李倩楠,馬 園,郝陸瑤,張艷妮,郭志凱,丁玉林,杜 山,王 瑞

(內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學 獸醫(yī)學院/國家級動物醫(yī)學實驗教學中心,內(nèi)蒙古呼和浩特 010018)

家畜外寄生蟲病是一類對世界各地畜牧業(yè)發(fā)展產(chǎn)生嚴重影響的疾病。家畜外寄生蟲主要包括蜱、螨、虱和蠅等,但不同地區(qū)環(huán)境家畜外寄生蟲的優(yōu)勢種類不同。蠅類除了侵擾人類、污染食物,其危害性更在于引發(fā)多種疾病、導(dǎo)致蠅蛆病的傳播。蠅蛆病是指蠅類幼蟲寄生在人體或動物組織和器官引發(fā)的疾病。據(jù)報道,我國已有300余例不同類型的蠅蛆病患者,其中多數(shù)是由屬于狂蠅科和皮下蠅科的幼蟲所引起的眼蠅蛆病和皮膚蠅蛆病。多年來,家畜外寄生蟲病的防治措施多采取使用廣譜化學藥物殺蟲,但隨著驅(qū)蟲藥的大量泛用、濫用,也形成了藥物殘留、耐藥性、環(huán)境污染和殺蟲效率低等諸多問題。因此,怎樣解決這些問題,尋求高效、簡便的替代方法,是當今外寄生蟲防治工作亟待解決的關(guān)鍵問題。其中,借助天敵防治外寄生蟲病是一種極具潛力的寄生蟲防治模式,被各國研究人員廣泛探討與深入研究[1-3]。

據(jù)統(tǒng)計,昆蟲病原真菌可以感染5種目、24種科、200多種昆蟲寄主,且其致病死亡率占所有病原微生物的60%[4]。在眾多昆蟲病原真菌中,棕色綠僵菌是一種廣譜昆蟲病原真菌,它能有效地減少宿主體表及環(huán)境中的外寄生蟲,并且不會對環(huán)境造成污染、沒有殘留物、對人畜無害,因此可以用來進行大規(guī)模生物防治。昆蟲的外表皮由蛋白質(zhì)、幾丁質(zhì)和脂質(zhì)等構(gòu)成,蛋白質(zhì)含量約占70%,幾丁質(zhì)嵌入在蛋白質(zhì)基質(zhì)中[5]。昆蟲病原真菌可通過酶解和機械壓力穿透寄主體壁侵入其體內(nèi)。在此過程中,會產(chǎn)生蛋白酶、幾丁質(zhì)酶和脂酶等多種胞外酶,其中蛋白酶能夠最先產(chǎn)生。因此,確定蛋白酶的活性是決定真菌侵染力的首要因素[6-7]。綠僵菌依靠其分生孢子附著在昆蟲體表,利用氨基酸、蛋白質(zhì)等營養(yǎng)物質(zhì)萌發(fā)并分泌蛋白酶、幾丁質(zhì)酶[8-9]等穿透昆蟲表皮,在昆蟲體內(nèi)迅速繁殖,釋放出毒素[10]致使昆蟲死亡[11]。此外,國外的研究發(fā)現(xiàn)在培養(yǎng)基中加入誘導(dǎo)物能夠有效促進真菌蛋白質(zhì)的產(chǎn)生。在之前的研究中,研究人員王瑞等[12-13]對少孢節(jié)叢孢菌和具有捕食線蟲性質(zhì)的真菌(Duddingtoniaflagrans)在應(yīng)用不同的培養(yǎng)基和誘導(dǎo)物的發(fā)酵液下進行了蛋白質(zhì)誘導(dǎo)和殺蟲效果的研究。研究結(jié)果表明,培養(yǎng)基及誘導(dǎo)物的不同會影響到少孢節(jié)叢孢菌和Duddingtoniaflagrans的代謝過程。因此,本試驗旨在分析不同培養(yǎng)基和誘導(dǎo)物對棕色綠僵菌產(chǎn)生胞外蛋白質(zhì)的誘導(dǎo)效果以及發(fā)酵液的生化特性。通過此次研究,可以為今后深入探索棕色綠僵菌在液體培養(yǎng)發(fā)酵液中產(chǎn)生的殺蟲相關(guān)物質(zhì)和作用機理提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 待試菌株為棕色綠僵菌(Metarhiziumbrunneum)KVL04-57,保存于-80 ℃低溫冰箱,由內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學獸醫(yī)學院寄生蟲學實驗室提供;待試蠅蛆為家蠅三期幼蟲,采自內(nèi)蒙古牧區(qū)健康羊只新鮮糞便;待試草原革蜱(Dermacentornuttalli),采集于內(nèi)蒙古四子王旗。

1.1.2 主要試劑 K2HPO4·3H2O、FeSO4·7H2O、明膠、吐溫-80、蛋白胨,天津市科盟化工工貿(mào)有限公司產(chǎn)品;葡萄糖、硫酸銨、瓊脂粉、MgSO4·7H2O、KH2PO4、Tris、Glycine、SDS、甲醇、冰醋酸、偶氮酪蛋白、酵母提取物、考馬斯亮藍R-250、異丙醇、三氯乙酸、NaOH,天津風船化學試劑科技有限公司產(chǎn)品;SDS-PAGE凝膠試劑盒、Brodford蛋白濃度測定試劑盒、堿性磷酸酶(AKP)測定試劑盒與酸性磷酸酶(ACP)測定試劑盒,上?？瓢┥锛夹g(shù)有限公司產(chǎn)品;馬鈴薯,農(nóng)貿(mào)市場購置。

1.1.3 培養(yǎng)基 薩氏培養(yǎng)液SDY(Sabouraud dextrose medium with yeast extract)、馬鈴薯液體培養(yǎng)基PD(potato dextrose)、枸櫞酸液體培養(yǎng)基。

1.1.4 主要溶液 5×蛋白緩沖液、孢子洗脫液、預(yù)染液、考馬斯亮藍染色液、脫色液等。

1.1.5 主要儀器 超凈工作臺(CW-CT-27-D),蘇州凈化設(shè)備有限公司產(chǎn)品;全自動高壓鍋(XFH-30CA),上海天美儀拓實驗室設(shè)備有限公司產(chǎn)品;生化培養(yǎng)箱(SP-02),上海赫田科學儀器有限公司產(chǎn)品;分析天平(AY120),島津企業(yè)管理(中國)有限公司產(chǎn)品;智能搖床(BSD-YX2400),上海赫田科學儀器有限公司產(chǎn)品;垂直電泳槽和電泳儀(KEEBIO-VE 180),北京通世華港設(shè)備有限公司產(chǎn)品;凝膠成像系統(tǒng)(BioSpectrum),北京深藍云生物科技有限公司產(chǎn)品;酶標儀(Biotek ELX800),美谷分子儀器(上海)有限公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 棕色綠僵菌發(fā)酵液的制備與收集 薩氏發(fā)酵液的制備:取已經(jīng)高壓滅菌的薩氏培養(yǎng)液4份,其中3份分別加入定量滅菌后的蠅蛆三期幼蟲、草原革蜱、終質(zhì)量濃度為0.05 g/L的苯丙氨酸和纈氨酸混合液(1∶1)作為誘導(dǎo)物,第4份添加蒸餾水作對照。之后把棕色綠僵菌孢子混懸液用孢子洗脫液稀釋至1×107個/mL,吸取 1 mL孢子混懸液分別加入到各個培養(yǎng)基內(nèi),在26 ℃、180 r/min恒溫搖床中培養(yǎng)。隔天按時觀察,7 d后用高壓后的濾紙過濾,收集棕色綠僵菌發(fā)酵液,所得發(fā)酵液保存于4 ℃冰箱。

馬鈴薯液體發(fā)酵液的制備:同薩氏發(fā)酵液的制備過程。

枸櫞酸液體發(fā)酵液的制備:同薩氏發(fā)酵液的制備過程。

1.2.2 棕色綠僵菌發(fā)酵液菌的SDS-PAGE分析 按照規(guī)定程序制備12%分離凝膠和6%濃縮凝膠[12-13]。電泳開始時,先設(shè)置電壓為80 V進行電泳,當指示劑從濃縮膠完全移動到分離膠后,將電壓調(diào)整為130 V繼續(xù)電泳。到溴酚藍移動到間隔分離膠底端近1 cm時,中止電泳。接著,用考馬斯亮藍染液染色6 h,倒入脫色液脫色過夜。脫色后出現(xiàn)清晰可見的蛋白質(zhì)條帶后,照膠拍照。

1.2.3 棕色綠僵菌發(fā)酵液中蛋白質(zhì)含量的測定 根據(jù)Brodford蛋白濃度測定試劑盒說明書對制備好的發(fā)酵液中蛋白質(zhì)濃度進行檢測。

1.2.4 棕色綠僵菌發(fā)酵液中蛋白酶活性的測定 在1.5 mL無菌、無酶離心管中將25 μL發(fā)酵液吸取到管中,每種發(fā)酵液均設(shè)置3個平行樣本。隨后,向每個離心管中加入500 μL的偶氮酪蛋白溶液(pH 7,濃度為5 mg/mL)。將樣品混勻后,在37℃水浴鍋中水浴1 h,水浴結(jié)束后加入200 μL的三氯乙酸溶液中止反應(yīng),放入離心機以13000 r/min離心4 min后收集上清,將0.5 mL 1 mol/L NaOH溶液和0.5 mol/L離心后的上清液加入新的離心管中并充分混合。吸出300 μL加入96孔板中,在酶標儀預(yù)熱30 min后將96孔板放入,檢測波長為450 nm時的吸光值。在空白對照組中,使用蒸餾水代替發(fā)酵液,其余步驟與上述相同。通過獲得的吸光度值計算蛋白酶活性(U/mL)。計算公式如下:

1.2.5 棕色綠僵菌發(fā)酵液中磷酸酶活性的測定 按照堿性磷酸酶(AKP)測定試劑盒和酸性磷酸酶(ACP)測定試劑盒說明書操作步驟進行檢測。

1.2.6 棕色綠僵菌發(fā)酵液殺蠅蛆毒性試驗 將棕色綠僵菌發(fā)酵液分為12個試驗組,并將PBS(phosphate buffered saline)牛血清白蛋白溶液設(shè)置為對照組,每組均含有10只三期幼蟲蠅蛆。將收集的蠅蛆三期幼蟲,分別放入無菌平皿中,采用浸漬法,將蠅蛆在發(fā)酵液中停留15 s然后再將蠅蛆放入無菌培養(yǎng)皿中,蓋上4層潮濕紗布后放入4 ℃冰箱過夜。24 h后等到平皿恢復(fù)到室溫時,察看蟲體活力和形態(tài),并統(tǒng)計死亡率。

數(shù)據(jù)處理 :根據(jù)觀察計算接種發(fā)酵液蠅蛆三期幼蟲的死亡率。

1.2.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析 試驗數(shù)據(jù)使用Microsoft Excel 2013軟件整理,試驗數(shù)據(jù)用“平均值±標準差”來表示。

2 結(jié)果

2.1 棕色綠僵菌發(fā)酵液的SDS-PAGE分析

利用SDS-PAGE分析不同培養(yǎng)基及誘導(dǎo)物培養(yǎng)的PD、枸櫞酸、SDY發(fā)酵液,結(jié)果詳見圖1。泳道1至4顯示出兩條明顯的條帶,分別位于25 ku和30 ku左右,而第4泳道的條帶最為清晰。另外,泳道5至8分別展現(xiàn)出在14 ku、25 ku、40 ku和70 ku左右位置具有明顯的條帶,這表明枸櫞酸培養(yǎng)基所產(chǎn)生的蛋白種類較為豐富。從圖2可以看出,第1至第4泳道在約20 ku、25 ku和30 ku處呈現(xiàn)出清晰的條帶。

M.蛋白分子質(zhì)量標準;1.PD培養(yǎng)基對照組;2.氨基酸誘導(dǎo)的PD培養(yǎng)基組;3.草原革蜱誘導(dǎo)的PD培養(yǎng)基組;4.蠅蛆三齡幼蟲誘導(dǎo)的PD培養(yǎng)基組;5.氨基酸誘導(dǎo)的枸櫞酸培養(yǎng)基組;6.草原革蜱誘導(dǎo)的枸櫞酸培養(yǎng)基組;7.蠅蛆三齡幼蟲誘導(dǎo)的枸櫞酸培養(yǎng)基組;8.枸櫞酸培養(yǎng)基對照組

M.蛋白分子質(zhì)量標準;1.SDY培養(yǎng)基對照組;2.蠅蛆三齡幼蟲誘導(dǎo)的SDY培養(yǎng)基組;3.氨基酸誘導(dǎo)的SDY培養(yǎng)基組;4.草原革蜱誘導(dǎo)的SDY培養(yǎng)基組

2.2 棕色綠僵菌發(fā)酵液中蛋白質(zhì)濃度的測定

通過表1可得知,培養(yǎng)棕色綠僵菌的不同液體培養(yǎng)基中,蛋白質(zhì)濃度差異較大。其中,枸櫞酸發(fā)酵液中的蛋白質(zhì)濃度高于PD發(fā)酵液及SDY發(fā)酵液。此外,不同誘導(dǎo)物誘導(dǎo)的同種培養(yǎng)基中,發(fā)酵液蛋白質(zhì)濃度亦有所不同。以蠅蛆三期幼蟲和草原革蜱為誘導(dǎo)物的發(fā)酵液,蛋白質(zhì)含量高于氨基酸誘導(dǎo)組,且均超過對照組。

表1 棕色綠僵菌發(fā)酵液中蛋白質(zhì)含量和蛋白酶活性測定結(jié)果

2.3 棕色綠僵菌發(fā)酵液中蛋白酶活性的測定

由表1可知,枸櫞酸培養(yǎng)基組蛋白酶活性高于SDY培養(yǎng)基組,其中蠅蛆三期幼蟲誘導(dǎo)的枸櫞酸培養(yǎng)基組蛋白酶活性最高,SDY培養(yǎng)基對照組蛋白酶活性最低。

2.4 棕色綠僵菌發(fā)酵液中磷酸酶活性的測定

據(jù)表2所示,使用枸櫞酸培養(yǎng)基進行誘導(dǎo),磷酸酶活性普遍高于PD培養(yǎng)基組和SDY培養(yǎng)基組。在3個組不同的培養(yǎng)基中,加入誘導(dǎo)物的培養(yǎng)組磷酸酶活性均高于對照組。不同誘導(dǎo)物的添加對磷酸酶活性有明顯的影響。其中,加入蠅蛆三齡幼蟲的培養(yǎng)基組磷酸酶活性最高,顯著高于其他組;而加入草原革蜱的培養(yǎng)基組次之(但SDY培養(yǎng)基組的堿性磷酸酶活性除外),對照組培養(yǎng)基磷酸酶活性最低?？傮w來看,以寄生蟲體為誘導(dǎo)物的培養(yǎng)基的磷酸酶活性高于以氨基酸為誘導(dǎo)物的培養(yǎng)基。

表2 棕色綠僵菌發(fā)酵液中磷酸酶活性測定結(jié)果

2.5 棕色綠僵菌發(fā)酵液殺蠅蛆毒性試驗

由表3可知,棕色綠僵菌發(fā)酵液含有對蠅蛆三期幼蟲有殺滅作用的成分。不同的培養(yǎng)基和誘導(dǎo)物對棕色綠僵菌發(fā)酵液的殺蟲效果有所不同。加入誘導(dǎo)物后,發(fā)酵液殺蟲效果顯著。其中,以寄生性蟲體作為誘導(dǎo)物的發(fā)酵液效果更佳,優(yōu)于氨基酸組。

表3 棕色綠僵菌發(fā)酵液殺蠅蛆毒性試驗結(jié)果

3 討論

近期研究表明,棕色綠僵菌的發(fā)酵液受培養(yǎng)基和誘導(dǎo)物的影響較大。這些因素對胞外蛋白質(zhì)種類、含量、以及蛋白酶和磷酸酶的活性都會產(chǎn)生顯著影響。在不同的組培養(yǎng)基中,枸椽酸培養(yǎng)基組的胞外蛋白質(zhì)含量最高,遠高于PD培養(yǎng)基組和SDY培養(yǎng)基組。針對同一種培養(yǎng)基不同種類的誘導(dǎo)物,以蠅蛆三期幼蟲為誘導(dǎo)物的培養(yǎng)基組所產(chǎn)生的胞外蛋白質(zhì)含量高于以氨基酸為誘導(dǎo)物的培養(yǎng)基組。同時,將寄生性蟲體蠅蛆三期幼蟲和草原革蜱誘導(dǎo)物加入培養(yǎng)基組,相較于不加入寄生性物質(zhì)的氨基酸誘導(dǎo)物,胞外蛋白質(zhì)含量更高。蠅蛆三期幼蟲誘導(dǎo)的枸椽酸培養(yǎng)基組所產(chǎn)生的蛋白質(zhì)含量最高,說明不同的培養(yǎng)基和誘導(dǎo)物種類在真菌代謝過程中起到了決定性作用。SDS-PAGE凝膠電泳圖明顯展示在含寄生性蟲體培養(yǎng)基中,產(chǎn)生的蛋白質(zhì)條帶更為明顯,表明寄生性蟲體更能夠有效誘導(dǎo)棕色綠僵菌蛋白質(zhì)的產(chǎn)生。實驗表明,棕色綠僵菌在枸櫞酸培養(yǎng)基中酸性磷酸酶活性較高,堿性磷酸酶活性則是PD培養(yǎng)基中較高。與對照組相比,添加誘導(dǎo)物培養(yǎng)基磷酸酶活性明顯增加?？梢?不同的營養(yǎng)成分和誘導(dǎo)物可以改變棕色綠僵菌的代謝過程。

據(jù)發(fā)現(xiàn),棕色綠僵菌發(fā)酵液對蠅蛆具有一定的殺滅作用。研究表明,在真菌的侵染增殖過程中,會在液體培養(yǎng)基中會釋放出具有殺蟲毒性的活性成分,例如綠僵菌毒素,是綠僵菌分泌的一種次生代謝產(chǎn)物,與綠僵菌侵染昆蟲并導(dǎo)致其死亡有緊密相連的關(guān)系。FERRON P.[14]認為,昆蟲感染真菌后,其病原菌毒素可能引起某些致病效應(yīng),從而加速昆蟲的死亡過程,這可能是昆蟲真菌感染后死亡的真正原因之一。據(jù)研究報道,真菌代謝受誘導(dǎo)劑影響顯著,同時培養(yǎng)基中誘導(dǎo)物劑量越高,真菌代謝物產(chǎn)量越高[15]。

蠅蛆三期幼蟲的致死率受到不同培養(yǎng)基的影響,即使使用相同種類的培養(yǎng)基,不同的誘導(dǎo)物也會導(dǎo)致其相應(yīng)的致死率不同,毒殺作用也會因此存在較大差異。試驗結(jié)果確認了此結(jié)論。在棕色綠僵菌3種發(fā)酵液中,蠅蛆三期幼蟲以枸櫞酸培養(yǎng)基為誘導(dǎo)劑時,毒性最強,蛋白質(zhì)含量和蛋白酶活性最高。相反,PD培養(yǎng)基對照組殺蠅蛆活性較低,但蛋白質(zhì)含量和蛋白酶活性均高于蠅蛆三期幼蟲、草原革蜱和氨基酸誘導(dǎo)的SDY培養(yǎng)基組。分析發(fā)現(xiàn),棕色綠僵菌代謝過程會受到培養(yǎng)基成分影響,導(dǎo)致代謝產(chǎn)物的分泌發(fā)生變化。因此,在研究真菌及其代謝產(chǎn)物時,需要充分考慮培養(yǎng)基組成及誘導(dǎo)物種類,因其對真菌的代謝過程起關(guān)鍵作用。

綜上所述,不同培養(yǎng)基和誘導(dǎo)物確實會顯著影響棕色綠僵菌的代謝過程,導(dǎo)致其胞外蛋白質(zhì)種類和含量、蛋白酶和磷酸酶活性及殺蠅蛆毒性產(chǎn)生差異。本研究確定了棕色綠僵菌胞外蛋白質(zhì)的最佳培養(yǎng)基為枸櫞酸液體培養(yǎng)基,同時發(fā)現(xiàn)對蠅蛆三期幼蟲的誘導(dǎo)作用最好,這些結(jié)果為今后有關(guān)該菌胞外蛋白質(zhì)的研究提供了重要參考資料。