楊維清 楊龐

膀胱癌(bladder cancer,BC)好發(fā)于老年患者,吸煙是導(dǎo)致BC 發(fā)病率增加最常見的原因。此外,吸煙程度可能與BC 的侵襲性有關(guān),重度吸煙者更有可能患高級別腫瘤和肌層浸潤性疾病[1]。侵犯膀胱逼尿肌的BC被稱為肌層浸潤性膀胱癌(muscleinvasive bladder cancer,MIBC),其具有更高的轉(zhuǎn)移至淋巴結(jié)和其他器官的傾向,5 年生存率約為60%～70%[2]。MIBC約占BC新診斷病例的20%,盡管進(jìn)行了根治性膀胱切除術(shù)和盆腔淋巴結(jié)清掃,約50%的患者最終會因為擴(kuò)散的微轉(zhuǎn)移而在遠(yuǎn)處發(fā)生疾病[2-3]。因此,找到合適而準(zhǔn)確的MIBC的生物標(biāo)志物將有助于改善MIBC患者的預(yù)后狀況。

在調(diào)節(jié)T 細(xì)胞免疫反應(yīng)方面很重要的B7 家族,因其對癌癥有潛在的治療作用而被重視。CD276作為B7家族的一員,作為T 細(xì)胞抑制劑可促進(jìn)腫瘤的增殖和侵襲。在大多數(shù)正常組織中,CD276通常以相對低的水平表達(dá)。相反,在惡性腫瘤組織中,CD276 的表達(dá)水平上調(diào)。此外,CD276的高表達(dá)已被發(fā)現(xiàn)與癌癥患者較差的預(yù)后相關(guān),這類腫瘤研究包括乳腺癌、宮頸癌、結(jié)直腸癌、食管癌等[4-5]。然而,CD276 在MIBC 中的臨床意義和預(yù)后價值在很大程度上仍不清楚。因此,確定可靠的生物標(biāo)志物對改善MIBC的預(yù)后至關(guān)重要。本研究旨在利用癌癥基因組圖譜(The Cancer Geno me Atlas,TCGA)數(shù)據(jù)庫探索CD276表達(dá)在MIBC 中的臨床意義和預(yù)后價值,來為臨床判斷MIBC 的生存預(yù)后提供一個可靠的分子標(biāo)志物。同時我們還嘗試使用基因集富集分析(Gene Set Enrich ment Analysis,GSEA)進(jìn)一步評估參與MIBC 發(fā)病機(jī)制相關(guān)的CD276調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的生物途徑。

對象與方法

一、數(shù)據(jù)收集

我們從TCGA 數(shù)據(jù)庫(https://portal.gdc.cancer.gov/repositor y)下載了412例MIBC患者的表達(dá)數(shù)據(jù)和mRNA 表達(dá)譜(其中包括19例正常樣本)以及與生存時間有關(guān)的臨床信息。我們使用箱式圖來顯示離散變量的表達(dá)差異。412 例患者的RNA-Seq基因表達(dá)HTSeq-計數(shù)數(shù)據(jù)被用于進(jìn)一步分析研究。

二、基因富集分析

GSEA 是一種計算方法,用于檢測先驗定義的基因集是否在高表達(dá)組和低表達(dá)組之間有統(tǒng)計學(xué)意義[5]。表型標(biāo)簽為CD276-高和CD276-低。每次分析都要進(jìn)行1 000次基因組排列組合。通常情況下P<0.05 和錯誤發(fā)現(xiàn)率(f alse discover y rate,FDR)<0.25的基因組被認(rèn)為是富集基因。

三、統(tǒng)計學(xué)方法

使用t檢驗來分析CD276在正常組織和腫瘤組織中的差異表達(dá)。使用Logistic回歸評價臨床因素與CD276表達(dá)之間的相關(guān)性。采用單因素Cox回歸確定MIBC患者總生存期相關(guān)的臨床因素。采用多因素Cox分析探索CD276表達(dá)與其他臨床特征(年齡、性別、分期、分級、TNM 分期)在患者預(yù)后中的作用。根據(jù)中位風(fēng)險評分將CD276分為高表達(dá)和低表達(dá)。使用R 軟件(v4.1.3)進(jìn)行統(tǒng)計分析。

四、使用人類蛋白質(zhì)圖譜數(shù)據(jù)庫進(jìn)行驗證

人類蛋白質(zhì)圖譜(http://www.pr oteinatlas.org/)是一種病理學(xué)工具,可提供各種人類蛋白的多種表達(dá)譜。因此,我們利用人類蛋白質(zhì)圖譜數(shù)據(jù)庫的免疫組化數(shù)據(jù)比較了CD276在正常和MIBC 組織中的蛋白表達(dá)。

結(jié) 果

一、CD276表達(dá)與臨床參數(shù)之間的相關(guān)性

通過分析CD276在正常組織和腫瘤組織之間的差異表達(dá),我們發(fā)現(xiàn)腫瘤組織相比正常組織中CD276表達(dá)明顯升高(P<0.001)。進(jìn)一步研究來自TCGA 的412例MIBC患者的臨床數(shù)據(jù),包括患者的年齡、性別、臨床分期、臨床分級、TNM 分期、生存狀態(tài)和生存時間,我們發(fā)現(xiàn)CD276表達(dá)與臨床分期(P=0.022)、臨床分級(P<0.001)、年齡(P=0.003)和N 分期(P=0.008)顯著相關(guān)。

采用Logistic回歸分析發(fā)現(xiàn),CD276的高表達(dá)與不良預(yù)后臨床病理變量有關(guān),見表1。MIBC 中CD276的高表達(dá)與高臨床分期(Ⅳ期與Ⅱ期,P=0.014)、高齡(≥65歲與<65歲,P=0.008)、高臨床分級(高級別與低級別,P=0.002)顯著相關(guān)。這些發(fā)現(xiàn)揭示了CD276高表達(dá)的患者比CD276低表達(dá)的患者疾病有進(jìn)展到更晚期的趨勢。

表1 CD276表達(dá)與臨床病理特征的Logistic回歸分析

為了進(jìn)一步檢測CD276蛋白的表達(dá),我們從人類蛋白質(zhì)圖譜中檢索了免疫組化染色數(shù)據(jù)。在正常膀胱組織中,尿路上皮細(xì)胞通常具有中度的CD276染色,然而,MIBC組織則具有較強(qiáng)的CD276染色,證實了腫瘤組織相比正常組織中CD276表達(dá)明顯升高,見圖1。

圖1 使用人類蛋白質(zhì)圖譜數(shù)據(jù)庫驗證CD276在MIBC和正常組織中的蛋白表達(dá)

二、生存和多變量分析

如圖2所示,CD276的高表達(dá)與總生存率低密切相關(guān)(P=0.008)。單變量分析表明,CD276高表達(dá)與總生存期差顯著相關(guān)(HR:1.385;95%CI:1.046～1.836;P=0.023)。與不良生存相關(guān)的其他臨床因素包括年齡、臨床分期、T 分期和N 分期,見表2。將這些變量納入多變量分析中。多變量Cox分析顯示,CD276高表達(dá)仍然是MIBC 患者總生存期的獨立風(fēng)險因素(HR:1.371;95%CI:1.018～1.846,P=0.037),另外還包括年齡(HR:1.041;95%CI:1.021～1.060,P<0.001)和T 期(HR:1.410;95%CI:1.024～1.943,P=0.035),見表2和圖3。

圖2 TCGA 數(shù)據(jù)庫中MIBC患者的CD276表達(dá)和總生存率

圖3 多變量回歸分析森林圖

表2 CD276表達(dá)與MIBC患者總生存率關(guān)系的單變量和多變量回歸分析

三、GSEA 富集確定與CD276相關(guān)的信號通路

為了篩選在MIBC 中差異激活的潛在信號通路,我們進(jìn)行了GSEA 富集分析,分別比較了CD276在MIBC中高表達(dá)和低表達(dá)相關(guān)的數(shù)據(jù)集。根據(jù)其標(biāo)準(zhǔn)化富集評分確定了與腫瘤相關(guān)的最顯著富集的信號通路。參與腫瘤相關(guān)通路、膀胱癌、細(xì)胞黏附分子(CA Ms)、細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)受體相互作用、Wnt信號通路、趨化因子信號通路以及MAPK信號通路相關(guān)的基因集與CD276高表達(dá)之間存在差異相關(guān)性。

討 論

CD276在許多腫瘤中過度表達(dá),并經(jīng)常與不良預(yù)后相關(guān)[6-7]。CD276 是B7 家族中的一個獨立于抗原的共刺激配體成員。在小鼠中,CD276與表達(dá)在骨髓細(xì)胞上的觸發(fā)受體如轉(zhuǎn)錄本2(TLT-2)蛋白結(jié)合,調(diào)節(jié)T 細(xì)胞反應(yīng)。CD276的表達(dá)升高會增強(qiáng)小鼠中TLT-2介導(dǎo)的CD8+細(xì)胞毒性T 淋巴細(xì)胞對腫瘤的反應(yīng)[8]。在另一項研究中,CD276通過阻斷CD4+Th1-的激活從而阻止了抗腫瘤反應(yīng)的激活[9]。這些研究結(jié)果為揭示CD276與腫瘤進(jìn)展之間的關(guān)系提供一定依據(jù),或許可以成為抗腫瘤的新方向。然而,CD276表達(dá)作為MIBC 生物標(biāo)志物的臨床意義尚未得到充分研究。本研究中,對來自TCGA 的高通量RNA 測序數(shù)據(jù)進(jìn)行生物信息學(xué)分析,發(fā)現(xiàn)與正常膀胱組織相比,MIBC 中CD276 表達(dá)明顯增加,這與之前的研究結(jié)果一致[9]。CD276在MIBC樣本中的表達(dá)水平明顯高于正常組織。結(jié)合我們在CD276 中的研究,表明CD276 在組織中的高表達(dá)水平可能與腫瘤進(jìn)展相關(guān)。

通過進(jìn)一步分析,我們發(fā)現(xiàn)CD276表達(dá)也與腫瘤分級、臨床分期、年齡和N 分期密切相關(guān)。先前的研究報道,CD276的高表達(dá)水平已被發(fā)現(xiàn)與癌癥患者較差的預(yù)后相關(guān),相關(guān)的腫瘤研究包括乳腺癌等[4-5],這與我們在MIBC患者中的結(jié)果一致。通過生存分析曲線發(fā)現(xiàn),CD276高表達(dá)與MIBC 患者預(yù)后不良有關(guān)。TCGA 數(shù)據(jù)庫的單因素和多因素Cox分析表明,CD276表達(dá)是MIBC 患者預(yù)后不良的潛在獨立標(biāo)志物。為了進(jìn)一步評估CD276 在MIBC中的作用,我們使用TCGA 數(shù)據(jù)進(jìn)行了GSEA 富集分析。GSEA 富集結(jié)果顯示,CD276的高表達(dá)參與腫瘤相關(guān)通路、膀胱癌、CA Ms、ECM 受體相互作用、Wnt信號通路、趨化因子信號通路以及MAPK 信號通路。

CA Ms存在于所有細(xì)胞表面,在細(xì)胞-細(xì)胞和細(xì)胞-ECM 相互作用中發(fā)揮作用。鈣黏蛋白、整合素、選擇素和免疫球蛋白家族的成員構(gòu)成了CA Ms的主要類別。CA Ms通過參與細(xì)胞和組織的構(gòu)成、細(xì)胞內(nèi)外之間的信號傳導(dǎo)、組織的損傷修復(fù)和傷口的愈合,提供了細(xì)胞外基質(zhì)和細(xì)胞骨架之間的機(jī)械聯(lián)系外。一般情況下,它們參與組織細(xì)胞的生長、增殖、空間組織和遷移等過程,因此在正常生理生長發(fā)育中發(fā)揮作用。這些過程也發(fā)生在病理狀態(tài)下,如傷口愈合、炎癥和腫瘤形成,尤其是在腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移過程中。在這些條件下,ECM 的各種成分發(fā)生改變,金屬蛋白酶也發(fā)生改變,其參與基質(zhì)重塑和其他過程,如生長因子的釋放[10-11]。不同類型的CA Ms不對稱地表達(dá)在內(nèi)皮細(xì)胞的管腔和非管腔區(qū),并在細(xì)胞遷移中發(fā)揮重要作用。除了在細(xì)胞-細(xì)胞或細(xì)胞-ECM 相互作用中的意義外,關(guān)于其參與血管生成和血管生成的體內(nèi)外實驗結(jié)果支持了新毛細(xì)血管的形成,同時還參與了血管和脈管生成,CA Ms可能是腫瘤血管生成的重要因素之一[12-13]。這說明CA Ms和ECM 與MIBC的浸潤生長和轉(zhuǎn)移有關(guān)。

免疫系統(tǒng)及其組分在抗腫瘤反應(yīng)中起重要作用。在另一方面,其產(chǎn)生的一些細(xì)胞介質(zhì),如趨化因子,可導(dǎo)致腫瘤進(jìn)展[14]。有證據(jù)表明趨化因子積極參與細(xì)胞間相互作用和腫瘤增殖、新生血管形成和腫瘤轉(zhuǎn)移的調(diào)節(jié),研究人員在MIBC 腫瘤組織中發(fā)現(xiàn)趨化因子可觸發(fā)免疫細(xì)胞包括髓源性抑制細(xì)胞和調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞的遷移和活化,從而有利于腫瘤的發(fā)生和進(jìn)展[15]。這與本研究結(jié)果一致。

與Wnt信號通路相關(guān)的成分和靶點可能是調(diào)節(jié)各種癌癥發(fā)生和進(jìn)展的重要因素,由于DNA 突變或甲基化導(dǎo)致的Wnt信號通路異常調(diào)節(jié)能夠誘導(dǎo)Wnt信號分子表達(dá)變化,這可能與MIBC的進(jìn)展有關(guān)[16]。越來越多的證據(jù)驗證了Wnt信號通路的異常激活在MIBC 病理過程中起著關(guān)鍵作用[17]。這些發(fā)現(xiàn)強(qiáng)調(diào)了Wnt信號通路的潛在價值,尤其是在MIBC的預(yù)后和治療中。MAPK 信號通路基本上調(diào)節(jié)惡性腫瘤細(xì)胞表型的所有方面,包括增殖、存活、遷移和侵襲[18]。有關(guān)研究證據(jù)表明MAPK 信號通路在MIBC 發(fā)病機(jī)制中被激活,通過調(diào)節(jié)ERK1/2 MAPK 和p38 MAPK 的過度表達(dá),來參與腫瘤細(xì)胞的增殖、周期調(diào)控和死亡[19]。說明MAPK 信號通路與MIBC的發(fā)病和進(jìn)展密切相關(guān),這同樣與我們的研究結(jié)果相符。通過抑制MAPK信號通路中相關(guān)蛋白的表達(dá),或許可以為MIBC 的治療提供一種選擇。另外,盡管本研究已經(jīng)證明CD276高表達(dá)是MIBC 預(yù)后的潛在獨立分子標(biāo)志物,但本研究仍具有一定局限性。未來需要開展進(jìn)一步的實驗來驗證CD276在MIBC 中表達(dá)的生物學(xué)意義。

綜上所述,基于對TCGA 數(shù)據(jù)庫的分析,我們提供的證據(jù)表明CD276的高表達(dá)與MIBC 的不良進(jìn)展相關(guān),可能是MIBC潛在的預(yù)后分子標(biāo)志物。