陳君霖,趙昕鈺,廖 琳,左景茹,杜婧怡,葛駿梟,趙一凡,余 婭,劉曉強

(西北農(nóng)林科技大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院,陜西楊凌 712100)

納米藥物是納米技術(shù)與藥學(xué)相結(jié)合后研發(fā)出的一種新劑型,與其他劑型比較,粒徑更小,比表面積更大,表面反應(yīng)活性更高,活性中心更多[1]。納米制劑提高了中藥的溶解度、生物利用度、藥物療效、緩釋控釋作用和靶向作用,降低了毒性和副作用,減少了藥物使用藥量,具有很好的生物相容性[2]。納米銀是納米材料研究的熱點之一,銀離子自身的抗菌能力使其在生物醫(yī)療研究領(lǐng)域具有巨大的潛力[3]。納米銀合成手段有化學(xué)、物理、生物3種途徑,化學(xué)還原法會產(chǎn)生大量污染物,破壞生態(tài)環(huán)境。綠色還原法在制備過程中不會在納米粒子表面吸附有毒有害物質(zhì),對環(huán)境危害小,而且材料粒徑均勻,產(chǎn)生的銀團聚物少[4]。黃酮類化合物、萜類化合物、生物堿、多酚類等天然成分都可用于綠色還原法制備納米銀[5]。還原劑使Ag+還原為Ag,可吸附在納米銀表面避免團聚[6]。紫錐菊屬于菊科松果菊屬,分布于北美、歐洲、澳大利亞和中國[7],被用于治療許多疾病[8]。紫錐菊多酚為菊科植物紫錐菊的莖葉、根提取物。從紫錐菊分離鑒定出的多酚類物質(zhì)主要以咖啡酸衍生物為主[9]。紫錐菊多酚的生物學(xué)效應(yīng)主要依賴于其自身所含的植物化學(xué)物質(zhì)如菊苣酸、綠原酸、咖啡因、紫錐菊皂等[10],目前主要作為免疫調(diào)節(jié)劑及免疫刺激素,具有抗病毒、抗真菌、抗腫瘤及殺蟲、消炎的藥理作用,常用于治療呼吸道疾病[11]。

目前,國內(nèi)紫錐菊常見獸用制劑有片劑、膠囊、粉末與口服液等,關(guān)于紫錐菊納米制劑的研究尚未報道,紫錐菊多酚在納米銀合成過程中充當(dāng)還原劑和表面活性劑,能制成大小均勻、比較穩(wěn)定的納米銀。本文通過研究紫錐菊多酚納米銀復(fù)合物的制備方法及對其質(zhì)量評價,以提高藥物的有效性。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 藥品 紫錐菊多酚(純度≥99%),陜西省扶風(fēng)縣斯諾特生物科技有限公司產(chǎn)品(批號20220507)。

1.1.2 主要試劑 硝酸銀(純度≥99.8%),成都市科隆化學(xué)品有限公司產(chǎn)品;聚乙烯吡咯烷酮(PVP),索萊寶科技有限公司產(chǎn)品;硼氫化鉀(KBH4),上海阿拉丁生化科技股份有限公司產(chǎn)品;碳酸氫鈉(純度≥99.5%),廣東光華科技股份有限公司產(chǎn)品;乙二胺四乙酸(EDTA),索萊寶科技有限公司產(chǎn)品。

1.1.3 主要儀器 紫外-可見分光光度計(UV-2550),島津(上海)實驗器材有限公司產(chǎn)品;TGL-16M型臺式高速冷凍離心機,湖南凱達(dá)科學(xué)儀器有限公司產(chǎn)品;納米激光粒度儀(ZEN360003060120),英國馬爾文儀器有限公司公司產(chǎn)品;透射電子顯微鏡(TECNAIG2 SPIRIT BIO03040112),美國FEI公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 試劑配置 取1.1891 g AgNO3粉末,350 mL去離子水溶解,配成0.02 mol/L的AgNO3溶液;取0.25 g紫錐菊多酚加入50 mL去離子水,超聲震蕩溶解,得到5 g/L的紫錐菊多酚溶液;取0.15 g聚乙烯吡咯烷酮(PVP)加入50 mL去離子水,得3%的PVP溶液;取0.001 g KBH4溶于100 mL去離子水中,得到0.01% KBH4溶液。

1.2.2 化學(xué)合成法 將10 mL 0.02 mol/L AgNO3溶液與10 mL 3% PVP溶液混合,放入轉(zhuǎn)子,置于磁力攪拌器上攪拌1 h,同時將50 mL 0.01% KBH4溶液用注射器逐滴滴入,溶液由無色變?yōu)榈S色。

1.2.3 綠色合成法 將AgNO3溶液放入燒杯中,放入轉(zhuǎn)子,將紫錐菊多酚溶液逐滴加入硝酸銀溶液中攪拌,溶液由淡黃色變?yōu)樯钭厣?/p>

1.2.4 合成工藝優(yōu)化

1.2.4.1 容積比 AgNO3濃度按紫錐菊多酚(5 g/L):AgNO3溶液(0.02 mol/L)的體積比為1∶9、3∶7、5∶5、7∶3、9∶1制備紫錐菊多酚納米銀復(fù)合物,反應(yīng)物總體積為50 mL。將紫錐菊多酚溶液逐滴加入硝酸銀溶液中,攪拌1 h,采用紫外-可見分光光度計考察溶液在300～800 nm波長處的吸收情況。

1.2.4.2 AgNO3濃度 將硝酸銀溶液倍比稀釋,分別得到0.02、0.01、0.005、、0.002 5、0.001 25 mol/L的硝酸銀溶液,取硝酸銀溶液35 mL,放入轉(zhuǎn)子,將15 mL紫錐菊多酚溶液(5 g/L)逐滴加入硝酸銀溶液中,攪拌1 h,采用紫外-可見分光光度計考察溶液在300～800 nm波長處的吸收情況。

1.2.4.3 反應(yīng)時間 將60 mL紫錐菊多酚溶液(5 g/L)逐滴加入140 mL硝酸銀溶液(0.02 mol/L)中,攪拌2 h,在0、30、60、90、120 min時取溶液40 mL,采用紫外-可見分光光度計考察溶液在300～800 nm波長處的吸收情況。

1.2.4.4 反應(yīng)溫度 將60 mL紫錐菊多酚溶液(5 g/L)逐滴加入140 mL硝酸銀溶液(0.02 mol/L)中,分別放置在25、40、60、80、100℃溫度條件下反應(yīng)2 h,采用紫外-可見分光光度計考察溶液在300～800 nm波長處的吸收情況。

1.2.5 透射電鏡 用透射電子顯微鏡(TEM)對納米銀復(fù)合物進(jìn)行觀察。

1.2.6 粒徑與Zeta電位 取1 mL紫錐菊多酚納米銀復(fù)合物置于粒徑樣品池中,放入馬爾文納米激光粒度儀內(nèi),測定其粒徑分布及多分散指數(shù)(PDI)。取同樣稀釋后的脂質(zhì)體樣品0.8 mL,緩慢注入Zeta電位樣品池中,放入馬爾文納米激光粒度儀內(nèi),測定其Zeta電位值。

1.2.7 包封率 配制125、100、80、50、40、20、10 mg/L濃度梯度的紫錐菊多酚溶液,進(jìn)行稀釋后使用紫外分光光度計在218 nm處測定吸光度,制備標(biāo)準(zhǔn)曲線。取紫錐菊多酚-納米銀復(fù)合物9 mL于離心管內(nèi),于4 000 r/min離心30 min,取一定量的上清液,測定吸光度,包封率按照以下公式進(jìn)行計算:

包封率=(1-總藥量/游離藥量)×100%

1.2.8 體外釋放率 把透析袋剪成10～20 cm小段,在2%碳酸氫鈉和1 mmol/L乙二胺四乙酸(EDTA,pH 8.0)溶液中將透析袋煮沸10 min。將透析袋剪成單層后放在1 mmol/L的EDTA(pH 8.0)溶液中煮沸10 min。冷卻后置于4℃ 冰箱。接收池中注滿接收液,調(diào)溫為37℃。加熱,轉(zhuǎn)速為300 r/min。分別于不同時間取樣3 mL,接收液補足。取出樣品于4℃冰箱中保存,紫外分光光度計檢測其吸收波長。按照公式推算累計釋放量百分?jǐn)?shù):

累計釋放率=[Ck×V1+(C1+C2+……Ck-1)×V2]/M×100%

C1、C2、Ck-1分別表示在第1、2、k-1時間點處取樣的濃度,V1代表總體積,V2代表取樣體積。

1.2.9 穩(wěn)定性 按照上述最佳工藝制備紫錐菊多酚-納米銀復(fù)合物,置于4℃避光保存,將復(fù)合物稀釋后,每隔24 h吸取3.5 mL至石英比色皿中,使用紫外分光光度計檢測溶液在448 nm處的吸光度。

2 結(jié)果

2.1 合成工藝的優(yōu)化

2.1.1 確定最大吸收波長 取紫錐菊多酚溶液、硝酸銀溶液、紫錐菊多酚-納米銀復(fù)合物適量,使用紫外分光光度計對其進(jìn)行全波長掃描,最終確定紫錐菊多酚溶液最大吸收波長為218 nm,硝酸銀溶液無明顯吸收,紫錐菊多酚-納米銀復(fù)合物最大吸收波長為448 nm。

2.1.2 單因素試驗 由圖1A可知,按紫錐菊多酚(5 g/L):AgNO3溶液(0.02 mol/L)的體積比為1∶9、3∶7、5∶5制備紫錐菊多酚納米銀復(fù)合物,在448 nm處的吸光度隨著紫錐菊多酚溶液加入量的增加而增加;當(dāng)體積比為7∶3、9∶1時,隨著紫錐菊多酚溶液加入量增多,吸光度開始下降。由結(jié)果可知,最終確定紫錐菊多酚與硝酸銀溶液的體積比為3∶7。由圖1B可知,硝酸銀溶液濃度為0.02、0.01、0.005、0.002 5、0.001 25 mol/L時,紫錐菊多酚-納米銀復(fù)合物在448 nm處的吸光度隨著硝酸銀溶液濃度的降低而降低,最終確定合成工藝中硝酸銀的濃度為0.02 mol/L。由圖1C可知,紫錐菊多酚-納米銀復(fù)合物在448 nm處的吸光度隨著反應(yīng)時間的增加而增加,最終確定合成工藝中反應(yīng)時間為120 min。由圖1D可知,紫錐菊多酚-納米銀復(fù)合物在448 nm處的吸光度隨著反應(yīng)溫度的升高而增加,最終確定合成工藝中反應(yīng)時間為100℃。

a.容積比;B.AgNO3濃度;C.反應(yīng)時間;D.反應(yīng)溫度A.Volume ratio; B.Concentration of AgNO3; C.Incubation time; D.Incubation temperature

2.2 透射電鏡

按照最佳工藝獲得紫錐菊多酚-納米銀復(fù)合物使用透射電子顯微鏡觀察形態(tài),可以看到清晰存在的納米銀。如圖2,紫錐菊多酚-納米銀復(fù)合物呈現(xiàn)不規(guī)則的球形,大部分納米銀直徑位于100 nm以下,出現(xiàn)了少量的團聚現(xiàn)象。

圖2 紫錐菊多酚-納米銀復(fù)合物透射電鏡觀察

2.3 粒徑與Zeta電位

由圖3A和B可知,綠色合成法制得的紫錐菊多酚-納米銀復(fù)合物平均粒徑為118.4 dm,PDI為0.266,結(jié)果顯示出現(xiàn)2個峰peak1(156.7 dm,97.9%)和peak2(4 265 dm,2.1%);電位為-8.05 mV,表明納米銀復(fù)合物達(dá)到穩(wěn)定狀態(tài)。由圖3C可知,化學(xué)合成法制得的納米銀平均粒徑為110.7 nm,PDI為0.610,結(jié)果顯示出現(xiàn)2個峰peak1(270.4 nm,79.6%)和peak2(45.4 nm,20.4%)。

A.紫錐菊多酚-納米銀復(fù)合物粒徑分布;B 紫錐菊多酚-納米銀復(fù)合物電位分布;C.化學(xué)合成法制備的納米銀粒徑分布

2.4 包封率

按照最佳制備工藝制得紫錐菊多酚-納米銀復(fù)合物,經(jīng)離心得到上清液后,經(jīng)稀釋后測定,計算得出包封率為34.7%。

2.5 體外釋放率和穩(wěn)定性

如圖4A所示,根據(jù)結(jié)果繪制藥物釋放率曲線,藥物在0～6 h釋放,釋放率達(dá)到57.19%,在10 h后趨于平緩,在24 h時達(dá)到62.20%,說明紫錐菊多酚-納米銀復(fù)合物有良好的緩釋性能。

a.體外釋放率;B.穩(wěn)定性A.Cumulated release rate in vitro; B.Stability

穩(wěn)定性試驗表明,在4℃條件下,納米銀復(fù)合物穩(wěn)定性較好。如圖4B所示,紫錐菊多酚-納米銀復(fù)合物從第10天開始,基本達(dá)到穩(wěn)定狀態(tài)。

3 討論

本試驗通過單因素試驗優(yōu)化紫錐菊多酚-納米銀復(fù)合物的制備工藝,最終得到合成過程中的最佳體積比、硝酸銀濃度、反應(yīng)時間和反應(yīng)溫度,并對最佳合成工藝制得的納米銀復(fù)合物進(jìn)行了表征考察,主要包括紫外分光光度計掃描、透射電鏡觀察、粒徑、Zeta電位分析、體外釋放率以及穩(wěn)定性試驗。根據(jù)紫外分光光度計在300～800 nm處掃描結(jié)果可知,綠色合成法制備的納米銀在400～500 nm處出現(xiàn)特征吸收峰,表明納米銀合成。透射電子顯微鏡觀察結(jié)果表明,紫錐菊多酚-納米銀復(fù)合物呈現(xiàn)不規(guī)則的球形,大部分納米銀直徑位于100 nm以下,部分復(fù)合物發(fā)生了團聚。透射電子顯微鏡可以觀察的范圍和顆粒數(shù)量有限,因此,應(yīng)用納米激光粒度儀檢測樣品的粒徑和Zeta電位分布,結(jié)果表明,綠色合成法制備的紫錐菊多酚-納米銀復(fù)合物與化學(xué)合成法制備的納米銀相比,平均粒徑差異不大,但分布系數(shù)小,粒徑分布更加均勻;電位為-8.05 mV,表明納米銀復(fù)合物達(dá)到穩(wěn)定狀態(tài)。體外釋放率試驗表明,紫錐菊多酚-納米銀復(fù)合物有良好的緩釋性能。穩(wěn)定性試驗表明,在4℃條件下,納米銀復(fù)合物穩(wěn)定性較好。

本研究通過綠色合成法制備的紫錐菊多酚-納米銀復(fù)合物粒徑較小,分布均勻,在4℃條件下儲存穩(wěn)定,且體外釋放達(dá)到了一定的緩釋效果。將紫錐菊多酚制成納米銀復(fù)合物,改善了其在水中溶解性差的問題,有利于減少投藥量,提高藥物療效,為紫錐菊多酚在臨床獸醫(yī)上的使用提供了新的方法。天然產(chǎn)物納米制劑由于其作用機制獨特,不易耐藥性和殘留,具有綠色、無公害的特點,應(yīng)用于畜牧養(yǎng)殖業(yè)后,可能為養(yǎng)殖戶增收、鄉(xiāng)村振興帶來具有較大的效益,產(chǎn)生較大的社會價值和經(jīng)濟價值。本研究紫錐菊納米銀復(fù)合物采用綠色還原法合成,粒徑小,綠色安全,具有較大的研究潛力,有望為綠色發(fā)展畜牧業(yè)提供新的方向和靈感,在生物醫(yī)學(xué)和制藥工業(yè)中具有潛在的應(yīng)用前景,具有進(jìn)一步研究的價值[18]。