于此,本研究探討銀杏內(nèi)酯B干預(yù)對(duì)J82細(xì)胞增殖、凋亡的影響以及對(duì)NF-κB信號(hào)通路的調(diào)控機(jī)制,可為膀胱癌的治療研究提供新的理論參考?，F(xiàn)報(bào)告如下。

材料與方法

一、材料

人膀胱移行細(xì)胞癌細(xì)胞(J82)購(gòu)自上海賽百慷生物技術(shù)股份有限公司。銀杏內(nèi)酯B、紫杉醇購(gòu)自上海源葉生物科技有限公司,純度≥98%,NF-κB通路抑制劑BAY 11-7082購(gòu)自上海源葉生物科技有限公司,純度≥99%,NF-κB 信號(hào)通路激活劑Prostratin購(gòu)自Aladdin公司,純度≥98%,胎牛血清和高糖DMEM 培養(yǎng)液購(gòu)自美國(guó)Gibco 公司,CCK-8試劑盒購(gòu)自上海翌圣生物科技有限公司,5-乙炔基-2′脫氧尿嘧啶核苷(5-et hynyl-2′-deoxyuridine,Ed U)細(xì)胞增殖檢測(cè)試劑盒購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司,Hoechst 33258 染色試劑盒購(gòu)自江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司,逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR Pre mix Ex TaqⅡ試劑盒購(gòu)自杭州主諾生物技術(shù)有限公司,RIPA 裂解液購(gòu)自美國(guó)abw 公司,二喹啉甲酸蛋白試劑盒購(gòu)自英國(guó)Abca m 公司,鼠抗人[IκBα、p-IκBα、NF-κB p65、p-NF-κB p65、Caspase-3、D1及β-actin一抗、辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的山羊抗鼠Ig G(二抗)購(gòu)自美國(guó)CST 公司。

MF52-N 型倒置熒光顯微鏡購(gòu)自廣州市明美光電技術(shù)有限公司;H WO301型二氧化碳培養(yǎng)箱購(gòu)自美國(guó)FORMA 公司;Multiskan Ascent型酶標(biāo)儀購(gòu)自美國(guó)Ther mo公司;7500 型實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀器購(gòu)自美國(guó)ABI公司,Gel Doc 2000型凝膠成像系統(tǒng)購(gòu)自美國(guó)Back man公司。

二、實(shí)驗(yàn)方法

1.人膀胱癌J82細(xì)胞培養(yǎng):在37℃,5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng),將人膀胱癌J82 細(xì)胞培養(yǎng)于高糖DMEM 培養(yǎng)液(含10%胎牛血清,1%青-鏈霉素)中,待細(xì)胞貼壁達(dá)80%以上時(shí)進(jìn)行細(xì)胞傳代,取第4代對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)J82細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

2.分組及給藥:選取第4代對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)的膀胱癌J82細(xì)胞,調(diào)整密度至2×105個(gè)/ml,接種到96孔板中,每孔100μl。將膀胱癌J82細(xì)胞分為①對(duì)照組、低/中/高濃度實(shí)驗(yàn)組和陽(yáng)性藥物組;②對(duì)照組、銀杏內(nèi)酯B組、激活劑組和抑制劑組,對(duì)照組細(xì)胞不做干預(yù),低/中/高濃度實(shí)驗(yàn)組分別加入5、10和20μmol/L銀杏內(nèi)酯B[11]進(jìn)行干預(yù),陽(yáng)性藥物組用100 n mol/L 紫杉醇[12]進(jìn)行干預(yù),銀杏內(nèi)酯B組是用20μmol/L銀杏內(nèi)酯B進(jìn)行干預(yù),激活劑組是在20μmol/L銀杏內(nèi)酯B 基礎(chǔ)上加入1μmol/L NFκB通路激活劑Prostratin,抑制劑組是在20μmol/L銀杏內(nèi)酯B基礎(chǔ)上加入5μmol/L NF-κB通路抑制劑BAY 11-7082,干預(yù)24 h。每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔,后置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

3.CCK-8法測(cè)定J82細(xì)胞的活力:細(xì)胞分組與給藥方法同上,選取第4代對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)的細(xì)胞,調(diào)整密度至2×105個(gè)/ml,接種到96 孔板中,每孔加100μl,實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。各組干預(yù)24 h 后,加 入CCK-8溶液10μl,繼續(xù)孵育2 h,使用酶標(biāo)儀測(cè)定各組光密度(OD)值(450 n m)。細(xì)胞活力=(低/中/高濃度實(shí)驗(yàn)組或陽(yáng)性藥物組OD值-空白組OD值)/(對(duì)照組OD值-空白組OD值)×100%。

4.Ed U 法測(cè)定J82細(xì)胞的增殖能力:細(xì)胞分組與給藥方法同上,干預(yù)24 h后,收集細(xì)胞,用完全細(xì)胞培養(yǎng)液重懸,以2×105個(gè)/孔的密度接種于12孔板,于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h,進(jìn)行Ed U 處理,去除培養(yǎng)液,用0.5 ml 4%多聚甲醛固定,室溫15 min,再用0.5 ml 3%BSA 洗滌3次;用0.5 ml 0.3%Triton X-100去除BSA,室溫10 min,再用BSA 洗滌3次;12孔板中每孔加200μl Click反應(yīng)液,室溫避光孵育30 min,3%BSA 洗滌3次去除Click反應(yīng)液;每孔加入0.5 ml Hoechst,室溫避光孵育10 min;再用3%BSA 洗滌3次去除Hoechst;裝片,熒光顯微鏡拍照,再用I mage J軟件處理圖片。Ed U 陽(yáng)性染色細(xì)胞(紅色)占總細(xì)胞(藍(lán)色)的百分比表示細(xì)胞增殖率。

5.Hoechst 33258染色法測(cè)定J82細(xì)胞凋亡情況:細(xì)胞分組與給藥方法同上,干預(yù)24 h后,將J82細(xì)胞接種到12 孔板中,每孔加約2×105個(gè)細(xì)胞,PBS洗滌細(xì)胞2次(每次5 min)加入新鮮配置4%多聚甲醛,4℃固定10 min。PBS洗滌3次(5 min/次),加Hoechst 33258染液(5 mg/L)10μl/孔,避光孵育10 min,PBS洗滌3次(5 min/次),封固后,用熒光顯微鏡對(duì)細(xì)胞凋亡情況進(jìn)行拍照。凋亡細(xì)胞的形態(tài)特征是細(xì)胞核染色不均濃染且所發(fā)熒光較強(qiáng),呈亮藍(lán)色。I mage-J圖像分析軟件計(jì)算凋亡細(xì)胞數(shù)。細(xì)胞凋亡率= 凋亡細(xì)胞數(shù)/細(xì)胞總數(shù)×100%。

6.RT-qPCR 測(cè) 定J82 細(xì) 胞 中Cyclin D1 和Caspase 3 mRNA 相對(duì)表達(dá)量:細(xì)胞分組與給藥方法 同上,干 預(yù)24 h 后,將J82 細(xì) 胞 接 種 到12 孔 板中,每孔加約2×105個(gè)細(xì)胞,Trizol試劑盒提取總RNA,按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng),獲取c DNA 模版。參照SYBR Premix Ex TaqⅡ試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行RT-q PCR 擴(kuò)增。反應(yīng)條件為:94℃預(yù)變性5 min;94℃變性35 s,58℃退火35 s,72℃延伸35 s,設(shè)置40 次循環(huán)。以GAPDH 為內(nèi)參,2-△△CT法計(jì)算Cyclin D1和Caspase 3相對(duì)表達(dá)量。引物序列見表1。

表1 RT-q PCR 引物序列

7.Western blotting 法 檢 測(cè)J82 細(xì) 胞 中Caspase-3、Cyclin D1和NF-κB 通路相關(guān)蛋白的表達(dá)水平:細(xì)胞分組與給藥方法同上,干預(yù)24 h時(shí),收集各組細(xì)胞于RIPA 液在冰上進(jìn)行裂解,4℃、12 000 r/min 離心20 min,取上清進(jìn)行蛋白變性后,制膠,上樣,進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳凝膠電泳,300 mA 恒流轉(zhuǎn)聚偏二氟乙烯膜,使用5%脫脂牛奶封閉2 h,然后參照抗體說(shuō)明書加入一定稀釋比例的一抗(IκBα、p-IκBα、NF-κB p65、p-NF-κB p65、Caspase-3、Cyclin D1及β-actin),4℃孵育過(guò)夜,TBST 洗滌3次后加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記山羊抗鼠Ig G 二抗,孵育2 h 后棄去液體,TBST 洗滌3次,最后加顯影液,使用凝膠成像系統(tǒng)拍照記錄。蛋白灰度值用G 表示,蛋白相對(duì)表達(dá)量=G目的蛋白/G內(nèi)參蛋白(β-actin)。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 23.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,符合正態(tài)分布且方差齊性,數(shù)據(jù)以(±s)表示。多組間比較采用單因素方差分析法,進(jìn)一步兩組間比較Dunnett'st檢驗(yàn),P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。使用Graph Pad Pris m 8軟件進(jìn)行作圖,I mage J計(jì)算細(xì)胞增殖、凋亡細(xì)胞數(shù)和蛋白灰度值。

結(jié) 果

一、銀杏內(nèi)酯B抑制J82細(xì)胞的活力和增殖誘導(dǎo)其凋亡

分別使用CCK-8、Ed U 和Hoechst法檢測(cè)銀杏內(nèi)酯B對(duì)J82細(xì)胞活力、增殖和凋亡的影響(圖1～圖3),實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,干預(yù)24 h時(shí),對(duì)照組、低/中/高濃度實(shí)驗(yàn)組和陽(yáng)性藥物組的細(xì)胞活力分別為(100±8.61)%、(90.97±5.94)%、(83.84±5.20)%、(68.13±4.29)%、(67.17±3.90)%,細(xì)胞增殖率分別為(38.76±1.47)%、(33.27±3.58)%、(28.93±2.51)%、(20.20±2.89)%、(18.20±3.36)%,細(xì)胞凋亡率分別為(1.72±0.55)%、(2.82±0.41)%、(7.49±1.76)%、(12.16±1.93)%、(12.17±1.41)%,各組細(xì)胞活力、細(xì)胞增殖率、細(xì)胞凋亡率之間均差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F活力=18.084、F增殖=27.604、F凋亡=39.829,均P<0.001)。與對(duì)照組相比,低/中/高濃度實(shí)驗(yàn)組和陽(yáng)性藥物組細(xì)胞活力和增殖率降低,細(xì)胞凋亡率升高,其中低濃度實(shí)驗(yàn)組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),中/高濃度實(shí)驗(yàn)組和陽(yáng)性藥物組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);與陽(yáng)性藥物組相比,低/中/高濃度實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞活力和增殖率升高,細(xì)胞凋亡率降低,其中高濃度實(shí)驗(yàn)組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),低/中濃度實(shí)驗(yàn)組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),所以選擇與陽(yáng)性藥物組效果相當(dāng)?shù)母邼舛葘?shí)驗(yàn)組加上NF-κB 通路激活劑和抑制劑分別作為激活劑組和抑制劑組進(jìn)行后續(xù)通路的驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)。

圖1 銀杏內(nèi)酯B對(duì)J82細(xì)胞活力的影響

圖2 銀杏內(nèi)酯B對(duì)J82細(xì)胞增殖的影響

圖3 銀杏內(nèi)酯B對(duì)J82細(xì)胞凋亡的影響

二、銀杏內(nèi)酯B通過(guò)抑制NF-κB 通路抑制J82細(xì)胞的活力和增殖誘導(dǎo)其凋亡

為了驗(yàn)證銀杏內(nèi)酯B 是否通過(guò)NF-κB 通路影響J82細(xì)胞的活力、增殖和凋亡,在20μmol/L銀杏內(nèi)酯B基礎(chǔ)上加入NF-κB 通路抑制劑和激活劑作為激活劑組和抑制劑組,結(jié)果顯示,對(duì)照組、銀杏內(nèi)酯B 組、激活劑組、抑制劑組的細(xì)胞活力分別為(100.27±6.35)%、(61.58±7.24)%、(86.06±9.26)%、(34.21±8.77)%,細(xì)胞增殖率分別為(38.76±2.46)%、(25.87±2.16)%、(33.27±3.58)%、(18.38±1.68)%,細(xì)胞凋亡率分別為(1.72±0.55)%、(12.16±1.93)%、(7.42±1.31)%、(24.67±2.70)%,各組細(xì)胞活力、細(xì)胞增殖率、細(xì)胞凋亡率之間均差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F活力=39.544、F增殖=35.825、F凋亡=87.829,均P<0.001)。與銀杏內(nèi)酯B 組相比,激活劑組細(xì)胞活力和增殖率顯著升高,細(xì)胞凋亡率顯著降低,而抑制劑組細(xì)胞活力和增殖率顯著降低,細(xì)胞凋亡率顯著升高(P<0.05),見圖4～6。

圖4 銀杏內(nèi)酯B通過(guò)NF-κB通路對(duì)J82細(xì)胞活力的影響

圖5 銀杏內(nèi)酯B通過(guò)NF-κB通路對(duì)J82細(xì)胞增殖的影響

圖6 銀杏內(nèi)酯B通過(guò)NF-κB通路對(duì)J82細(xì)胞凋亡的影響

三、銀杏內(nèi)酯B通過(guò)抑制NF-κB 通路抑制J82細(xì)胞Cyclin D1表達(dá)誘導(dǎo)Caspase-3表達(dá)

分別用RT-qPCR 和Wester n bl otting 法對(duì)Caspase-3和Cyclin D1 mRNA 和蛋白表達(dá)水平進(jìn)行檢測(cè),結(jié)果如圖7所示,對(duì)照組、銀杏內(nèi)酯B 組、激活劑組、抑制劑組細(xì)胞中Caspase-3 mRNA 表達(dá)水平分別為(1.00±0.04)、(1.76±0.16)、(1.10±0.06)、(2.27±0.21),Cyclin D1 mRNA 表達(dá)水平分別為(1.00±0.04)、(0.49±0.08)、(0.78±0.07)、(0.22±0.03),Caspase-3蛋白表達(dá)水平分別為(0.64±0.03)、(1.01±0.1)、(0.76±0.09)、(1.32±0.11),Cyclin D1 蛋白表達(dá)水平分別為(1.04±0.04)、(0.58±0.06)、(0.87±0.05)、(0.26±0.04),各組Caspase-3、Cyclin D1 mRNA 和蛋白表達(dá)水平之間均差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(FCaspase-3mRNA=56.944、FCyclinD1mRNA= 100.543、FCaspase-3蛋白=34.916、FCyclinD1蛋白=151.344,均P<0.001)。與對(duì)照組相比,銀杏內(nèi)酯B 組Caspase-3 mRNA 和蛋白表達(dá)水平顯著升高,而Cyclin D1 mRNA 和蛋白表達(dá)水平顯著降低(P<0.05);與銀杏內(nèi)酯B組相比,激活劑組Caspase-3 mRNA 和蛋白表達(dá)水平顯著降低,而Cyclin D1 mRNA 和蛋白表達(dá)水平顯著升高(P<0.05),與之相反,抑制劑組Caspase-3 mRNA 和蛋白表達(dá)水平顯著升高,Cyclin D1 mRNA和蛋白表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)。

圖7 銀杏內(nèi)酯B通過(guò)NF-κB通路對(duì)J82細(xì)胞Caspase-3和Cyclin D1表達(dá)水平的影響

四、銀杏內(nèi)酯B抑制J82細(xì)胞NF-κB通路的活化

為了確定銀杏內(nèi)酯B 對(duì)NF-κB 信號(hào)通路活化狀態(tài)的影響,本研究檢測(cè)了該通路的關(guān)鍵性蛋白IκBα、p-IκBα、NF-κB p65和p-NF-κB p65的表達(dá)水平(圖8 A),蛋白定量分析結(jié)果顯示(圖8B),對(duì)照組、銀杏內(nèi)酯B組、激活劑組、抑制劑組細(xì)胞中IκBα蛋白表達(dá)水平分別為(0.39±0.01)、(0.39±0.01)、(0.43±0.02)、(0.44±0.04),p-IκBα蛋白表達(dá)水平分別為(0.70±0.05)、(0.47±0.04)、(0.66±0.07)、(0.31±0.04),NF-κB p65蛋白表達(dá)水平分別為(0.83±0.04)、(0.82±0.02)、(0.80±0.06)、(0.86±0.05),p-NF-κB p65蛋白表達(dá)水平分別為(1.05±0.07)、(0.76±0.07)、(1.04±0.10)、(0.43±0.02),各組IκBα和NF-κB p65蛋白表達(dá)水平之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(FIκBα=3.773,PIκBα=0.059;FNF-κBp65=0.926,PNF-κBp65=0.471);各組p-IκBα和p-NF-κB p65蛋白表達(dá)水平之間均差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Fp-IκBα=36.868、Fp-NF-κBp65=50.891,均P<0.001)。與對(duì)照組相比,銀杏內(nèi)酯B組p-IκBα和p-NF-κB p65蛋白表達(dá)水平顯著降低(P<0.05);與銀杏內(nèi)酯B 組相比,激活劑組p-IκBα 和p-NF-κB p65蛋白表達(dá)水平顯著升高(P<0.05),而抑制劑組p-IκBα和p-NF-κB p65蛋白表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)。

圖8 銀杏內(nèi)酯B對(duì)J82細(xì)胞NF-κB信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

討 論

膀胱癌是一種常發(fā)生于男性老年群體的惡性腫瘤,隨著老齡化出現(xiàn)發(fā)病率也在逐漸上升,目前治療膀胱癌的方法仍是手術(shù)、放化療,但治療效果不理想,治療后病情易反復(fù)甚至加劇,且患者生活質(zhì)量低下[13-14],開發(fā)新的藥物尤為迫切。中醫(yī)藥可降低手術(shù)創(chuàng)傷及毒副作用,中醫(yī)學(xué)認(rèn)為膀胱癌發(fā)病機(jī)理與濕熱久郁、膀胱熱度郁結(jié)相關(guān),當(dāng)以養(yǎng)陰益氣為主,配合利濕[15]。銀杏內(nèi)酯B 是銀杏葉提取物的主要活性成分,目前已被用作抗癌劑,例如王懷安等[16]證明了銀杏內(nèi)酯B 可以用于治療多種惡性腫瘤,Kawasaki等[17]研究發(fā)現(xiàn)銀杏內(nèi)酯B可以增強(qiáng)口腔癌患者的化療效果,Zhi等[18]報(bào)道銀杏內(nèi)酯B 可抑制膀胱癌細(xì)胞的侵襲能力,說(shuō)明銀杏內(nèi)酯B具有抑癌作用,然而,其對(duì)膀胱癌的抑癌作用機(jī)制仍尚不完全清楚,因此本實(shí)驗(yàn)研究了銀杏內(nèi)酯B對(duì)膀胱癌細(xì)胞的惡性生物學(xué)行為,并發(fā)現(xiàn)與對(duì)照組相比,中/高濃度實(shí)驗(yàn)組和陽(yáng)性藥物組細(xì)胞活力、增殖率顯著降低,細(xì)胞凋亡率顯著升高,提示中/高濃度實(shí)驗(yàn)組可抑制J82細(xì)胞增殖促進(jìn)J82細(xì)胞凋亡;與陽(yáng)性藥物組相比,低/中/高濃度實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞活力和增殖率升高,細(xì)胞凋亡率降低,但高濃度實(shí)驗(yàn)組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,說(shuō)明了高濃度實(shí)驗(yàn)組與陽(yáng)性藥物組對(duì)J82細(xì)胞的抑增殖和促凋亡作用相當(dāng),所以選擇高濃度實(shí)驗(yàn)組進(jìn)行后續(xù)通路驗(yàn)證實(shí)驗(yàn),以上結(jié)果證明了銀杏內(nèi)酯B可以抑制J82細(xì)胞的增殖促進(jìn)其凋亡,有良好的醫(yī)學(xué)前景。腫瘤生長(zhǎng)是細(xì)胞過(guò)度增殖和逃避凋亡的結(jié)果。Cyclin D1是一種在細(xì)胞周期進(jìn)程中起關(guān)鍵作用的細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶調(diào)節(jié)蛋白,可作為膀胱癌的增殖標(biāo)志物[19]。Caspase-3的過(guò)表達(dá)被認(rèn)為與膀胱組織的腫瘤發(fā)生和凋亡密切相關(guān)[20]。Cyclin D1 和Caspase-3 作為膀胱癌增殖和凋亡標(biāo)志性蛋白,在膀胱癌細(xì)胞增殖和凋亡中發(fā)揮重要作用,因此,我們檢測(cè)了Caspase-3 和Cyclin D1 的mRNA 和蛋白表達(dá),結(jié)果發(fā)現(xiàn),與對(duì)照組相比,銀杏內(nèi)酯B組Caspase-3 mRNA 和蛋白表達(dá)水平顯著升高,而Cyclin D1 mRNA 和蛋白表達(dá)水平顯著降低,提示銀杏內(nèi)酯B可以抑制J82細(xì)胞的Cyclin D1表達(dá),促進(jìn)Caspase-3表達(dá)。綜上,銀杏內(nèi)酯B可能是通過(guò)下調(diào)Cyclin D1、上調(diào)Caspase-3 來(lái)抑制J82細(xì)胞的增殖促進(jìn)其凋亡的。

NF-κB通路已廣泛參與癌癥的發(fā)展和進(jìn)展,可參與調(diào)控多種癌細(xì)胞生長(zhǎng)和分化[21]。靜息狀態(tài)下,存在于胞漿中,與IκBα結(jié)合,當(dāng)炎癥或惡性行為發(fā)生時(shí),特異性激酶可將IκBα磷酸化使其快速被蛋白小體降解,NF-KB 與IκB 解離并釋出,進(jìn)入細(xì)胞核與靶基因啟動(dòng)子區(qū)特定結(jié)合序列結(jié)合,增加相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄速度。而銀杏內(nèi)酯B 具有抗炎和抗癌等生物活性,可抑制炎性介質(zhì)釋放和腫瘤細(xì)胞的遷移、侵襲,從而阻斷NF-KB 通路的活化。因此,抑制NFKB為抗炎藥銀杏內(nèi)酯B 重要的作用靶點(diǎn)。NF-κB信號(hào)通路還參與膀胱癌的發(fā)生、發(fā)展,阻斷NF-k B可抑制膀胱癌的生長(zhǎng)[22]。盧友路[23]報(bào)道尼古丁通過(guò)激活NF-κB通路促進(jìn)膀胱癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲,還有研究表明,銀杏內(nèi)酯通過(guò)抑制NF-κB 信號(hào)通路對(duì)阿爾茨海默病細(xì)胞具有保護(hù)作用[24],銀杏內(nèi)酯B通過(guò)抑制NF-κB 信號(hào)通路抑制小膠質(zhì)細(xì)胞的活化[25]。但關(guān)于銀杏內(nèi)酯B 對(duì)膀胱癌細(xì)胞中NFκB信號(hào)通路的調(diào)控作用未見報(bào)道,因此本研究分析了銀杏內(nèi)酯B對(duì)NF-κB通路關(guān)鍵蛋白的表達(dá)水平,結(jié)果顯示,與對(duì)照組相比,銀杏內(nèi)酯B 組p-IκBα和p-NF-κB p65蛋白表達(dá)水平顯著降低,提示銀杏內(nèi)酯B可能抑制了NF-κB 通路的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo),與王瑾等[26]的研究相符。也進(jìn)一步驗(yàn)證了NF-k B 通路在各種細(xì)胞進(jìn)程中起重要作用。在銀杏內(nèi)酯B 組中加入NF-κB 信號(hào)通路抑制劑和激活劑進(jìn)行NF-κB通路驗(yàn)證實(shí)驗(yàn),發(fā)現(xiàn)與銀杏內(nèi)酯B 組相比,激活劑組細(xì)胞凋亡率及Caspase-3 mRNA 和蛋白表達(dá)水平顯著降低,細(xì)胞活力、增殖率、Cyclin D1 mRNA和蛋白以及p-IκBα、p-NF-κB p65蛋白表達(dá)水平顯著升高,抑制劑組的這些指標(biāo)變化趨勢(shì)與激活劑組相反,提示銀杏內(nèi)酯B是通過(guò)抑制NF-κB信號(hào)通路下調(diào)Cyclin D1、上調(diào)Caspase-3進(jìn)而抑制細(xì)胞的增殖誘導(dǎo)其凋亡。

綜上所述,銀杏內(nèi)酯B 可抑制人膀胱癌J82細(xì)胞增殖促進(jìn)其凋亡,其作用機(jī)制與抑制NF-κB信號(hào)通路的活化有關(guān)。本研究從細(xì)胞功能方面揭示了銀杏內(nèi)酯B對(duì)人膀胱癌系J82細(xì)胞增殖和凋亡的作用以及在NF-κB信號(hào)通路上的機(jī)制研究,但是本文僅在NF-κB信號(hào)通路上進(jìn)行分析,是否存在其他通路參與膀胱癌的生物學(xué)過(guò)程還未研究。