張挺 管波 王浩宇 單衛(wèi)民 王德彪

膀胱尿路上皮癌(bladder urothelial carcinoma,BLCA)在泌尿系統(tǒng)腫瘤中的發(fā)病率較高,約占全球腫瘤發(fā)病率的3%,在發(fā)達(dá)國家尤為普遍[1]。相當(dāng)一部分BLCA患者有接觸致癌物質(zhì)病史,其中危害最大的是煙草,吸煙后患膀胱癌的相對風(fēng)險僅次于肺癌[2]。已有研究證明戒煙可顯著降低罹患膀胱癌的風(fēng)險[1]。約有7%的BLCA患者因BLCA遺傳易感性而患病[3]。

DNA甲基化作為一種特殊的表觀遺傳事件在疾病的發(fā)生、發(fā)展中具有重要作用。表觀遺傳學(xué)是一種在不改變基因序列的情況下,在細(xì)胞增殖和發(fā)育過程中發(fā)生的穩(wěn)定變化,與基因表達(dá)潛能相關(guān)。DNA 甲基化是在DNA堿基的C5位置上插入1個CH3基團(tuán)導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄抑制,進(jìn)一步阻止抑癌基因的表達(dá)等,可能是通過影響細(xì)胞分化過程的可塑性而導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生[4]。

本研究利用癌癥基因組圖譜(The Cancer Genome Atlas,TCGA)數(shù)據(jù)庫檢索并篩選了BLCA轉(zhuǎn)錄組和表觀基因組數(shù)據(jù),同時進(jìn)行整合分析,鑒定出一系列與BLCA預(yù)后相關(guān)的DNA甲基化驅(qū)動基因,并基于此構(gòu)建了BLCA分子亞型和預(yù)后分子模型,為BLCA 患者的預(yù)后風(fēng)險分層、預(yù)后評估及治療策略的選擇提供了新的參考指標(biāo),具有一定的潛在應(yīng)用價值。

對象與方法

一、研究對象

從TCGA 數(shù)據(jù)庫(https://www.cancer.gov)中檢索并下載了411例BLCA 患者的病理數(shù)據(jù)資料,其中包括417例BLCA 組織和21 例正常膀胱組織的甲基化數(shù)據(jù)、414例BLCA 組織和19例正常膀胱組織的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)(部分患者有多個組織樣本數(shù)據(jù)),同時下載了這411例BLCA 患者的臨床數(shù)據(jù)資料,包括性別、年齡、種族、病理分期、吸煙狀態(tài)、放療、化療情況及存活狀態(tài)等。

二、研究方法

1.BLCA 甲基化驅(qū)動基因的篩選:使用R 語言Methyl Mix包篩選甲基化驅(qū)動基因,使用R 語言Met hyl Mix包綜合分析兩組患者的基因表達(dá)數(shù)據(jù)和DNA 甲基化數(shù)據(jù),按照基因表達(dá)數(shù)據(jù)和DNA 甲基化數(shù)據(jù)相關(guān)性小于-0.3、以矯正后P值小于0.05為標(biāo)準(zhǔn),篩選BLCA 甲基化驅(qū)動基因。

2.基于BLCA 甲基化驅(qū)動甲基化程度構(gòu)建分子亞型:利用R 語言中NMF包對BLCA 甲基化驅(qū)動基因表達(dá)進(jìn)行無監(jiān)督聚類分析,構(gòu)建基于甲基化驅(qū)動基因的BLCA 分子亞型,并對不同亞組的預(yù)后進(jìn)行比較,探索不同亞型之間腫瘤微環(huán)境的差異。使用“ESTI MATE”算法[5]分析每個樣本的腫瘤微環(huán)境情況,包括免疫細(xì)胞浸潤水平(免疫評分)、基質(zhì)含量(基質(zhì)評分)、總評分(免疫評分與基質(zhì)評分之和)及腫瘤純凈度,比較各免疫亞組之間腫瘤微環(huán)境情況。使用CIBERSORT 軟件[6]計算免疫細(xì)胞含量,為了結(jié)果準(zhǔn)確,設(shè)定模擬次數(shù)為1 000次,采用Kr uskal-Wallis秩和檢驗對P<0.05作為樣本成功反卷積的判斷依據(jù),分析各免疫亞組中免疫細(xì)胞亞群的含量。

3.基于BLCA 甲基化驅(qū)動基因構(gòu)建預(yù)后模型:采用LASSO 回歸模型進(jìn)行BLCA 預(yù)后相關(guān)DNA甲基化驅(qū)動基因標(biāo)志物的篩選,并通過多因素Cox的系數(shù)構(gòu)建分子模型:分子標(biāo)簽值Risk score=βgene1×DMLgene1+βgene2×DMLgene2+……+βgene 4×DMLgene4[DNA 甲基化水平(DNA met hylation level,DML);β:回歸相關(guān)系數(shù)]。代入相關(guān)數(shù)據(jù)后,計算分子模型得分。分別通過分子模型得分的中位數(shù)將BLCA 患者劃分為高甲基化組和低甲基化組。

結(jié) 果

一、納入對象的基本情況

病例總數(shù)為411例,其中男303例(73.72%),女108例(26.28%),患者基本特征見表1。

表1 TCGA 數(shù)據(jù)庫中BLCA 患者的基本特征[例(%)]

二、BLCA 甲基化驅(qū)動基因篩選結(jié)果

根據(jù)BLCA 表達(dá)譜數(shù)據(jù)和甲基化數(shù)據(jù),按照相關(guān)性小于-0.3,矯正后P值小于0.05的標(biāo)準(zhǔn),篩選后得到190種BLCA 甲基化驅(qū)動基因,以此繪制甲基化驅(qū)動基因甲基化程度熱圖(圖1)。

圖1 190種BLCA 甲基化驅(qū)動基因甲基化程度熱圖

三、BLCA 分子亞型的構(gòu)建

將190種甲基化驅(qū)動基因的甲基化數(shù)據(jù)與生存數(shù)據(jù)結(jié)合,進(jìn)行單因素Cox 分析后得到26 種與BLCA 預(yù)后相關(guān)的基因(P<0.05)。將這26種甲基化 驅(qū) 動 基 因(ARHGDIB、LURAP1、WBP1L、GST M2、EHF、PAXIP1-AS1、CCRL2、ELF3、LINC00885、FZD7、POF1B、TPM1、 ARL14、SOWA HC、KL HDC7 A、ITGA5、AGR2、TCEAL7、CYP2J2、 DAPP1、 KRT8、 AXIN2、 IDH2、T MEM101、BH MT2、CLDN4)的甲基化數(shù)據(jù)通過NMF聚類分析,可將患者分為2～9個亞組(圖2)。

圖2 基于BLCA 甲基化驅(qū)動基因的NNF聚類分析

根據(jù)NMF 聚類分組分析結(jié)果,聚類分析組內(nèi)一致性高(紅色模塊顏色純度高)、組間差異大(藍(lán)色模塊顏色純度高)、且亞組之間的樣本量差異不大,可以將411例BLCA 患者分為2個亞組。結(jié)合411例BLCA患者的生存數(shù)據(jù)我們進(jìn)一步比較分為2個亞組、3個亞組、4個亞組下不同亞組之間的生存曲線的差別,發(fā)現(xiàn)分為2個亞組與3個亞組的預(yù)后均差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.004,P=0.017)(圖3)。

圖3 不同亞組之間預(yù)后比較

為了進(jìn)一步探索亞組之間的腫瘤微環(huán)境的差異,本研究以分為2個亞組的BLCA 患者作為研究對象,進(jìn)一步比較了2個亞組間腫瘤微環(huán)境的差異(圖4A～D),兩個亞組間基質(zhì)細(xì)胞評分、免疫細(xì)胞評分、綜合評分之間均差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001)(圖4D);并比較了兩個亞組中人類白細(xì)胞抗原相關(guān)基因表達(dá)和免疫細(xì)胞浸潤的差異(圖4E～F)。

圖4 基于甲基化驅(qū)動基因BLCA 患者分為2種亞組腫瘤微環(huán)境分析

四、構(gòu)建BLCA 甲基化驅(qū)動基因預(yù)后分子模型

將單因素回歸分析篩選出的26種與BLCA 預(yù)后相關(guān)的基因進(jìn)一步做LASSO 及多因素Cox 分析,最終從中篩選出4種與BLCA 預(yù)后相關(guān)的甲基化驅(qū)動基因(表2,圖5,6 A～D),分別為ARHGDIB、IDH2、LURAP1、PAXIP1-AS1,利用這4種甲基化驅(qū)動基因聯(lián)合回歸系數(shù)構(gòu)建預(yù)后分子模型,Risk score=βgene1×DMLgene1+βgene2×DMLgene2+……+βgene4×DMLgene4。代入相關(guān)數(shù)據(jù)后,計算分子模型值。通過分子模型得分的中位數(shù)將患者劃分為高分組和低分組,結(jié)合TCGA 中患者生存時間及生存狀態(tài)在訓(xùn)練組和測試組分別繪制生存曲線,并比較高分組和低分組生存曲線差異有無統(tǒng)計學(xué)意義(圖6E),并以1年、3年、5年生存期繪制受試者工作特征(receiver operating characteristic,ROC)曲線(圖6F)。

圖5 LASSO 回歸篩選BLCA 預(yù)后甲基驅(qū)動基因

圖6 分子模型中4種基因甲基化程度與表達(dá)程度相關(guān)性和分子模型生存曲線、ROC曲線

表2 篩選出的4種BLCA 預(yù)后相關(guān)甲基化驅(qū)動基因單變量及多變量Cox分析結(jié)果

討 論

BLCA 是全球十大最常見的癌癥之一,其發(fā)病率逐步上升,尤其在發(fā)達(dá)國家[7]。男性患者的發(fā)病率是女性的4倍多,這種性別差異可能主要與吸煙偏好有關(guān)[8]。DNA 甲基化是一種重要的表觀遺傳調(diào)控機制,它指的是在甲基轉(zhuǎn)移酶催化下,活性甲基轉(zhuǎn)移到目標(biāo)DNA 而不改變DNA 序列組成[9],甲基化過程以s-腺苷甲硫氨酸為甲基供體,在DNA 中加入甲基(CH3)的表觀遺傳過程,這個過程可以發(fā)生在腺嘌呤的N6、鳥嘌呤的N7、胞嘧啶的N4和C5位置[10]。當(dāng)基因組DNA 的甲基化狀態(tài)發(fā)生改變時,會導(dǎo)致機體染色體不穩(wěn)定或基因表達(dá)異常,在腫瘤的發(fā)生中起到重要作用。癌癥中許多基因在癌癥中的表達(dá)沉默與DNA 甲基化有關(guān),腫瘤基因組中存在許多異常的甲基化改變,越來越多的證據(jù)表明DNA 甲基化在腫瘤中起到重要作用,例如乳腺癌中的BRCA1和FOXO3a[11],宮頸癌中的SET9[12],腎癌中的VHL[13]。DNA 甲基化在BLCA 的發(fā)生、發(fā)展過程中起著重要作用,有研究報道DNA 甲基化可以作為肌層浸潤型BLCA 的預(yù)后生物標(biāo)志物[14],DNA甲基化測試可以幫助尿路上皮癌患者的術(shù)后管理[15],某些基因的甲基化水平與BLCA 患者的臨床病理特征密切相關(guān)[16]。此外,還有研究發(fā)現(xiàn)DNA 甲基化抑制劑阿扎胞苷通過誘導(dǎo)凋亡和抑制腫瘤細(xì)胞增殖,在BLCA的治療中起到一定作用[17]。

本研究基于BLCA 組織的轉(zhuǎn)錄組和表觀基因組數(shù)據(jù),采用整合組學(xué)的分析策略,發(fā)現(xiàn)了與BLCA相關(guān)的190種甲基化驅(qū)動基因,結(jié)合患者的生存數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)有26種基因甲基化程度與BLCA 預(yù)后相關(guān)。基于這26種甲基化驅(qū)動基因的甲基化程度構(gòu)建了BLCA 分子亞型,并將BLCA 患者分為兩個不同的分子亞型,兩個亞型的患者具有不同的預(yù)后。進(jìn)一步探索不同亞組之間的腫瘤微環(huán)境,發(fā)現(xiàn)這兩個亞組腫瘤微環(huán)境方面有明顯差異。腫瘤微環(huán)境是腫瘤細(xì)胞所處的細(xì)胞環(huán)境,包括細(xì)胞外基質(zhì)、可溶性分子和腫瘤基質(zhì)細(xì)胞。一旦形成腫瘤微環(huán)境,免疫細(xì)胞如T 細(xì)胞、髓源抑制性細(xì)胞和巨噬細(xì)胞會被募集并構(gòu)成腫瘤微環(huán)境。在腫瘤微環(huán)境中,免疫細(xì)胞和基質(zhì)細(xì)胞是除腫瘤細(xì)胞以外的兩種主要類型的細(xì)胞,并且已被提出對于腫瘤的診斷和預(yù)后評估是有價值的[18]。本研究進(jìn)一步基于26種基因甲基化程度建立了一個BLCA 預(yù)后預(yù)測模型,為BLCA 患者的生存預(yù)后評估提供了候選參考標(biāo)準(zhǔn),將有助于指導(dǎo)臨床治療策略的選擇。模型中包括4種甲基化驅(qū)動基 因,分 別 為ARHGDIB、IDH2、LURAP1 和PAXIP1-AS1。ARHGDIB 是一種蛋白質(zhì)編碼基因,參與多種細(xì)胞事件,包括細(xì)胞信號、增殖和細(xì)胞骨架組織等,在最近的一項研究中發(fā)現(xiàn)FOXA1-KDM6A-ARHGDIB軸在抑制BLCA 等惡性腫瘤中起關(guān)鍵作用[19];IDH2是一種蛋白質(zhì)編碼基因,參與呼吸電子傳遞、化學(xué)滲透耦合合成ATP、解偶聯(lián)蛋白產(chǎn)熱和新陳代謝等途徑,尚未在BLCA 中報道,但有研究發(fā)現(xiàn)IDH2整合的胞質(zhì)ME1對于腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移至關(guān)重要[20];LURAP1是一個蛋白質(zhì)編碼基因,參與I-kappaB kinase/NF-kappaB信號通路的陽性調(diào)節(jié)及細(xì)胞因子的陽性表達(dá),研究表明LURAP1在細(xì)胞黏附和極化細(xì)胞行為中發(fā)揮著重要作用[21];PAXIP1-AS1 是一種lnc RNA,研究表明lnc RNA PAXIP1-AS1通過靶向mi R-6744-5p/PCBP2軸促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞的增殖、遷移、EMT和凋亡[22]。

綜上所述,本研究通過分析TCGA 數(shù)據(jù)庫,發(fā)現(xiàn)與BLCA 相關(guān)的190種甲基化驅(qū)動基因,并構(gòu)建了新的BLCA 預(yù)后分子模型和新的分子亞型,預(yù)后分子模型能夠很好的預(yù)測BLCA 患者預(yù)后,不同的亞組具有不同的預(yù)后。這些結(jié)果均表明,BLCA 的甲基化驅(qū)動基因在BLCA 的預(yù)后中發(fā)揮了重要的作用。