李球棣,丁奕博,郭虹波,王文世

(徐州醫(yī)科大學(xué),江蘇省免疫與代謝重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,江蘇徐州 221004)

丁型肝炎病毒(Hepatitis D virus,HDV)是引發(fā)全球慢性病毒性肝炎的主要原因之一。HDV是一種有缺陷的人類病毒,缺乏產(chǎn)生自身囊膜蛋白的能力,因此其包裝成感染性顆粒需依賴于輔助病毒的存在[1-2]。迄今為止,乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus,HBV)被認(rèn)為是唯一與HDV相關(guān)的輔助病毒[3]。

HDV屬于單負(fù)鏈RNA病毒,病毒顆粒直徑為35～37 nm,基因組為1.7 kb,是目前已知的能夠感染人類的最小RNA病毒[1,4]。HDV基因組只編碼一種蛋白,命名為丁型肝炎抗原(Hepatitis D antigen,HDAg)。HDAg蛋白有兩種存在形式,即小HDAg(small HDAg,S-HDAg)和大HDAg(large HDAg,L-HDAg)。S-HDAg是啟動(dòng)和維持HDV RNA復(fù)制所必需的,而L-HDAg對(duì)病毒的組裝與釋放具有重要意義。在細(xì)胞內(nèi)積累部分S-HDAg后,反基因組被細(xì)胞腺苷脫氨酶1(adenosine deaminase 1,ADAR1)編輯生成L-HDAg。相對(duì)于S-HDAg,L-HDAg在C端延伸了19個(gè)氨基酸[5]。在C端延伸區(qū)內(nèi)包含了L-HDAg蛋白發(fā)揮主要功能的功能域,如CXXQ基序。此基序?yàn)榉峄D(zhuǎn)移酶的底物之一,當(dāng)法尼基轉(zhuǎn)移酶識(shí)別CXXQ基序后,將法尼基轉(zhuǎn)移至第211位的半胱氨酸殘基上使L-HDAg發(fā)生法尼基化,L-HDAg在法尼基化位點(diǎn)的驅(qū)動(dòng)下與S-HBsAg相互作用包裝成完整的病毒顆粒[1]。

目前,雖然尚無高效、特異性的直接抗HDV藥物應(yīng)用于臨床,但一些新藥正處于研制過程中[6-7]。其中洛那法尼(Lonafarnib,LNF)是一種治療丁型肝炎的首創(chuàng)口服新藥,阻斷HDV組裝釋放的關(guān)鍵步驟[8-10]。因此,LNF受到了歐洲藥品管理局與美國(guó)食品和藥品管理局的青睞,其被授予突破性藥物資格和優(yōu)先藥物資格[11]。然而,LNF的治療可以誘導(dǎo)HDV基因組的積累,但未對(duì)其機(jī)制進(jìn)行探討[12]。

近年有研究者在鹿、土撥鼠、鳥類、蛇、魚類、兩棲動(dòng)物以及無脊椎動(dòng)物中發(fā)現(xiàn)了類似HDV的病毒[13-16],并且這些新型的HDV樣病毒皆與肝病毒感染無關(guān)[14]。人源HDV與動(dòng)物源HDV樣病毒最顯著的差異在于動(dòng)物源HDV缺乏L-HDAg蛋白或法尼基化信號(hào)區(qū)?；诖?本研究通過對(duì)人源HDV感染性克隆進(jìn)行改造,使其缺失L-HDAg或法尼基化的能力來模擬動(dòng)物源HDV病毒的關(guān)鍵特征,并初步解析了LNF對(duì)動(dòng)物源HDV病毒的作用,為深入了解動(dòng)物源HDV提供了有效參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞系、菌株及質(zhì)粒 人肝癌細(xì)胞Huh7、pcDNA3.1-pJC126質(zhì)粒(表達(dá)野生型L-HDAg)、pcDNA3.1-pJC126-L(del)質(zhì)粒(不表達(dá)L-HDAg)、pcDNA3.1-pJC126-C211S(法尼基化位點(diǎn)突變)等,均由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建或保存。

1.1.2 主要試劑 Lonafarnib 抑制劑(S 2797),美國(guó)Selleck公司產(chǎn)品;DMEM高糖培養(yǎng)基(BC-M-005-500 mL),南京生航生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品;HDAg兔多克隆抗體,徐州醫(yī)科大學(xué)免疫與代謝重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室制備;Cora Lite 594偶聯(lián)的抗兔IgG(SA 00013-4)、HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG(SA 00001-2),武漢三鷹生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品;ECL化學(xué)發(fā)光顯影液(P 10100),蘇州新賽美生物科技有限公司產(chǎn)品;First-Strand cDNA Synthesis Kit(K 1072),美國(guó)APExBIO公司產(chǎn)品;Luna通用探針法qPCR預(yù)混液(M 3004 L),美國(guó)NEB有限公司產(chǎn)品;G418抗生素(HY-17561),美國(guó)MCE有限公司產(chǎn)品。

1.1.3 主要儀器 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)儀(LC 480),美國(guó)羅氏公司產(chǎn)品;電泳儀電源(WIX-EP300)、電泳槽(WIX-miniBLOT),中國(guó)韋克斯科技有限公司產(chǎn)品;細(xì)胞培養(yǎng)箱(Heracell 150i),美國(guó)賽默飛科技有限公司產(chǎn)品;倒置熒光顯微鏡(IX 51),日本奧林巴斯公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 Huh7-pJC126、Huh7-pJC126-C211S、Huh7-pJC126-L(del)穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系的構(gòu)建 將Huh7細(xì)胞接種于6孔板中培養(yǎng)過夜,當(dāng)細(xì)胞密度為80%～90%時(shí),采用Jetprime轉(zhuǎn)染試劑分別將pcDNA3.1-pJC126質(zhì)粒、pcDNA3.1-pJC126-C211S質(zhì)粒、pcDNA3.1-pJC126-L(del)轉(zhuǎn)染至Huh7細(xì)胞中,24 h后更換培養(yǎng)基,換液后48 h后加入篩選抗生素(G418終濃度為1 mg/mL),經(jīng)篩選擴(kuò)增培養(yǎng)后得到Huh7-pJC126、Huh7-pJC126-C211S、Huh7-pJC126-L(del)穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系。Huh7-pJC126細(xì)胞系可表達(dá)野生型L-HDAg;Huh7-pJC126-C211S穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系表達(dá)的L-HDAg法尼基化位點(diǎn)被突變;Huh7-pJC126-L(del)細(xì)胞系不表達(dá)L-HDAg。

1.2.2 間接免疫熒光驗(yàn)證Huh7-pJC126、Huh7-pJC126-C211S、Huh7-pJC126-L(del)穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系 本試驗(yàn)設(shè)有2種陰性對(duì)照,Huh7細(xì)胞、轉(zhuǎn)染HDV復(fù)制缺陷型質(zhì)粒的Huh7細(xì)胞,同時(shí)將以上3種穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系進(jìn)行鋪板。利用間接免疫熒光檢測(cè)各組12 d和18 d樣本中的HDAg表達(dá)情況,從而反應(yīng)各穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系中HDV RNA復(fù)制能力是否正常。一抗使用本實(shí)驗(yàn)室制備的HDAg兔多克隆抗體(1∶4 000),二抗使用Cora Lite 594偶聯(lián)的抗兔IgG(1∶500),用Hoechst(1∶500)染細(xì)胞核,在普通光學(xué)顯微鏡下觀察。

1.2.3 蛋白質(zhì)免疫印跡法驗(yàn)證Huh7-pJC126、Huh7-pJC126-C211S、Huh7-pJC126-L(del)穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系 將Huh7細(xì)胞和以上3種穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系接種于6孔板,收集各組第6天的細(xì)胞提取總蛋白,各組取等量的樣本進(jìn)行蛋白質(zhì)免疫印跡分析,用本實(shí)驗(yàn)室制備的HDAg兔多克隆抗體檢測(cè)各組的S-HDAg與L-HDAg的表達(dá)情況。

1.2.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qPCR)檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)HDV RNA水平 收集各組別的細(xì)胞,用Trizol法提取細(xì)胞總RNA,測(cè)定RNA濃度,利用First-Strand cDNA Synthesis Kit逆轉(zhuǎn)錄為cDNA,將cDNA稀釋5倍后按照熒光定量PCR試劑盒的說明書檢測(cè)各樣本中HDV RNA水平。qPCR參數(shù)為:65℃ 1 min;95℃ 15 s,60℃ 30 s,循環(huán)40次。用不同比例稀釋的HDV基因組質(zhì)粒來量化各試驗(yàn)組的HDV基因組拷貝數(shù)。

上游引物:GCGCCGGCYGGGCAAC

下游引物:TTCCTCTTCGGGTCGGCATG

探針:CGCGGTCCGACCTGGGCATCCG(5′-FAM、3′-TAMRA)

1.2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 本實(shí)驗(yàn)采用GraphPad Prime 9軟件統(tǒng)計(jì)分析數(shù)據(jù),計(jì)量資料以(平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差)表示。經(jīng)正態(tài)性和方差齊性檢驗(yàn),具有正態(tài)性和方差齊性的的兩組比較采用t檢驗(yàn),方差不齊的計(jì)量數(shù)據(jù)使用Welch校正F檢驗(yàn),非正態(tài)分析采用非參數(shù)檢驗(yàn)。假設(shè)檢驗(yàn)水準(zhǔn)按α=0.05判定,*表示P<0.05,**表示P<0.01,***表示P<0.001。

2 結(jié)果

2.1 動(dòng)物源HDV病毒基因組特征分析及模擬動(dòng)物源HDV感染性克隆的構(gòu)建

通過收集文獻(xiàn)數(shù)據(jù)及美國(guó)生物技術(shù)信息中心(National center for biotechnology information,NCBI)數(shù)據(jù)庫發(fā)現(xiàn),動(dòng)物源HDV基因組大小與人源HDV相近,約為1.5 kb～1.7 kb。但是,HDAg蛋白的表現(xiàn)形式存在差異。如圖1所示,鹿、蝙蝠來源的HDV樣病毒RNA可被編輯,但暫未檢測(cè)到L-HDAg的表達(dá);土撥鼠等來源的HDV樣病毒RNA未發(fā)現(xiàn)被ADAR1編輯;而對(duì)蛇來源的HDV樣病毒基因組序列分析顯示在S-HDAg末端可能存在著潛在的編輯位點(diǎn),并有文獻(xiàn)報(bào)道,其可能表達(dá)L-HDAg,但不存在法尼基化位點(diǎn)[17]。以上分析表明,人源HDV與動(dòng)物來源的HDV樣病毒最顯著的差異在于動(dòng)物源HDV樣病毒缺乏L-HDAg蛋白或法尼基化信號(hào)區(qū)?；诖?本試驗(yàn)以人源HDV-1型的感染性克隆質(zhì)粒為模板將L-HDAg第211位半胱氨酸突變?yōu)榻z氨酸,構(gòu)建了HDV基因組法尼基化位點(diǎn)突變的質(zhì)粒(pJC126-C211S)。將編輯區(qū)域的密碼子突變?yōu)榻K止密碼子構(gòu)建了L-HDAg缺失質(zhì)粒(pJC126-L(del)),質(zhì)粒示意圖如圖2。

圖1 動(dòng)物源HDV病毒基因組特征分析

圖2 pJC126-C211S質(zhì)粒(法尼基化位點(diǎn)突變)與pJC126-L(del)質(zhì)粒(L-HDAg缺失)

2.2 Huh7-pJC126-C211S、Huh7-pJC126-L(del)感染性克隆能正常復(fù)制

為了檢測(cè)以上2種突變體是否能啟動(dòng)HDV復(fù)制,將突變后的HDV基因組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至Huh7細(xì)胞中構(gòu)建Huh7-pJC126-C211S、Huh7-pJC126-L(del)穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系。間接免疫熒光檢測(cè)結(jié)果顯示,將以上2種細(xì)胞系與野生型人源HDV細(xì)胞系Huh7-pJC126分別培養(yǎng)12 d和18 d后,Huh7-pJC126、Huh7-pJC126-C211S和Huh7-pJC126-L(del)均能正常啟動(dòng)HDV復(fù)制,成功表達(dá)HDAg(圖3)。而HDV復(fù)制缺陷質(zhì)粒(陰性對(duì)照)未觀察到HDAg陽性細(xì)胞。說明缺失L-HDAg或破壞L-HDAg法尼基化位點(diǎn),HDV依然能正常復(fù)制。該結(jié)果間接證實(shí)動(dòng)物源HDV能進(jìn)行病毒的復(fù)制。

1.人肝癌細(xì)胞;2.瞬時(shí)轉(zhuǎn)染HDV復(fù)制缺陷型質(zhì)粒的人肝癌細(xì)胞;3.穩(wěn)定表達(dá)HDV基因的人肝癌細(xì)胞;4、穩(wěn)定表達(dá)法尼基化位點(diǎn)突變的HDV基因組的人肝癌細(xì)胞(pJC126-C211S);5.穩(wěn)定表達(dá)L-HDAg缺失的HDV基因組的人肝癌細(xì)胞(pJC126-L(del));紅色代表HDAg;藍(lán)色代表細(xì)胞核

2.3 Huh7-pJC126-C211S、Huh7-pJC126-L(del)穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞中L-HDAg蛋白的表達(dá)情況

與此同時(shí),利用蛋白質(zhì)免疫印跡法檢測(cè)了Huh7-pJC126-C211S、Huh7-pJC126-L(del)穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞中L-HDAg的表達(dá)。結(jié)果顯示,Huh7-pJC126、Huh7-pJC126-C211S細(xì)胞的樣品在24 ku與27 ku處有特異性條帶,與預(yù)期中的S-HDAg蛋白和L-HDAg蛋白的大小相符,而Huh7-pJC126-L(del)細(xì)胞確實(shí)失去了表達(dá)L-HDAg蛋白的能力(圖4)。以上結(jié)果說明Huh7-pJC126-C211S、Huh7-pJC126-L(del)穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞能模擬動(dòng)物源HDV的關(guān)鍵特征,可以用于后續(xù)試驗(yàn)。

1.人肝癌細(xì)胞;2.穩(wěn)定表達(dá)HDV基因的人肝癌細(xì)胞;3.人肝癌細(xì)胞;4.穩(wěn)定表達(dá)法尼基化位點(diǎn)突變的HDV基因組的人肝癌細(xì)胞(pJC126-C211S);5.人肝癌細(xì)胞;6.穩(wěn)定表達(dá)L-HDAg缺失的HDV基因組的人肝癌細(xì)胞

2.4 L-HDAg缺失或法尼基化信號(hào)區(qū)突變,LNF未促進(jìn)HDV RNA復(fù)制

為了模擬LNF對(duì)動(dòng)物源HDV病毒復(fù)制的影響,本試驗(yàn)用2 μmol/L LNF連續(xù)處理人源野生型HDV細(xì)胞模型、具有動(dòng)物源HDV基因組特征(L-HDAg缺失或法尼基化信號(hào)區(qū)突變)的細(xì)胞模型12 d或18 d。結(jié)果顯示,在LNF處理之后,人源野生型HDV細(xì)胞模型Huh7-pJC126中的HDV RNA水平顯著性上升(約6倍),而Huh7-pJC126-C211S、Huh7-pJC126-L(del)細(xì)胞中的HDV RNA水平并未因法尼基轉(zhuǎn)移酶抑制劑的處理而發(fā)生改變。以上結(jié)果表明,當(dāng)L-HDAg缺失或法尼基化信號(hào)區(qū)缺陷時(shí),LNF不能促進(jìn)HDV RNA的復(fù)制,提示LNF不會(huì)促進(jìn)動(dòng)物源HDV病毒RNA的復(fù)制。

3 討論

丁型肝炎病毒(HDV)是人類慢性病毒性肝炎的主要病原體之一,但是近年來在鳥類、蛇、魚類、兩棲動(dòng)物和無脊椎動(dòng)物中發(fā)現(xiàn)了類似HDV的病毒[14,18-19]。研究報(bào)道,動(dòng)物來源的HDV樣病毒不表達(dá)L-HDAg蛋白或缺少法尼基化信號(hào)區(qū),說明HDV樣病毒不需要依賴HBV進(jìn)行傳播,提示HDV或許可以利用其他病毒的幫助實(shí)現(xiàn)其組裝和釋放。除HBV以外,其他病毒也可作為HDV的輔助病毒[20]。本研究以人源HDV感染性克隆質(zhì)粒為模板構(gòu)建了pJC126-C211S質(zhì)粒(法尼基化位點(diǎn)缺失)與pJC126-L(del)質(zhì)粒(L-HDAg缺失),用來模擬動(dòng)物源HDV的關(guān)鍵特征。結(jié)果證實(shí),缺失L-HDAg或破壞L-HDAg法尼基化位點(diǎn),HDV依然能正常復(fù)制。該結(jié)果間接證實(shí)了動(dòng)物源HDV能進(jìn)行病毒復(fù)制,為進(jìn)一步研究其致病機(jī)理奠定了基礎(chǔ)。LNF是一種法尼基轉(zhuǎn)移酶抑制劑,2018年被授予用于治療HDV感染的突破性藥物資格[9]。LNF能抑制HDV組裝[21],同時(shí)可以誘導(dǎo)HDV基因組的積累[12]。本研究結(jié)果顯示,當(dāng)L-HDAg缺失或法尼基化信號(hào)區(qū)缺陷時(shí),LNF不能促進(jìn)HDV RNA的復(fù)制,提示LNF不會(huì)促進(jìn)動(dòng)物源HDV RNA的復(fù)制。本研究證實(shí)人源HDV與動(dòng)物源HDV在病毒的生命周期和藥物的作用效果方面均存在較大差異。