孫睿雪,李玉鐸,趙建軍

(黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué) 動(dòng)物科技學(xué)院,黑龍江大慶 163319)

新發(fā)傳染病(emerging infectious disease,EID)是由新出現(xiàn)病原體或經(jīng)變異而獲得新生物學(xué)特性的已知病原體所引起人或動(dòng)物的傳染性疾病[1]。EID傳播途徑和致病性表現(xiàn)多樣,其病原微生物種類復(fù)雜,但大多數(shù)病原為病毒。由于發(fā)現(xiàn)時(shí)間較短、研究不足,人們對(duì)其認(rèn)知有限,無法在疾病流行早期對(duì)病原體進(jìn)行檢測(cè)和防控,最終導(dǎo)致疫病流行。據(jù)統(tǒng)計(jì),近80%人類新發(fā)病來源于動(dòng)物。因此,動(dòng)物新發(fā)動(dòng)物傳染病給全球性公共衛(wèi)生安全帶來嚴(yán)重威脅。

我國(guó)幅員遼闊并與多個(gè)國(guó)家接壤,畜禽及其產(chǎn)品走私入境情況時(shí)有發(fā)生,存在外來動(dòng)物傳染病和新發(fā)傳染病傳入的風(fēng)險(xiǎn),對(duì)我國(guó)畜牧養(yǎng)殖業(yè)產(chǎn)生潛在威脅。2011年,以施馬倫貝格病為代表的牛新發(fā)傳染病首次在歐洲牛養(yǎng)殖場(chǎng)、野生鹿群中暴發(fā),其病原為施馬倫貝格病毒(Schmallenberg virus,SBV),該病毒可侵害反芻動(dòng)物的中樞神經(jīng)系統(tǒng),導(dǎo)致懷孕母畜流產(chǎn),患畜的生產(chǎn)性能下降等[2]。該病現(xiàn)已傳播至與我國(guó)接壤的西亞多個(gè)國(guó)家,存在傳入我國(guó)的潛在風(fēng)險(xiǎn)。此外,牛腸道病毒(Bovine enterovirus,BEV)、牛星狀病毒(Bovine astrovirus,BoAstV)、牛庫布病毒(Bovine kobuvirus,BKV)等引起的牛新發(fā)傳染病在國(guó)內(nèi)陸續(xù)發(fā)生,上述腸道病毒不僅導(dǎo)致宿主腹瀉,還可引起宿主出現(xiàn)呼吸系統(tǒng)(哮喘、咳嗽和呼吸困難)、神經(jīng)系統(tǒng)疾病(全身痙攣、角弓反張和腦膜炎)[3-5]。

目前,針對(duì)牛新發(fā)傳染病的診斷多采用傳統(tǒng)病原學(xué)、血清學(xué)、分子生物學(xué)檢測(cè)技術(shù)如病毒分離(virus isolation,VI)、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(enzyme-linked immunosorbent assays,ELISA)、聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction,PCR)等,隨著牛新發(fā)傳染病廣泛流行和病毒基因變異,傳統(tǒng)診斷技術(shù)將難以滿足當(dāng)前對(duì)動(dòng)物新發(fā)傳染病診斷的快速、敏感和高通量等需求。本文從牛新發(fā)病毒性傳染病病原學(xué)、流行病學(xué)及其診斷技術(shù)進(jìn)行了綜述,以期為我國(guó)上述疫病的防控提供參考。

1 牛新發(fā)病毒性傳染病及其病原

2011年以來,我國(guó)陸續(xù)發(fā)現(xiàn)8種牛新發(fā)病毒,可引起肉牛、奶牛消化和呼吸道傳染病(表1)。其中,BoAstV、BKV、牛紐布病毒(Bovine nebovirus,BNeV)和牛諾如病毒(Bovine norovirus,BNoV)均為引起犢牛腹瀉病原[4-6];D型流感病毒(Influenza D virus,IDV)為牛呼吸道疾病重要病原[7];BEV和牛環(huán)曲病毒(Bovine torovirus,BToV)不僅可引起不同日齡牛腹瀉,還可引發(fā)呼吸道疾病[3,8]。其中,IDV和BToV均具有血凝素酯酶蛋白(HE),該蛋白通過作為凝集素和受體破壞酶介導(dǎo)與O-乙?；僖核岬目赡嫘愿街Ｒ虼?它們被視為潛在的人畜共患性病原[9-10]。牛結(jié)節(jié)性皮膚病病毒(Lumpy skin disease virus,LSDV)可致牛全身皮膚結(jié)節(jié),引起牛生產(chǎn)性能下降[11],由LSDV引發(fā)的牛結(jié)節(jié)性皮膚病(Lumpy skin disease,LSD)雖非人畜共患傳染病,但它具有高度傳染性,對(duì)養(yǎng)牛業(yè)危害巨大,被世界動(dòng)物衛(wèi)生組織(WOAH)列為必須通報(bào)的疫病。

表1 國(guó)內(nèi)外牛新發(fā)病毒性傳染病病原統(tǒng)計(jì)表

2011-2020年,國(guó)外科學(xué)家先后發(fā)現(xiàn)了SBV、牛丙型肝炎病毒(Bovine hepacivirus,BovHepV)、牛boosepi病毒(Bovine boosepivirus,BooV)以及Hayes Yard病毒(Hayes Yard virus,HYV)等引起牛新發(fā)傳染病的病毒(表1)。SBV為正布尼亞病毒屬成員,該屬病毒易發(fā)生基因重排而使毒力和易感宿主變化[12];BovHepV與人丙型肝炎病毒相似,可造成宿主無明顯臨床癥狀的急性和慢性感染,對(duì)從事相關(guān)行業(yè)人員的健康具有潛在威脅[13]。上述病毒不僅影響?zhàn)B牛業(yè)的持續(xù)性發(fā)展,還可能對(duì)人類健康帶來潛在威脅。

1.1 D型流感病毒

D型流感病毒(IDV)是造成牛呼吸道疾病綜合征的病原之一[7]。其基因組由7個(gè)節(jié)段組成,可編碼聚合酶(PB2、PB1、P3)、核蛋白(NP)、血凝素酯酶融合蛋白(HEF)、基質(zhì)蛋白(M1、CM2)、非結(jié)構(gòu)蛋白(NEP、NS1)。根據(jù)IDV HEF基因?qū)⑵浞譃镈/OK、D/660和D/Japan基因型[17]。

IDV主要宿主為牛,病毒通過直接接觸或氣溶膠傳播,在宿主上下呼吸道進(jìn)行復(fù)制,引起呼吸系統(tǒng)疾病[17]。自2011年Hause B M等[18]從類似流感癥狀的豬體內(nèi)分離出首株IDV后,中國(guó)、意大利、日本等多個(gè)國(guó)家均報(bào)道該病毒在牛群中廣泛流行,山羊、綿羊、馬等多個(gè)動(dòng)物種群也可檢測(cè)到IDV核酸[17]。White S K等[9]對(duì)養(yǎng)殖場(chǎng)工作人員血清中IDV抗體進(jìn)行檢測(cè),結(jié)果顯示抗IDV抗體陽性率為94%(抗體效價(jià)≥1∶40),表明IDV對(duì)人類健康可能造成威脅,是一種潛在的人畜共患病原體。

1.2 牛結(jié)節(jié)性皮膚病病毒

牛結(jié)節(jié)性皮膚病(LSD)于2019年傳入我國(guó),其病原LSDV基因組由一個(gè)2.4 kb末端重復(fù)序列包圍的中心編碼區(qū)組成,其中ORF3、ORF5、ORF8等23個(gè)基因與病毒毒力相關(guān),ORF73編碼蛋白參與體液免疫[15]。LSDV可引發(fā)高度傳染性的LSD,患畜臨床特征表現(xiàn)為發(fā)熱、食欲不振、全身皮膚結(jié)節(jié)、淋巴結(jié)腫大、消瘦、產(chǎn)奶量下降以及流產(chǎn)。嚴(yán)重時(shí),口腔、氣管、喉和食道黏膜可發(fā)展為潰瘍性病變[11,19]。LSDV主要通過蚊、蠅等節(jié)肢動(dòng)物叮咬進(jìn)行傳播,也可通過皮膚擦傷、污染的環(huán)境傳播,其自然宿主為牛、水牛和野生反芻動(dòng)物,患畜恢復(fù)后攜帶病毒至少3周[15]。

LSD于1929年首次在贊比亞報(bào)道,20世紀(jì)80年代末傳入亞洲。2019年,我國(guó)新疆伊犁州首次暴發(fā)LSD疫情,該地區(qū)養(yǎng)殖密度大且與流行LSD的哈薩克斯坦接壤,推測(cè)疫情來源為邊境的帶毒嗜血蟲媒,此次疫情發(fā)病率為17.83%、病死率為0.2%[11]。此后不到1年時(shí)間,我國(guó)福建、江西、廣東等臨海省區(qū)均出現(xiàn)疫情,對(duì)我國(guó)養(yǎng)牛業(yè)造成較大危害。

1.3 牛環(huán)曲病毒

牛環(huán)曲病毒(BToV)基因組包含2個(gè)大的ORF,編碼2個(gè)非結(jié)構(gòu)蛋白ORF1、ORF2,以及4種結(jié)構(gòu)蛋白。根據(jù)其血凝素酯酶(HE)基因序列,BToV可分為3個(gè)基因型,其中Ⅱ型和Ⅲ型最為常見[20]。

BToV主要經(jīng)糞-口傳播,也可經(jīng)呼吸道傳播,主要感染3月齡以內(nèi)犢牛,也可感染成年奶牛,病牛、健康牛均可帶毒[8]。目前,BToV已在世界范圍內(nèi)流行,在亞洲、北美洲、非洲、歐洲、南美洲均有報(bào)道[8,20]。我國(guó)四川、遼寧、山西和河南地區(qū)3月齡以內(nèi)犢牛BToV陽性率為21.73%[20],河南地區(qū)奶牛BToV陽性率為4.07%,肉牛為3.06%[8],證實(shí)BToV在我國(guó)牛群中廣泛傳播。

環(huán)曲病毒與冠狀病毒曾被列入同科,兩者的HE蛋白具有類似的結(jié)構(gòu)和功能,該蛋白的氨基酸突變可能影響病毒與受體的結(jié)合能力、組織噬性從而導(dǎo)致病毒跨物種傳播[10]。Ito M等[21]發(fā)現(xiàn)日本BToV毒株是原型毒株Breda1與豬環(huán)曲病毒的重組毒株,其基因組在ORF1b 3＇端和HE基因的3＇端存在2個(gè)重組斷點(diǎn),與豬環(huán)曲病毒基因組相似度達(dá)76%。與原型毒株Bredar1相比,現(xiàn)流行的BToV毒株S蛋白和HE蛋白均有氨基酸突變與豬環(huán)曲病毒毒株親緣關(guān)系更為密切,表明BToV具有豐富的遺傳多樣性,具備進(jìn)化出新基因型毒株的可能[20-21]。

1.4 施馬倫貝格病毒

施馬倫貝格病毒(SBV)基因組包括3段單股負(fù)鏈RNA,分別稱為小(S)、中(M)和大(L)段。S段編碼核衣殼蛋白(N)和非結(jié)構(gòu)蛋白(NSs)[2],而N蛋白是SBV病毒粒子中含量最豐富的蛋白,具有很強(qiáng)的免疫原性,可誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生早期抗體[22],因此被作為該病毒診斷的靶蛋白。

自2011年Hoffmann B等[12]首次在德國(guó)感染動(dòng)物分離到SBV后,荷蘭、比利時(shí)、英國(guó)等歐洲多國(guó)均出現(xiàn)施馬倫貝格疫情,現(xiàn)已呈由歐洲向亞洲擴(kuò)散的趨勢(shì)[2]。施馬倫貝格病主要表現(xiàn)為厭食、高熱、腹瀉和產(chǎn)奶量下降等癥狀[12],部分導(dǎo)致母畜流產(chǎn)、產(chǎn)死胎和畸形胎[23]。目前,我國(guó)尚無該病的報(bào)道,但SBV有可能通過庫蠓從歐洲、西亞、中亞傳入我國(guó),也可能因土耳其-巴基斯坦的非法動(dòng)物貿(mào)易造成跨境傳播,給與巴基斯坦接壤的新疆帶來較高的傳入風(fēng)險(xiǎn)[24]。

1.5 牛Boosepi病毒

2015年,Nagai M等[16]利用病毒宏基因組學(xué)技術(shù),首次在腹瀉牛糞便中發(fā)現(xiàn)牛Boosepi病毒(BooV)并確定其近完整基因組序列。序列分析顯示,它具有標(biāo)準(zhǔn)的小核糖核酸病毒基因組結(jié)構(gòu)?；诮Y(jié)構(gòu)蛋白P1氨基酸序列的系統(tǒng)發(fā)育分析顯示,該病毒與未分類的中國(guó)小核糖核酸病毒親緣關(guān)系密切。該項(xiàng)研究中BooV檢出率為23%,證實(shí)該病毒已在日本北海道地區(qū)流行。2021年,Hause B M等[25]首次在美國(guó)腹瀉犢牛腸道組織和糞便中檢測(cè)到BooV,所得毒株21-0305與日本毒株(12-7/2009/JPN、12-38/2009/JPN、12-11/2009/JPN、12-3/2009/JPN)的基因組同源性為86%。目前該病毒只在日本、美國(guó)地區(qū)有報(bào)道。

1.6 Hayes Yard病毒

2020年,Blasdell K R等[26]從澳大利亞北部一公牛血液中分離出一種新型病毒,現(xiàn)將其命名為Hayes Yard病毒(HYV)。該?；加袊?yán)重類暫時(shí)熱疾病并伴有神經(jīng)系統(tǒng)損傷。HYV具有彈狀病毒典型特征,其全基因組序列分析顯示,它具有與牛流行熱病毒相似的基因組結(jié)構(gòu)。根據(jù)病毒L蛋白序列分析結(jié)果,HYV與Puchong病毒、貝里馬病毒及牛流行熱病毒等親緣關(guān)系密切。研究人員通過進(jìn)一步對(duì)該地區(qū)收集的牛血清回顧性調(diào)查研究顯示,2000年采集的血清樣本中HYV中和抗體陽性率為65.85%,表明HYV長(zhǎng)期流行于澳大利亞北部地區(qū)牛群中,對(duì)畜牧業(yè)具有潛在威脅。

2 診斷技術(shù)

目前,國(guó)內(nèi)外用于牛新發(fā)病毒性傳染病診斷技術(shù)主要分為病毒學(xué)檢測(cè)、血清學(xué)檢測(cè)和分子生物學(xué)檢測(cè)技術(shù)3類(表2)。

表2 當(dāng)前牛新發(fā)病毒性傳染病診斷技術(shù)

2.1 病原學(xué)診斷

病毒分離(VI)和電鏡觀察(electron microscopy,EM)是病毒性傳染病經(jīng)典診斷技術(shù)。VI通過收集待檢測(cè)樣本處理除菌后接種到病毒易感的細(xì)胞、動(dòng)物等,培養(yǎng)鑒定致病病毒,它是多種病原體檢測(cè)的“金標(biāo)準(zhǔn)”[18]。研究人員通過EM首次在犢牛腹瀉糞便樣本中鑒定出BoAstV、BNoV、BNeV,并利用原代牛腎細(xì)胞成功分離培養(yǎng)BoAstV[4]。李英利等[3]將犢牛糞便樣本處理后接種MA104細(xì)胞,出現(xiàn)細(xì)胞病變后利用超薄切片技術(shù)觀察到病毒粒子,經(jīng)后續(xù)檢測(cè)證實(shí)為我國(guó)首株BEV。

EM和VI雖為牛新發(fā)病毒研究重要診斷技術(shù),但難以大規(guī)模推廣使用,原因主要為:(1)一些病毒形態(tài)不易區(qū)分,如羊痘病毒屬病毒與正痘病毒,需要專業(yè)的實(shí)驗(yàn)儀器以及專業(yè)受訓(xùn)的實(shí)驗(yàn)人員進(jìn)行鑒定;(2)部分病毒暫無分離培養(yǎng)體系如BNoV、BNeV等[6];(3)實(shí)驗(yàn)材料要求較高。

2.2 血清學(xué)診斷

血清學(xué)診斷主要針對(duì)病毒的抗原、遺傳物質(zhì)以及病原體誘導(dǎo)產(chǎn)生的抗體進(jìn)行檢測(cè)。現(xiàn)有多種牛新發(fā)病毒的血清學(xué)檢測(cè)技術(shù),如補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)(complement fixation test,CFT)、血清中和試驗(yàn)(serum neutralization test,SNT)、病毒中和試驗(yàn)(virus neutralization test,VNT)等。IDV表面糖蛋白能與雞紅細(xì)胞發(fā)生凝集作用,多采用血凝(HA)、血凝抑制試驗(yàn)(HAHI)進(jìn)行血清學(xué)診斷[17],除此以外主要采用ELISA法對(duì)牛新發(fā)病毒進(jìn)行檢測(cè)。2013年,歐洲SBV參考實(shí)驗(yàn)室利用法國(guó)ID-VET研發(fā)基于SBV重組N蛋白的間接ELISA試劑盒檢測(cè)多種反芻動(dòng)物陽性血清,與VNT檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行對(duì)比,驗(yàn)證ELISA試劑盒檢測(cè)效果。結(jié)果顯示,兩者檢測(cè)結(jié)果的符合率達(dá)98.9%,ELISA試劑盒敏感度、特異性分別可達(dá)97.2%和99.8%[28]。2021年,Wernike K等[29]針對(duì)辛波血清群病毒(Simbu serogroup)Gc蛋白,建立了一種新型、高特異性的用于區(qū)分SBV、舒尼病毒、阿卡斑病毒抗體的三重ELISA檢測(cè)方法。該方法對(duì)SBV的診斷特異性和敏感性分別可達(dá)84.56%和89.08%,可用于疑似群體的血清學(xué)篩查。

此前有學(xué)者建立了分別檢測(cè)BToV抗體和抗原的競(jìng)爭(zhēng)ELISA和雙抗體夾心ELISA法。但因存在BToV抗原制備、分離純化困難等問題,兩者未被廣泛應(yīng)用?，F(xiàn)階段主要利用分子生物學(xué)檢測(cè)技術(shù)對(duì)BToV進(jìn)行診斷。

2.3 傳統(tǒng)分子生物學(xué)診斷

2.3.1 基于(RT-)PCR的分子檢測(cè)技術(shù) 針對(duì)BNoV、BoAstV和BToV混合感染導(dǎo)致犢牛腹瀉的情況,師志海等[31]建立了可同時(shí)檢測(cè)該3種病毒的多重PCR檢測(cè)方法。該方法可同時(shí)檢出樣本中的3種病毒,結(jié)果與單一PCR結(jié)果一致。針對(duì)外來疫病,趙文華等[32]分別建立了同時(shí)檢測(cè)SBV、小反芻獸疫病毒和裂谷熱病毒的三重RT-PCR和實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR方法。前者檢測(cè)敏感度可達(dá)103copies/μL,后者檢測(cè)敏感度均低于102.33copies/μL。兩種方法均可特異地對(duì)3種病毒進(jìn)行同步快速檢測(cè)。

相較于競(jìng)爭(zhēng)性PCR、半定量RT-PCR等傳統(tǒng)的mRNA定量方法技術(shù),朱彤等[33]建立的BEV SYBR Green I實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR檢測(cè)法操作更簡(jiǎn)便、高效,還具有更高的敏感度和特異性。該方法無需探針,與TaqMan熒光定量RT-PCR法相比,更具成本優(yōu)勢(shì),更適于臨床樣本檢測(cè)。

崔雨晨等[36]針對(duì)BNeV建立的iiRT-PCR法的最低檢測(cè)限為5.38 copies/μL,臨床樣本中BNeV的平均檢出率(64.36%)高于SYBR Green熒光定量RT-PCR法(46.53%)、TB Green熒光定量法(61.39%)、套式RT-PCR法(18.81%)。該方法不但適用于實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)BNeV,配合相應(yīng)工具還可在現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)BNeV,獲得檢測(cè)結(jié)果僅需1 h[36]。

2.3.2 等溫?cái)U(kuò)增技術(shù) 等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)是一種能在恒定溫度下進(jìn)行體外核酸擴(kuò)增的新型技術(shù)。王志成[34]先后建立了BEV LAMP、RPA兩種檢測(cè)法,檢測(cè)敏感度均顯著高于常規(guī)PCR檢測(cè)方法,分別可達(dá)1×103copies/μL、1×102copies/μL。這兩種方法可以通過體系反應(yīng)前后的顏色變化肉眼判斷結(jié)果,適用于現(xiàn)場(chǎng)快速診斷。針對(duì)難以明確SBV患畜病毒血癥時(shí)間,病毒分離受到限制的問題,陳軒等[35]首次建立了檢測(cè)SBV的RT-LAMP法,敏感度達(dá)到1.33×102copies/μL。該方法快速簡(jiǎn)便,對(duì)實(shí)驗(yàn)設(shè)備要求低,利用恒溫水浴鍋1 h即可完成檢測(cè),適用于進(jìn)出境口岸、養(yǎng)殖場(chǎng)等具有簡(jiǎn)易設(shè)備的基層單位。

但當(dāng)動(dòng)物感染某些病毒如SBV后出現(xiàn)病毒血癥時(shí)間短[12],在評(píng)估病毒流行率時(shí),抗體檢測(cè)比抗原檢測(cè)更為有用,此時(shí)更適合采用血清學(xué)檢測(cè)技術(shù)進(jìn)行診斷。

2.4 病毒宏基因組學(xué)技術(shù)

病毒宏基因組學(xué)是以待測(cè)樣本中存在的病毒群體為研究對(duì)象,基于高通量基因測(cè)序技術(shù)來研究環(huán)境樣本中病毒組成?，F(xiàn)已被成功應(yīng)用于臨床樣本新型病毒挖掘、傳染病流行病學(xué)調(diào)查。通過對(duì)患畜血液、糞便等樣本進(jìn)行宏基因組測(cè)序分析,研究人員現(xiàn)已成功發(fā)現(xiàn)SBV、BooV等新發(fā)病毒[10,16]。將宏基因組測(cè)序分析結(jié)果與原位雜交等后續(xù)試驗(yàn)結(jié)果相結(jié)合,即可獲知多種牛新發(fā)病毒的生物學(xué)特性,例如牛呼吸道疾病綜合征的致病因子包括IDV,并常與牛腺病毒和牛細(xì)小病毒混合感染犢牛[7];BoAstV PE3373/2019/Italy為嗜神經(jīng)性毒株,可導(dǎo)致奶牛出現(xiàn)神經(jīng)癥狀,患畜腦干、三叉神經(jīng)發(fā)炎,大腦和神經(jīng)節(jié)中有大量的神經(jīng)元壞死[37]。與其他技術(shù)相比,該技術(shù)可詳細(xì)描述生物樣本內(nèi)病毒組成和功能,獲取完整的微生物群落信息。但也存在基因組擴(kuò)增后獲取的病毒組信息有偏差、數(shù)據(jù)處理分析工作繁重以及成本相對(duì)昂貴等缺點(diǎn)。

3 結(jié)語與展望

目前,多數(shù)牛病毒性新發(fā)傳染病危害大且尚無有效疫苗防控,因此針對(duì)牛新發(fā)病毒建立高效診斷技術(shù)、開展流行病學(xué)調(diào)查、查明病毒遺傳變異規(guī)律對(duì)新發(fā)傳染病的防控尤為重要。同時(shí),建立敏感、快速的病毒檢測(cè)技術(shù),滿足當(dāng)下自動(dòng)化、精密化、多元化的疫病防控需求是開展牛新發(fā)病毒性傳染病的關(guān)鍵。如整合激光技術(shù)、數(shù)字信號(hào)處理、傳統(tǒng)化學(xué)技術(shù)等的液相芯片技術(shù)不僅適用于微量樣品的檢測(cè),還可同時(shí)對(duì)多種病原體進(jìn)行檢測(cè)?，F(xiàn)已利用該技術(shù)建立了可同時(shí)檢測(cè)牛多瘤病毒、牛細(xì)小病毒、藍(lán)舌病毒等6種病毒的液相芯片檢測(cè)方法[38]。近年來,基于CRISPR/Cas(clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associate)基因編輯技術(shù)的分子診斷技術(shù)展現(xiàn)出良好的應(yīng)用前景,將RPA與Cas13a系統(tǒng)結(jié)合可實(shí)現(xiàn)對(duì)病毒核酸高敏感度、高特異性的檢測(cè)[39],將PCR技術(shù)與Cas12a結(jié)合的核酸檢測(cè)系統(tǒng)可區(qū)分病毒株、進(jìn)行基因分型[40]。今后,上述新型診斷技術(shù)有望在牛新發(fā)病毒性傳染病診斷中發(fā)揮重要作用。