羅含歡 劉斌云 霍真 邊巴扎西 王倩 多布啦 尼瑪卓瑪 達(dá)珍 王寒 郭平平

摘要：目的 研究西藏地區(qū)結(jié)直腸癌中SWI/SNF 相關(guān)、基質(zhì)相關(guān)、肌動(dòng)蛋白依賴性染色質(zhì)調(diào)節(jié)因子A 亞科成員4 （SMARCA4）/Brahma相關(guān)基因1、V-raf鼠類肉瘤病毒癌基因同源物B（BRAF）、P53、程序性死亡受體1（PD-1）及程序性死亡配體1（PD-L1）免疫組織化學(xué)表達(dá)和BRAF、神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子酪氨酸受體激酶（NTRK）基因改變情況，為西藏地區(qū)結(jié)直腸癌患者的靶向治療及免疫治療提供依據(jù)。方法 收集2015年1月至2021年7月西藏自治區(qū)人民醫(yī)院經(jīng)手術(shù)切除病理確診為結(jié)直腸癌病例64例，全部病例均進(jìn)行SMARCA4、BRAF、P53、PD-1、PD-L1免疫組織化學(xué)染色和NTRK1、NTRK2、NTRK3融合基因熒光原位雜交檢測(cè)及BRAF V600E基因突變PCR檢測(cè)。結(jié)果 64例結(jié)直腸癌病例男女比例1.21∶1，平均年齡（56.59±13.27）歲；46例（71.88%）位于結(jié)腸，18例（28.12%）位于直腸；60例（93.75%）為腺癌，4例（6.25%）為其他類型；11例（17.19%）為T1或T2期，53例（82.81%）為T3或T4期；24例（37.50%）出現(xiàn)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。免疫組織化學(xué)方面，64例中1例（1.56%）SMARCA4部分腫瘤細(xì)胞表達(dá)減弱或缺失，4例（6.25%）BRAF腫瘤細(xì)胞陽(yáng)性表達(dá)，35例（54.69%）P53為突變型表達(dá)；45例（70.31%）PD-1腫瘤相關(guān)免疫細(xì)胞陽(yáng)性比例分?jǐn)?shù)<10%，19例（29.69%）≥10%；52例（81.25%）PD-L1聯(lián)合陽(yáng)性分?jǐn)?shù)<10，12例（18.75%）≥10。64例NTRK1、NTRK2、NTRK3融合基因檢測(cè)均為陰性；4例（6.25%）檢測(cè)到BRAF V600E基因突變；1例SMARCA4表達(dá)缺失病例未檢測(cè)到SMARCA4基因改變。PD-L1的表達(dá)與錯(cuò)配修復(fù)缺陷/高度微衛(wèi)星不穩(wěn)定和PD-1的高表達(dá)呈顯著正相關(guān)（χ²=10.223，P=0.001；χ²=11.979，P=0.001）。結(jié)論 西藏地區(qū)結(jié)直腸癌中較少出現(xiàn)SMARCA4表達(dá)減弱或缺失及NTRK融合基因改變，少數(shù)病例有BRAF V600E基因突變，Pan-TRK和BRAF免疫組織化學(xué)可作為NTRK融合基因及BRAF基因突變的初篩方法。錯(cuò)配修復(fù)缺陷/高度微衛(wèi)星不穩(wěn)定的病例中更容易出現(xiàn)PD-L1蛋白高表達(dá)，這部分患者有望獲益于免疫治療。P53突變與PD-L1表達(dá)無相關(guān)性，PD-1的高表達(dá)和PD-L1的高表達(dá)呈正相關(guān)。

關(guān)鍵詞：西藏地區(qū)；結(jié)直腸癌；SWI/SNF 相關(guān)、基質(zhì)相關(guān)、肌動(dòng)蛋白依賴性染色質(zhì)調(diào)節(jié)因子A 亞科成員 4；程序性死亡受體1；程序性死亡配體1；V-raf鼠類肉瘤病毒癌基因同源物B；神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子酪氨酸受體激酶

中圖分類號(hào)： R735.3+4文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼： A文章編號(hào)：1000-503X（2024）02-0184-09

DOI：10.3881/j.issn.1000-503X.15852

Detection and Significance of Molecular Markers in Immunotherapy and Targeted Therapy of Colorectal Cancer in Tibet

LUO Hanhuan¹，LIU Binyun²，HUO Zhen³，BIANbazhaxi⁴，WANG Qian¹，DUObula¹，NImazhuoma¹，DA Zhen¹，WANG Han¹，GUO Pingping¹

¹Department of Pathology，Tibet Autonomous Region Peoples Hospital，Lhasa 850000，China

²High Altitude Medical Research Institute of Tibet Autonomous Region，Lhasa 850000，China

³Department of Pathology，PUMC Hospital，CAMS and PUMC，Beijing 100730，China

⁴Department of General Surgery，Tibet Autonomous Region Peoples Hospital，Lhasa 850000，China

Corresponding author：HUO Zhen Tel：010-69159365，E-mail：huozhen1976@126.com

ABSTRACT：Objective To study the expression of SWI/SNF-related，matrix-associated，actin-dependent regulator of chromatin，subfamily A，member 4（SMARCA4）/Brahma-related gene 1，V-raf murine sarcoma viral oncogene homolog B（BRAF），P53，programmed cell death protein-1（PD-1），and programmed death-ligand 1（PD-L1），and changes in the expression of BRAF and neurotrophic tyrosine receptor kinase（NTRK） in the patients with colorectal cancer in Tibet，thereby providing a basis for targeted therapy and immunotherapy for this disease in Tibet.Methods A total of 64 patients with colorectal cancer resected in the Tibet Autonomous Region Peoples Hospital from January 2015 to July 2021 were enrolled in this study.The expression of SMARCA4，BRAF，P53，PD-1，and PD-L1 was detected by immunohistochemical staining.The gene fusion involving NTRK1，NTRK2，and NTRK3 was detected by fluorescence in situ hybridization，and the BRAF V600E gene mutation by polymerase chain reaction.Results The 64 patients with colorectal cancer were at a male-to-female ratio of 1.21∶1，with the mean age of （56.59±13.27） years.The tumors were located in the colon in 46（71.88%） patients and in the rectum in 18（28.12%） patients.Sixty（93.75%） patients presented adenocarcinoma，and 4（6.25%） patients presented other types of tumors.The patients in T1/T2 and T3/T4 phases accounted for 17.19%（n=11） and 82.81%（n=53），respectively.Lymph node metastasis occurred in 24（37.50%） patients.The immunohistochemical staining results showed partially down-regulated or absent expression of SMARCA4 in 1（1.56%） patient，positive BRAF expression in 4（6.25%） patients，and mutant expression of P53 in 35（54.69%） patients.The PD-1-expressing tumor associated immune cell was proportion score<10% in 45（70.31%） patients and≥10% in 19（29.69%） patients.The PD-L1 combined positive score was<10 in 52（81.25%） patients and≥10 in 12（18.75%） patients.The gene fusion of NTRK1，NTRK2，and NTRK3 was negative in all the patients，and BRAF V600E gene mutation was positive in 4（6.25%） patients.The SMARCA4 gene alteration was not detected in the patient with partial expression missing of SMARCA4.The PD-L1 combine positive score was correlated with the deficient mismatch repair（dMMR）/microsatellite instability-high （MSI-H） and the PD-1 expression （χ²=10.223，P=0.001；χ²=11.979，P=0.001）.Conclusions The down-regulated or absent SMARCA4 expression and NTRK gene fusion are rare in the patients with colorectal cancer in Tibet.A few patients present BRAF V600E gene mutations，and Pan-TRK and BRAF expression can be used for the primary screening of NTRK gene fusion and BRAF gene mutation.The patients with dMMR/MSI-H are prone to high expression of PD-L1 and expected to benefit from immunotherapy.No significant correlation exists between P53 mutation and PD-L1 expression.The high expression of PD-1 is positively correlated with the high expression of PD-L1.

Key words：Tibet；colorectal cancer；SWI/SNF-related，matrix-associated，actin-dependent regulator of chromatin，subfamily A，member 4；programmed cell death protein-1；programmed death-ligand 1；V-raf murine sarcoma viral oncogene homolog B；neurotrophic tyrosine receptor kinase

Acta Acad Med Sin，2024，46（2）：184-192

結(jié)直腸癌（colorectal cancer，CRC）是全球最常見的惡性腫瘤之一，在美國(guó)癌癥協(xié)會(huì)公布的《2021年度癌癥統(tǒng)計(jì)報(bào)告》中，CRC的發(fā)病率及病死率均位于第三^［1］。隨著生活水平的提高、飲食習(xí)慣和結(jié)構(gòu)的改變以及人口的老齡化，CRC在我國(guó)發(fā)病率呈逐年上升趨勢(shì)，中國(guó)2020年CRC的新發(fā)病例數(shù)為56萬(wàn)例，因CRC死亡病例達(dá)29萬(wàn)例^［2］。隨著分子檢測(cè)技術(shù)的發(fā)展，已證實(shí)CRC發(fā)病主要有兩種途徑：一是以癌基因和抑癌基因?yàn)榇淼娜旧w不穩(wěn)定性途徑，如癌基因KRAS、BRAF、PIK3等，以及抑癌基因P53、APC、DPC4等；二是因錯(cuò)配修復(fù)基因突變失活或甲基化失活導(dǎo)致的微衛(wèi)星不穩(wěn)定性途徑^［3-4］。近年，免疫檢查點(diǎn)抑制劑在惡性腫瘤治療方面取得突破性進(jìn)展，是目前的研究熱點(diǎn)之一。本研究納入2015年1月至2021年7月西藏自治區(qū)人民醫(yī)院經(jīng)手術(shù)切除病理確診的CRC病例，采用光鏡、免疫組織化學(xué)（immunohistochemistry，IHC）、熒光原位雜交（fluorescence in situ hybridization，F(xiàn)ISH）和PCR檢測(cè)等方法，總結(jié)分析西藏地區(qū)藏族人群CRC中SWI/SNF 相關(guān)、基質(zhì)相關(guān)、肌動(dòng)蛋白依賴性染色質(zhì)調(diào)節(jié)因子A 亞科成員 4/Brahma相關(guān)基因1（SWI/SNF-related，matrix-associated，actin-dependent regulator of chromatin，subfamily A，member 4/Brahma-related gene 1，SMARCA4/BRG1）、V-raf鼠類肉瘤病毒癌基因同源物B（V-raf murine sarcoma viral oncogene homolog B，BRAF）、P53、程序性死亡受體 1（programmed cell death protein-1，PD-1）、程序性死亡受體配體 1（programmed death-ligand 1，PD-L1）表達(dá)情況，及BRAF和神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子酪氨酸受體激酶（neurotrophic tyrosine receptor kinase，NTRK）基因改變情況，為西藏地區(qū)CRC患者的靶向治療及免疫治療提供依據(jù)。

1 資料和方法

1.1 資料來源

收集2015年1月至2021年7月西藏自治區(qū)人民醫(yī)院病理科存檔的經(jīng)手術(shù)切除確診的CRC病例64例，并查閱臨床和病理資料。本研究經(jīng)西藏自治區(qū)人民醫(yī)院倫理委員會(huì)審批（倫理審查編號(hào)：ME-TBHP-KJ-23-03），豁免知情同意。

1.2 方法

所有病理切片由2名病理科副主任及以上醫(yī)師重新閱片，按照2019年世界衛(wèi)生組織消化系統(tǒng)腫瘤分類標(biāo)準(zhǔn)^［5］進(jìn)行病理分型及分級(jí)。采用IHC EnVision法檢測(cè)PD-L1（克隆號(hào)：22C3，安捷倫科技有限公司）、 PD-1（克隆號(hào)：UMAB199，中杉金橋公司）、SMARCA4/BRG1（克隆號(hào)：GR005，基因科技上海股份有限公司）、BRAF（克隆號(hào)：EPR2208Y）、Ki-67（克隆號(hào)：MIB-1）、P53（克隆號(hào)：DO-7），后3種均為安必平醫(yī)藥科技股份有限公司產(chǎn)品，同時(shí)設(shè)立陽(yáng)性和陰性對(duì)照。NTRK1、NTRK2、NTRK3基因斷裂探針試劑（熒光原位雜交法）購(gòu)于北京安必平生物科技有限公司，BRAF V600E基因突變檢測(cè)試劑（熒光PCR法）購(gòu)于廈門艾德生物醫(yī)藥科技股份有限公司，均按照試劑盒說明書進(jìn)行操作。

1.3 結(jié)果判讀

SMARCA4、P53和Ki-67細(xì)胞核出現(xiàn)棕褐色顆粒判讀為陽(yáng)性，未出現(xiàn)棕褐色顆粒為陰性；P53突變情況根據(jù)細(xì)胞核著色情況判定，結(jié)果判斷參照文獻(xiàn)［6-7］，其中腫瘤細(xì)胞核均無著色提示無義突變，>60%的腫瘤細(xì)胞核強(qiáng)著色提示錯(cuò)義突變，1%～60%腫瘤細(xì)胞不均勻著色提示野生型，另有文獻(xiàn)報(bào)道的少數(shù)病例中出現(xiàn)P53細(xì)胞質(zhì)著色模式^［8］，在本研究中未觀察到，此種情況的判讀標(biāo)準(zhǔn)本研究不涉及。BRAF、PD-1細(xì)胞質(zhì)出現(xiàn)棕褐色顆粒判讀為陽(yáng)性，未出現(xiàn)棕褐色顆粒為陰性，PD-1在腫瘤相關(guān)免疫細(xì)胞中的表達(dá)計(jì)數(shù)方法為PD-1染色腫瘤相關(guān)免疫細(xì)胞占所有腫瘤相關(guān)免疫細(xì)胞百分比，根據(jù)是否大于10%分為<10%（低表達(dá)）和≥10%（高表達(dá)）兩組；PD-L1細(xì)胞膜/細(xì)胞質(zhì)出現(xiàn)棕褐色顆粒判讀為陽(yáng)性，未出現(xiàn)棕褐色顆粒為陰性，PD-L1表達(dá)按照聯(lián)合陽(yáng)性分?jǐn)?shù)（combined positive score，CPS）進(jìn)行表達(dá)分級(jí)，計(jì)數(shù)方法為PD-L1染色細(xì)胞數(shù)（腫瘤細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞）除以活的腫瘤細(xì)胞總數(shù)，再乘以100得出，根據(jù)CPS是否大于10分為CPS<10（低表達(dá)）和CPS≥10（高表達(dá)）兩組。NTRK1、NTRK2、NTRK3在100倍油鏡下觀察FISH熒光信號(hào)，判讀標(biāo)準(zhǔn)：計(jì)數(shù)100個(gè)互不重疊的腫瘤細(xì)胞核，當(dāng)紅色熒光信號(hào)和綠色熒光信號(hào)發(fā)生分離時(shí)，記為NTRK基因斷裂。擴(kuò)增阻滯突變系統(tǒng)-PCR嚴(yán)格按BRAF V600E基因突變檢測(cè)試劑盒說明書進(jìn)行加樣和操作，均設(shè)置陽(yáng)性及陰性對(duì)照。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 25.0統(tǒng)計(jì)軟件，符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，不符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以中位數(shù)和四分位數(shù)間距表示；分類變量以頻數(shù)和頻率表示。PD-L1與性別、年齡、病理特征等相關(guān)參數(shù)之間的關(guān)系差異比較采用卡方檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般情況

64例西藏自治區(qū)人民醫(yī)院手術(shù)切除CRC患者中，男35例、女29例，男女比例為1.21∶1，年齡24～83歲，平均年齡（56.59±13.27）歲，其中38例（59.38%）年齡≤60歲，26例（40.63%）年齡>60歲，均為藏族。46例（71.88%）為結(jié)腸占位，其中24例（52.17%）位于右半結(jié)腸，22例（47.83%）位于左半結(jié)腸；18例（28.12%）為直腸占位。

2.2 病理特征

病理類型上，64例CRC病例中60例（93.75%）為腺癌，其中28例（46.67%）為高/中分化腺癌（圖1、2），32例（53.33%）為低分化腺癌（圖3、4）；4例（6.25%）為其他類型，其中1例未分化癌、1例腺鱗癌、1例小細(xì)胞癌、1例混合性腺癌和小細(xì)胞癌。腫瘤分期上，11例（17.19%）為T1或T2期，53例（82.81%）為T3或T4期。淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移方面，24例（37.50%）出現(xiàn)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，40例（62.50%）未出現(xiàn)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。

2.3 免疫組織化學(xué)結(jié)果

64例病例均進(jìn)行IHC染色，其中63例（98.44%）SMARCA4腫瘤細(xì)胞為強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)，僅有1例（1.56%）SMARCA4部分腫瘤細(xì)胞表達(dá)減弱或缺失（圖5）；4例（6.25%）BRAF腫瘤細(xì)胞陽(yáng)性表達(dá)（圖6）；35例（54.69%）P53為突變型表達(dá)模式（圖7），其中24例（68.57%）為錯(cuò)義突變型表達(dá)模式，11例（31.43%）為無義突變型表達(dá)模式；1例PD-1腫瘤細(xì)胞陽(yáng)性表達(dá)，其余63例PD-1腫瘤細(xì)胞均為陰性；45例（70.31%）PD-1腫瘤相關(guān)免疫細(xì)胞陽(yáng)性比例分?jǐn)?shù)<10%，19例（29.69%）≥10%（圖8）；52例（81.25%）PD-L1綜合評(píng)分CPS<10（圖9），12例（18.75%）CPS≥10（圖10）；64例病例中腫瘤細(xì)胞Ki-67增殖指數(shù)從15.00%到90.00%（平均57.89%）。此外，10例（15.63%）出現(xiàn)錯(cuò)配修復(fù)蛋白表達(dá)缺失，提示錯(cuò)配修復(fù)缺陷/高度微衛(wèi)星不穩(wěn)定性（mismatch repair deficiency/microsatellite instability-high，dMMR/MSI-H）。

2.4 基因檢測(cè)結(jié)果

64例均進(jìn)行NTRK1、NTRK2、NTRK3融合基因FISH檢測(cè)，均未見陽(yáng)性信號(hào)（圖11）。64例均進(jìn)行BRAF V600E基因突變檢測(cè)，4例（6.25%）發(fā)現(xiàn)BRAF V600E基因突變（均為BRAF IHC陽(yáng)性病例）（圖12）。1例SMARCA4免疫組織化學(xué)腫瘤細(xì)胞部分表達(dá)減弱或缺失的病例進(jìn)行了二代測(cè)序檢測(cè)，未發(fā)現(xiàn)SMARCA4基因改變。

2.5 PD-L1相關(guān)因素分析結(jié)果

PD-L1 在CRC中的表達(dá)與患者年齡、性別、原發(fā)部位、分化程度、腫瘤浸潤(rùn)程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移與否及P53突變均無相關(guān)性（P均>0.05）。與dMMR/MSI-H和PD-1的高表達(dá)呈顯著正相關(guān)（χ²=10.223，P=0.001；χ²=11.979，P=0.001）（表1）。

3 討論

CRC作為最常見的消化道惡性腫瘤之一，其發(fā)病機(jī)制尚未完全明確^［9］。大部分CRC患者診斷時(shí)已發(fā)生轉(zhuǎn)移，預(yù)后較差。目前CRC的傳統(tǒng)治療方法主要是手術(shù)、化療和放療，雖然顯著改善了患者的預(yù)后，但CRC的死亡率、復(fù)發(fā)率并未顯著降低。因此，探索新的治療方式減少術(shù)后復(fù)發(fā)的風(fēng)險(xiǎn)和死亡率，是CRC領(lǐng)域的研究重點(diǎn)。

近年腫瘤微環(huán)境逐漸被重視，應(yīng)用免疫檢查點(diǎn)抑制劑調(diào)節(jié)免疫功能逐漸成為一種新興的治療方法^［10］。PD-1及PD-L1作為一對(duì)負(fù)性免疫共刺激分子，在腫瘤免疫逃逸中發(fā)揮著重要作用。研究提示腫瘤間質(zhì)細(xì)胞表達(dá) PD-L1 在腫瘤免疫逃逸中發(fā)揮重要作用^［11］。巨噬細(xì)胞可通過表達(dá) PD-L1 與 T 淋巴細(xì)胞表面 PD-1 結(jié)合，導(dǎo)致 T 淋巴細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞殺傷作用下降，引起腫瘤細(xì)胞免疫逃逸^［12］。有研究表明PD-1/PD-L1信號(hào)通路可能通過誘導(dǎo) T 細(xì)胞外周耐受、凋亡、功能衰竭以及抑制 T 細(xì)胞增殖、共刺激信號(hào)失衡等諸多方面發(fā)揮腫瘤細(xì)胞的免疫逃逸作用^［13］。針對(duì) PD-1/PD-L1 的免疫治療在黑色素瘤、肺癌等治療中取得療效，被推薦應(yīng)用于晚期、發(fā)生轉(zhuǎn)移以及不適合一線多藥物化療的腫瘤患者^［10］，為晚期 CRC 患者的治療帶來希望^［14］。有研究表明抗 PD-1/PD-L1 免疫治療在dMMR/MSI-H的CRC患者治療中有顯著療效^［15］。但針對(duì) PD-1 和 PD-L1 信號(hào)通路在CRC中的表達(dá)及其相關(guān)調(diào)控機(jī)制的研究較少，有報(bào)道PD-L1 在CRC中的表達(dá)與患者年齡、性別、發(fā)生部位、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況、腫瘤浸潤(rùn)程度均無關(guān)，而與腫瘤分化程度相關(guān)，在低分化組中PD-L1陽(yáng)性表達(dá)率明顯高于高/中分化組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義^［16］。另有研究顯示是否淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、不同臨床病理分期及不同腫瘤分化程度患者 PD-L1 蛋白的表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義^［17］。本研究顯示PD-L1 在CRC中的表達(dá)與患者年齡、性別、原發(fā)部位、分化程度、腫瘤浸潤(rùn)程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移與否均無相關(guān)性，與dMMR/MSI-H和高表達(dá)PD-1呈正相關(guān)，與文獻(xiàn)^［16］報(bào)道不完全一致。

CRC發(fā)病是一個(gè)在多種因素作用下基因不斷突變導(dǎo)致細(xì)胞異常增殖的過程。近年來，CRC治療已進(jìn)入靶向治療時(shí)代，其中表皮生長(zhǎng)因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）基因是臨床上治療CRC的主要靶點(diǎn)之一，而KRAS 和BRAF基因是否突變與EGFR靶向治療密切相關(guān)^［18］。2021 版《結(jié)直腸癌分子檢測(cè)高通量測(cè)序中國(guó)專家共識(shí)》中強(qiáng)調(diào)對(duì)于確診CRC 患者，應(yīng)檢測(cè) KRAS 和 BRAF 基因情況，以便對(duì)預(yù)后進(jìn)行分層，指導(dǎo)臨床治療^［19］。準(zhǔn)確檢測(cè) CRC 中 KRAS 及 BRAF基因狀態(tài)非常關(guān)鍵。BRAF 基因突變主要為第11外顯子及15外顯子上的突變，第 15 外顯子上的V600E 密碼子突變約占突變類型的90%^［20］。BRAF 基因突變與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程密切相關(guān)，并可作為腫瘤預(yù)后的標(biāo)志物之一^［21］。國(guó)內(nèi)外報(bào)道的CRC中 BRAF 基因突變率為 4%～13%^［22］。研究表明BRAF基因突變型CRC患者無法從抗EGFR單抗藥物治療中獲益，而且BRAF基因突變的轉(zhuǎn)移性CRC預(yù)后差，突變患者無進(jìn)展生存期和總生存期較野生型患者明顯縮短^［23］。本研究BRAF V600E的突變率為 6.25%，與文獻(xiàn)報(bào)道^［24］基本相符。BRAF基因突變型CRC在患者性別、腫瘤分化程度、是否遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤部位和腫瘤分期等方面的特點(diǎn)文獻(xiàn)報(bào)道不一致，有研究顯示BRAF基因突變與CRC腫瘤浸潤(rùn)深度和分化程度相關(guān)，在腫瘤浸潤(rùn)深度為T4和低分化的CRC患者中，BRAF基因突變率較高^［25］。本研究4例 BRAF突變的病例3例為女性，4例病理類型均為低分化腺癌，浸潤(rùn)深度T3/T4，均可見脈管侵犯，3例有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，與部分文獻(xiàn)報(bào)道^［24］一致。由于樣本量的局限性，筆者將繼續(xù)收集病例進(jìn)一步研究總結(jié)BRAF突變型CRC的特點(diǎn)并完善KRAS等相關(guān)基因的檢測(cè)。

NTRK基因融合作為另一種重要的在多種實(shí)體瘤中表達(dá)的融合基因類型備受關(guān)注，NTRK 基因融合的患者可從 NTRK 抑制劑（拉羅替尼）中獲益。筆者前期的研究顯示西藏地區(qū)CRC病例中均未發(fā)現(xiàn)Pan-TRK蛋白的表達(dá)^［26］，為更準(zhǔn)確地判讀西藏地區(qū)NTRK融合基因情況，以及NTRK基因改變與Pan-TRK免疫組織化學(xué)表達(dá)之間的關(guān)系，本研究對(duì)全部64例病例均進(jìn)行NTRK1、NTRK2、NTRK3融合基因檢測(cè)，結(jié)果均為陰性，與筆者之前研究顯示全部病例Pan-TRK免疫組織化學(xué)均為陰性結(jié)果^［26］相一致，提示西藏地區(qū)NTRK基因融合的發(fā)生頻率極低，Pan-TRK免疫組織化學(xué)可以作為NTRK融合基因改變的初篩方法。本研究病例數(shù)有限，后續(xù)有待擴(kuò)大病例數(shù)進(jìn)一步深入研究。

SMARCA4蛋白是SWI/SNF復(fù)合物，是ATP依賴性染色體重塑復(fù)合物家族成員，具有解旋酶和ATP酶活性，可以促進(jìn)染色體構(gòu)象發(fā)生改變，對(duì)基因轉(zhuǎn)錄進(jìn)行調(diào)控。SWI/SNF復(fù)合物在轉(zhuǎn)錄調(diào)控中的功能主要為增殖和分化，相關(guān)腫瘤的形態(tài)特征表現(xiàn)為分化差和高度增殖，表明其主要缺陷是未能激活促進(jìn)或維持終末分化的基因。SMARCA4蛋白在正常組織中表達(dá)，在胸部肉瘤、胃食管交界及胃未分化癌等多種腫瘤中可出現(xiàn)表達(dá)缺失^［27-28］。在胃腸道SWI/SNF復(fù)合物缺失性腫瘤中，主要出現(xiàn)SMARCA4缺失，占63%^［29］。SMARCA4表達(dá)缺失的腫瘤通常分化差，在病理形態(tài)學(xué)上多表現(xiàn)為去分化、小細(xì)胞和橫紋肌樣特征。有研究顯示SMARCA4缺失型腫瘤與免疫缺陷的微環(huán)境相關(guān)，從而導(dǎo)致患者不能從免疫檢查點(diǎn)抑制劑中獲益^［30］。SMARCA4免疫組織化學(xué)染色可能更有助于預(yù)測(cè)SMARCA4的缺失情況^［31］，但SMARCA4蛋白表達(dá)缺失與基因改變情況并不完全對(duì)應(yīng)，大多數(shù)SMARCA4表達(dá)缺失的病例中可發(fā)現(xiàn)SMARCA4基因改變，出現(xiàn)SMARCA4基因改變不一定會(huì)出現(xiàn)蛋白表達(dá)缺失。本研究?jī)H1例出現(xiàn)SMARCA4部分腫瘤細(xì)胞的表達(dá)減弱或缺失，二代測(cè)序檢測(cè)并未發(fā)現(xiàn)其基因突變，該病例病理類型為高分化腺癌，并沒有去分化和橫紋肌樣的形態(tài)學(xué)特點(diǎn)，目前文獻(xiàn)缺乏這種情況的相關(guān)報(bào)道，如何解釋這種現(xiàn)象，需要積累類似病例并進(jìn)一步深入研究。

P53是一種抑癌基因，其在正常細(xì)胞中可以誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻斷在G0/G1期，使細(xì)胞程序性凋亡，發(fā)生突變時(shí)失去監(jiān)管作用，引起細(xì)胞周期異常，出現(xiàn)細(xì)胞增殖過多、凋亡減少，從而促進(jìn)腫瘤的進(jìn)展^［32］。P53抑癌基因是人類研究最早、最多且最易發(fā)生突變的腫瘤相關(guān)基因之一，約半數(shù)的惡性腫瘤P53基因突變，有報(bào)道P53在CRC中的突變率為40%～50%^［33］。P53基因突變時(shí)出現(xiàn)P53蛋白的異常表達(dá)，文獻(xiàn)報(bào)道可以出現(xiàn)以下多種異常表達(dá)模式，主要表現(xiàn)為胞核異常表達(dá)，胞核異常表達(dá)有以下幾種模式，一種為全部腫瘤細(xì)胞均不表達(dá)P53蛋白，為無義突變型表達(dá)模式；一種超過60%的腫瘤細(xì)胞強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)，為錯(cuò)義突變型模式^［6-7］，少數(shù)病例可以出現(xiàn)胞質(zhì)異常表達(dá)^［8］。有報(bào)道在神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤可以出現(xiàn)局部區(qū)域的彌漫強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)，也檢測(cè)到P53基因突變^［34］。本研究未觀察到局部胞核彌漫強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)和胞質(zhì)表達(dá)兩者情況。本研究54.69%病例出現(xiàn)P53突變型表達(dá)，以錯(cuò)義突變型表達(dá)模式為主，占2/3以上。CRC中P53與PD-L1表達(dá)情況的相關(guān)研究較少，有研究顯示PD-L1水平與P53突變情況無關(guān)，也有研究顯示P53野生型CRC中PD-L1表達(dá)水平較高，提示P53野生型CRC患者可能具有更好的免疫治療前景^［33］，本研究顯示P53突變與PD-L1表達(dá)情況無相關(guān)性。

綜上，西藏地區(qū)CRC中較少出現(xiàn)SMARCA4表達(dá)減弱或缺失及NTRK1、NTRK2、NTRK3融合基因改變，少數(shù)病例出現(xiàn)BRAF V600E基因突變，Pan-TRK和BRAF免疫組織化學(xué)可作為NTRK融合基因及BRAF基因突變的初篩方法。dMMR/MSI-H的病例中更容易出現(xiàn)PD-L1高表達(dá)，這部分患者有望獲益于免疫治療。P53突變與PD-L1的表達(dá)無相關(guān)性，PD-1的高表達(dá)和PD-L1的高表達(dá)呈顯著正相關(guān)。

利益沖突 所有作者聲明無利益沖突

作者貢獻(xiàn)聲明 羅含歡：起草論文，參與研究選題、設(shè)計(jì)，按編輯部的修改意見進(jìn)行修改，對(duì)病理切片、免疫組織化學(xué)切片進(jìn)行閱片及結(jié)果判定；劉彬云：負(fù)責(zé)相關(guān)檢測(cè)工作及數(shù)據(jù)整理；霍真：參與研究選題、設(shè)計(jì)，對(duì)重要學(xué)術(shù)性內(nèi)容做出關(guān)鍵性修訂，對(duì)擬發(fā)表的文稿作最后審閱和定稿，對(duì)病理切片、免疫組織化學(xué)切片進(jìn)行閱片及結(jié)果判定；邊巴扎西：負(fù)責(zé)臨床相關(guān)數(shù)據(jù)收集、分析；王倩：負(fù)責(zé)病理數(shù)據(jù)收集及整理；多布啦：負(fù)責(zé)病理圖片采集和病理蠟塊收集；尼瑪卓瑪：負(fù)責(zé)病理圖片采集和病理切片整理；達(dá)珍：負(fù)責(zé)病理相關(guān)資料收集，病理切片收集歸檔；王寒：負(fù)責(zé)病理相關(guān)數(shù)據(jù)收集、統(tǒng)計(jì)分析；郭平平：負(fù)責(zé)相關(guān)檢測(cè)工作

參 考 文 獻(xiàn)

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（收稿日期：2023-09-18）