張彥翠,邱晨旭,高建亭,王 飛,趙興華,2*

(1.河北農(nóng)業(yè)大學(xué) 中獸醫(yī)學(xué)院,河北保定 071000;2.河北省獸醫(yī)生物技術(shù)創(chuàng)新中心,河北保定 071000)

金雀異黃酮(genistein,GEN)又名染料木素,化學(xué)名稱為4′,5,7-三羥基異黃酮(C15H10O5),是一種天然的植物雌激素[1],主要存在于豆科植物中,具有抗氧化、降血脂和防治骨質(zhì)疏松等多種生物活性[2]。此外,金雀異黃酮還可通過激活A(yù)MPK信號通路改善脂肪積累,通過緩解脂質(zhì)代謝紊亂和炎癥反應(yīng)改善蛋雞脂肪肝綜合征[3]。日糧中添加金雀異黃酮可調(diào)節(jié)肉雞腸黏膜緊密連接蛋白、細(xì)胞凋亡和炎性細(xì)胞因子分泌、改善腸黏膜屏障功能,從而緩解腸道損傷[4]。但金雀異黃酮的溶解度僅為0.029 mg/mL,在生物藥劑學(xué)分類系統(tǒng)(Biopharmaceutics classification system,BCS)中屬于低溶解性高滲透性的Ⅱ類藥物[5]。極低地溶解度導(dǎo)致生物利用度差,大大限制了其臨床應(yīng)用。

固體分散體(solid dispersion,SD)是指將藥物以無定形或分子形式均勻分散在聚合物載體中以固體形式存在的分散系統(tǒng)[6,7],可通過減小藥物粒徑、提高藥物潤濕性、維持藥物過飽和狀態(tài)及使藥物以非晶態(tài)形式存在[8,9]等方式提高難溶藥物溶解度和生物利用度。本研究通過旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)法,以聚乙烯吡咯烷酮(polyvinylpyrrolidone,PVP)K30為載體制備金雀異黃酮固體分散體(GEN-PVP K30 SD),并對其進行表征分析及體外溶出研究。

圖1 金雀異黃酮化學(xué)結(jié)構(gòu)式

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗藥品 金雀異黃酮標(biāo)準(zhǔn)品(含量≥99.5%),中國食品藥品檢定研究院產(chǎn)品;金雀異黃酮原料藥(含量98%),成都普瑞法科技開發(fā)有限公司;聚乙烯吡絡(luò)烷酮K30,上海阿拉丁有限公司產(chǎn)品;十二烷基硫酸鈉(分析純),福晨(天津)化學(xué)試劑有限公司產(chǎn)品。

1.1.2 主要試劑 甲醇(色譜純),塞默飛世爾科技(中國)有限公司產(chǎn)品;無水乙醇(分析純),福晨(天津)化學(xué)試劑有限公司產(chǎn)品;磷酸(色譜純),福晨(天津)化學(xué)試劑有限公司產(chǎn)品。

1.1.3 主要儀器 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(RE-52AA),上海亞榮生化儀器廠產(chǎn)品;藥物溶出儀(D-800LS),天津大學(xué)無線電廠產(chǎn)品;差式掃描量熱儀(DCS 3),瑞士Mettler Toledo公司產(chǎn)品;X射線衍射儀(D8 Advance),德國Bruker公司產(chǎn)品;傅里葉變換紅外光譜儀(Alpha),德國Bruker公司產(chǎn)品;掃描電子顯微鏡(MERLIN Compact),德國Carl Zeiss公司產(chǎn)品;恒溫恒濕箱(LHS-SC),上海一恒科學(xué)儀器有限公司產(chǎn)品;粒度分析儀(Zetasizer Nano ZS90),英國Malvern公司產(chǎn)品;高效液相色譜儀(Waters),美國Waters公司產(chǎn)品;紫外檢測器(Waters 2998),泵(Waters 1525),進樣器(Waters 2707),美國Waters公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 金雀異黃酮體外檢測方法的建立 采用高效液相色譜儀紫外檢測器261 nm進行含量檢測,流動相:甲醇∶水(含0.05%體積的磷酸)=70∶30(v/v);流速:1 mL/min;柱溫:37 ℃;進樣量:20 μL。

1.2.2 金雀異黃酮固體分散體的制備 采用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)法[10]制備固體分散體。GEN和PVP K30分別按照1∶1、1∶3、1∶5、1∶7和1∶9(w/w)的比例混合均勻,溶解于乙醇中,旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀在45 ℃、-0.01 MPa壓力的條件下蒸發(fā)濃縮,取出25 ℃干燥后研磨過100目篩,置于干燥器中備用。

1.2.3 金雀異黃酮固體分散體比例的篩選

1.2.3.1 粉末X射線衍射(powder X-ray diffraction,PXRD) 使用粉末X射線衍射儀對GEN、PVP K30以及旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)法制備的不同比例(1∶1、1∶3、1∶5、1∶7、1∶9)樣品(solid dispersion,SD;簡稱SD (1∶1～9))及其相對應(yīng)的物理混合物(physical mixture,PM;簡稱PM (1∶1～9))進行測定。測定條件為:電壓為40 kV,電流為15 mA,Cu-Ka輻射1.5418 ?,測試步長為0.01°,停留時間0.1 s,掃描范圍為5～35°。

1.2.3.2 差示量熱掃描(differential scanning calorimetry,DSC) 差示量熱掃描分析GEN、PVP K30、不同比例的旋蒸樣品及其物理混合物。將樣品粉末(3 mg～5 mg)放入鋁制坩堝中,并提前在坩堝蓋上打孔。測定條件為:溫度范圍30～320 ℃,升溫速度為10 ℃/min,氮氣保護,氮氣流速為50 mL/min。

1.2.3.3 累積溶出率的測定 將過量GEN、不同比例的金雀異黃酮固體分散體及其物理混合物粉末(均含100 mg原料藥)分別置于含有0.1%十二烷基硫酸鈉(sodium dodecyl sulfate,SDS)的磷酸鹽緩沖液(pH 6.8)中進行溶出試驗,設(shè)置溫度37℃±0.5℃,轉(zhuǎn)速為250 r/min[11]。從樣品倒入溶出介質(zhì)時開始計時,分別在2、5、10、20、30、60、90、120、240、360、480 min各取出1 mL,并補充同等溫度和體積的溶出介質(zhì)。將取出的溶液用0.22 μm濾膜過濾、稀釋,按照1.2.1進行測定。按照以下公式計算藥物累積溶出率[12],平行3次。

其中:Q為累積溶出百分率;Cn和Cn-1為各時間點取出的樣品濃度(mg/mL);Vn為各時間點固定取樣體積(mL);V0為溶出介質(zhì)體積(mL)。

1.2.4 金雀異黃酮固體分散體表征

1.2.4.1 傅里葉變換紅外光譜(fourier transform infrared spectrometer,FT-IR) 通過傅里葉變換紅外光譜儀對GEN、PVP K30、GEN-PVP K30 SD和PM(1∶7)樣品粉末進行分析。將樣品(2 mg)與溴化鉀(200 mg)混合均勻,研磨,壓片制樣。掃描范圍:4 000～500 cm-1,分辨率:0.1 cm-1。

1.2.4.2 掃描電子顯微鏡分析(scanning electron microscopy,SEM) 采用掃描電子顯微鏡對樣品GEN、PVP K30、GEN-PVP K30 SD和PM(1∶7)樣品粉末形態(tài)進行表征分析。將待測樣品粉末均勻涂于銅網(wǎng)格上,樣品噴金,氮氣保護,電壓為20 kV。

1.2.4.3 粒徑分析 采用動態(tài)光散射技術(shù)對GEN-PVP K30 SD樣品進行分析。取GEN-PVP K30 SD樣品加入適量蒸餾水中,超聲分散后將溶液稀釋至適當(dāng)濃度,放入石英比色皿中測量,重復(fù)3次。

1.2.5 金雀異黃酮固體分散體穩(wěn)定性研究 稱取100 mg GEN-PVP K30 SD樣品放入安瓿瓶中,置于40 ℃,75%相對濕度的恒溫恒濕箱中,分別于0、15、30、60、90、180 d取適量樣品進行粉末X射線衍射分析。

2 結(jié)果

2.1 金雀異黃酮標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

金雀異黃酮的濃度通過高效液相色譜法測得,樣品分離良好,溶液對樣品含量測定無干擾。以濃度(C)為橫坐標(biāo),峰面積(A)為縱坐標(biāo)繪制金雀異黃酮標(biāo)準(zhǔn)曲線?；貧w方程為y=-12 121.68 098+131 367.42 246x(R2=0.999 8),在0.019 5～40 μg/mL濃度范圍內(nèi),GEN濃度與峰面積線性關(guān)系良好。

2.2 金雀異黃酮固體分散體比例篩選

2.2.1 粉末X射線衍射(PXRD) PXRD結(jié)果如圖2所示,GEN在7.27、11.94、12.54、14.10、14.76、16.38、22.32、24.58°存在晶體衍射峰,這與Sowa A M[13]等結(jié)果一致,表明GEN結(jié)晶性良好;PVP K30無明顯晶體衍射峰;物理混合物中GEN的晶體衍射峰位置未發(fā)生改變,只是峰強度略有降低;除SD(1∶1)外,其他旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)樣品衍射圖中均未觀察到明顯GEN晶體衍射峰,表明GEN以無定形態(tài)分散于載體中,初步表明固體分散體制備成功。

圖2 GEN(a)、PVP K30(b)、SD(1∶1～9)(c～g)和PM(1∶1～9)(h～l)的PXRD圖

2.2.2 差示量熱掃描(DSC) GEN、PVP K30、SD(1∶1～9)和PM(1∶1～9)的DSC結(jié)果如圖3所示,GEN在302℃有一明顯的吸熱峰,這與Ashok A K[14]等報道一致;PVP K30在75～135℃之間有一個較微弱的吸熱峰;物理混合物都表現(xiàn)出低強度的吸熱峰,說明金雀異黃酮與載體之間只是簡單的物理混合;除SD(1∶1)外,其他旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)樣品圖未觀察到明顯的吸熱峰,證明金雀異黃酮以無定形態(tài)分散于載體中,這與PXRD結(jié)果相符合,再次證實金雀異黃酮固體分散體制備成功。

圖3 GEN(a)、PVP K30(b)、SD(1∶1～9)(c～g)和PM(1∶1～9)(h～l)的DSC圖

2.2.3 體外溶出測定 體外溶出結(jié)果如圖4所示,GEN在480 min內(nèi)的累積溶出率僅為0.17%,物理混合物PM(1∶3、1∶5、1∶7和1∶9)中的GEN累積溶出率分別達(dá)到12%、13%、14%和16%(圖4b);固體分散體SD(1∶3)的累積溶出率在360 min后達(dá)到20%,之后便趨于穩(wěn)定;SD(1∶5)的累積溶出率在30 min后趨于穩(wěn)定,為46%;SD(1∶7)的累積溶出率在60 min達(dá)到82%后便趨于穩(wěn)定;SD(1∶9)的累積溶出率在360 min后趨于穩(wěn)定,達(dá)到99%(圖4a)。這些結(jié)果表明,與金雀異黃酮原料藥和物理混合物相比,固體分散提高了金雀異黃酮的累積溶出率。然而,SD(1∶9)的載藥量較低,制備過程耗時長,再加上載體PVP K30的用量大會導(dǎo)致黏度大、吸水性強。因此,選擇藥載比為1∶7(GEN-PVP K30 SD)的配方進行后續(xù)研究。

圖4 GEN(a)、SD(1∶3～9) (b～e)和PM(1∶3～9) (f～i)的體外溶出曲線

2.3 金雀異黃酮固體分散體表征

2.3.1 紅外光譜分析(FT-IR) FT-IR結(jié)果如圖5所示,在3 410 cm-1和1 652 cm-1處分別為GEN中O-H和C=O的伸縮振動峰;在2 976 cm-1和1 656 cm-1處分別為PVP K30中C-H和C=O的伸縮振動峰;GEN和PVP K30的物理混合物的紅外光譜圖中既有GEN的伸縮振動峰也有PVP K30的伸縮振動峰,為GEN和PVP K30峰的疊加,表明GEN和PVP K30之間無分子相互作用;而GEN-PVP K30 SD中,GEN在3410 cm-1處的O-H伸縮振動峰減弱、增寬并向高波段數(shù)移動至3 423 cm-1處,而PVP K30在1 656 cm-1處的C=O伸縮振動峰減弱并移動到1 670 cm-1處。分子間鍵的特征峰發(fā)生了改變,表明GEN與PVP K30分子之間形成了氫鍵。

圖5 GEN(a)、PVP K30(b)、GEN-PVP K30 SD(c)和PM(1∶7)(d)的FT-IR圖

2.3.2 掃描電子顯微鏡分析(SEM) GEN、PVP K30、GEN-PVP K30 SD和物理混合物PM(1∶7)的SEM如圖6所示。GEN(圖6a)為表面光滑,相對規(guī)則的棒狀晶體;PVP K30(圖6b)呈現(xiàn)為球形顆粒,表面有輕微的凹陷;GEN-PVP K30 SD(圖6c)為不規(guī)則的塊狀結(jié)構(gòu),與金雀異黃酮原料藥和聚合物明顯不同;而在PM(1∶7)(圖6d)的物理混合物中可明顯看到GEN及PVP K30的存在。

圖6 GEN(a)、PVP K30(b)、GEN-PVP K30 SD(c)和PM(1∶7)(d)的SEM圖

2.3.3 粒徑分析 GEN-PVP K30 SD的粒徑如圖7所示。通過動態(tài)激光散射法,測量GEN-PVP K30 SD的平均粒徑為156 nm±3 nm,多分散性指數(shù)(polydispersity index,PDI)為0.155±0.04。結(jié)果表明,通過溶劑旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)制備的藥物-載體比為1∶7的固體分散體為納米級固體分散體,粒徑分布相對均勻。

圖7 GEN-PVP K30 SD的粒徑圖

2.4 金雀異黃酮固體分散體穩(wěn)定性測定結(jié)果

GEN-PVP K30 SD在溫度40 ℃,相對濕度75%的穩(wěn)定性試驗條件下不同時間的PXRD結(jié)果如圖8所示,在180 d內(nèi)固體分散體未出現(xiàn)晶體衍射峰,證明固體分散體該試驗條件下穩(wěn)定性良好。

圖8 GEN-PVP K30 SD穩(wěn)定性的PXRD圖

3 討論

金雀異黃酮可與雌激素受體β結(jié)合,上調(diào)關(guān)鍵酶基因表達(dá),直接作用于雞顆粒細(xì)胞,從而增加孕酮產(chǎn)量,提高體內(nèi)孕酮水平[15]。在飼料中添加20～80 mg/kg金雀異黃酮有助于肉雞增重[16],提高雛雞的生長性能。但金雀異黃酮水中的溶解度低,僅有0.029 mg/mL。金雀異黃酮含有多個極性基團羥基以及存在分子間氫鍵作用,導(dǎo)致金雀異黃酮親脂性,親水性較差。從而導(dǎo)致金雀異黃酮生物利用度低,限制其臨床應(yīng)用。杜先華[17]等將聚山梨酯80、聚乙二醇400和油酸乙酯以56∶14∶30的比例制備了金雀異黃酮微乳,在家兔的藥動學(xué)試驗表明,微乳的藥時曲線下面積(AUC0-10 h)是金雀異黃酮的2.32倍,顯著提高了金雀異黃酮的口服生物利用度。

固體分散體是提高難溶性藥物的溶解度和生物利用度的有效手段之一。Chaemin L等[18]以羥丙基醋酸纖維素甲基琥珀酸酯為載體,采用反溶劑沉淀法制備了葉黃素固體分散體,使葉黃素溶解量在2 h內(nèi)增加了95%。成偉業(yè)[19]等采用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)法制備了白藜蘆醇苷(polydatin,PD)固體分散體,原料藥累積溶出率為60%,而PD-SD的累積溶出率高達(dá)96.2%。該固體分散體在大鼠體內(nèi)的藥動學(xué)結(jié)果可知,PD、PD-SD的藥時曲線下面積分別為(139.70±21.49) μg/mL·h、(328.79±48.52) μg/mL·h,PD-SD的相對生物利用度是PD的2.35倍,顯著提高了其生物利用度。本研究采用PVP K30為載體,通過旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)法制備金雀異黃酮固體分散體,其累積溶出率達(dá)到82%,遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于金雀異黃酮的累積溶出率。

PVP是一種高分子聚合物載體材料,具有非離子型雙親性,良好的生物相容性及表面活性[20],可改善難溶性藥物的親水性,增加難溶藥物的溶解度,對難溶性藥物的抑晶作用較強[21],是常用的載體材料。PVP的K值表示其平均分子量,K值越大,黏度越高,增溶效果越好[22]。然而,高K值會導(dǎo)致固體分散體的黏度過高,而低K值則不能達(dá)到預(yù)期的增溶效果。因此選用PVP K30作為載體制備金雀異黃酮納米固體分散體。PVP K30具有一定的吸濕性,Jahangiri A[23]等對PVP K30進行DSC分析研究,發(fā)現(xiàn)其在75～135℃之間有一個較微弱的吸熱峰,表明PVP K30聚合物吸濕性而導(dǎo)致的水分損失。PVP K30與其他藥物的物理混合物表現(xiàn)出低強度的吸熱峰,可能是由于聚合物稀釋效應(yīng)[24]。從PVP K30的化學(xué)結(jié)構(gòu)來看,聚合物的羰基傾向于與藥物的官能團形成氫鍵,導(dǎo)致峰的移位或峰值增寬[25]。田茜[26]等利用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)法,以PVP K30為載體制備了不同比例的沙棘總黃酮(total flavonoids of hippophae,TFH)固體分散體,當(dāng)藥載比為1∶3時,溶出參數(shù)值最小。通過正交試驗設(shè)計制備方法,發(fā)現(xiàn)當(dāng)蒸發(fā)溫度為60℃、干燥時間為12 h時,TFH-SD的累積溶出率為90.22%,顯著提高TFH的溶解度。本研究通過PXRD、DSC和體外溶出試驗篩選最佳比例。結(jié)果發(fā)現(xiàn),GEN以無定形存在于載體中,這可能是由于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)法制備過程中,隨著溶劑的減少,PVP K30的黏度增加,藥物的流動性下降,GEN逐漸被包封在PVP K30中,阻止藥物顆粒的聚集,減小藥物的粒徑,抑制其結(jié)晶。

使用水溶性聚合物PVP K30制備固體分散體時,固體分散體中活性藥物成分的釋放或溶出有兩種模式,即藥物控制的釋放模式和載體基質(zhì)控制的釋放模式。固體分散體制劑在溶解時,表面會形成載體擴散層[27],藥物會先通過擴散層再釋放到溶出介質(zhì)中。當(dāng)固體分散體載藥量較高且藥物在擴散層的溶解度較小時,藥物以藥物顆粒的形式釋放到介質(zhì)中,此時由藥物性質(zhì)控制藥物的釋放;當(dāng)載藥量較低且載體擴散層黏度較大時,藥物通過擴散層的速度變慢,溶解在擴散層中以分子的形式釋放到介質(zhì)中,此時由載體性質(zhì)控制藥物的釋放,但兩種釋放模式可能同時存在[28]。本研究中隨著PVP K30比例的增大,固體分散體在溶解時能夠更好地形成載體擴散層,有利于GEN分子的擴散。然而,當(dāng)PVP K30與GEN的比例為1∶9(w/w)時,固體分散體制備耗時長且溶解時黏度高,所以選擇藥載比為1∶7(w/w)的配方為最佳比例。物理混合物也不同程度上提高GEN的累積溶出率,這可能是由于PVP K30的表面活性和結(jié)晶抑制作用,在一定程度上減緩了GEN的結(jié)晶,從而維持了藥物的過飽和[29]。

綜上所述,以PVP K30為載體,利用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)法成功制備了金雀異黃酮納米固體分散體,該納米固體分散體可顯著提高金雀異黃酮的累積溶出率,為提高金雀異黃酮的生物利用度,擴大其臨床應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。