張 曼,彭麗娜,王朝霞

(上海交通大學實驗動物中心,上海 200240)

分娩是一個復雜的生理過程,需要母體的準備和胎兒的成熟。分娩的發(fā)動是多種激素共同參與的過程,如雌激素(oestrogen)、催產(chǎn)素(oxytocin)、糖皮質(zhì)激素(glucocorticoid)和促腎上腺皮質(zhì)激素釋放激素(corticotropin-releasing hormone,CRH)等[1]。有研究表明,人類孕期胎盤分泌的CRH進入母體外周血中,隨著妊娠周齡的增加,胎盤產(chǎn)生的CRH量逐漸增多,引起母體外周血中CRH升高,在妊娠晚期血漿CRH含量呈直線增加,分娩時達到峰值[2-3],分娩后急劇下降,24 h內(nèi)血漿CRH濃度基本恢復至正常水平。隨著胎盤促腎上腺皮質(zhì)激素釋放激素(CRH)在妊娠分娩發(fā)動中的作用引起越來越多臨床和基礎(chǔ)研究工作者的興趣,有人認為存在一個“CRH胎盤時鐘”,它決定了妊娠期的長短以及分娩和分娩的時間。CRH拮抗劑的潛在用途目前正在深入研究中。CRH-r1拮抗劑已被用于動物研究,以闡明CRH在囊胚著床和侵襲、早期胎兒免疫耐受和早產(chǎn)中的作用[4-5]。

母體血漿中CRH與分娩發(fā)動的關(guān)系在非人靈長類動物實驗中也得到證實,黑猩猩胎盤和母體血液中CRH水平在整個妊娠期間的變化和人類相似[6],而狒狒胎盤中CRH在妊娠12周就達到高峰[7]。唐美儀等研究發(fā)現(xiàn)雌性大鼠動情期下丘腦CRH水平顯著升高達(362.08±29.26)pg/mL,間情期為(176.99±17.19)pg/mL[8]。還有研究證實山羊在分娩前后數(shù)天母體血漿CRH顯著升高,在分娩前的72 h由約4 μg/L上升到分娩時最高達24 μg/L[9]。

隨著生命醫(yī)藥學科及實驗動物科學的發(fā)展,實驗小鼠作為生物醫(yī)學研究中用量最大的哺乳類實驗動物之一,其質(zhì)量優(yōu)劣直接影響試驗結(jié)果的準確性和可重復性。如何提高實驗動物的微生物等級,是許多研究者探索的課題。目前,通過生物凈化提高被病原微生物污染的實驗小鼠的微生物級別越來越受到人們的關(guān)注。剖宮產(chǎn)凈化是利用胎盤能夠阻斷病原微生物入侵胎兒的天然屏障作用,通過手術(shù)的方法阻斷母鼠攜帶的病原微生物傳染給后代,以提高仔鼠的微生物級別[10]。該方法在悉生動物的培育和維持中發(fā)揮著重要作用,是基因工程小鼠生物凈化維持種群微生物級別最為簡單、有效的方法。實驗小鼠妊娠期為18.5～20 d,對于需要剖宮產(chǎn)手術(shù)的小鼠,其分娩期的判斷至關(guān)重要。

基于人類與其他動物妊娠期血漿中CRH在分娩中的研究,本試驗以C57BL/6小鼠為研究對象,通過對不同孕鼠妊娠期間血漿中CRH的測定,探討小鼠血漿中CRH水平與分娩時間的關(guān)系,利用CRH在妊娠期的變化規(guī)律,達到準確預測小鼠分娩時間的目的,為剖宮產(chǎn)手術(shù)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 本研究中所用的實驗動物均飼養(yǎng)于上海交通大學實驗動物中心SPF屏障設施內(nèi)(溫度20～26℃,相對濕度40%～70%,明暗交替12 h/12 h),實驗動物使用許可證:SCXK(京)2018-0028。用于合籠的C57BL/6小鼠,雌鼠90只,6～8周齡;雄鼠45只,8～12周齡,SPF級,購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司,實驗動物生產(chǎn)許可證號:SCXK(京)2016-0006。本實驗已經(jīng)通過上海交通大學福利倫理審查委員會審查,倫理編號為A2020012。

1.1.2 主要試劑 小鼠促腎上腺皮質(zhì)激素釋放激素(CRH)試劑盒(ELISA),泉州市睿信生物科技有限公司產(chǎn)品;試劑盒組成及配制HRP-檢測抗體:底物A、B;CRH標準品溶液6支:其濃度依次為2.5、5、10、20、40、80 pg/mL;20×洗滌緩沖液,去離子水1∶20稀釋備用;試劑盒靈敏度:最低檢測值<0.1 pg/mL;重復性:板內(nèi)變異系數(shù)<10%,板件變異系數(shù)<15%。

1.1.3 主要儀器 酶標儀(ELX800),美國伯騰儀器有限公司產(chǎn)品;37℃恒溫箱(DK-8A),上海精宏實驗設備有限公司產(chǎn)品;低溫離心機(Centrifuge 5424),德國艾本德股份公司產(chǎn)品;旋渦混合儀(VORTEX2),美國SI儀器公司產(chǎn)品;超低溫冰箱(Scientific 51025411),賽默飛世爾科技公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 實驗小鼠合籠及檢栓 性成熟的小鼠在第1天PM6:00合籠(1♂∶2♀),第2天AM9:30之前完成檢栓。見栓小鼠共有72只,隨機分為6組,每組12只見栓小鼠,組別標號為1至6,見栓當天孕期標記為0.5 dpc。

1.2.2 樣本采集及處理 自見栓當天起至小鼠分娩后24 h結(jié)束,每天上午10點,通過面頰采血的方法對見栓小鼠采集血樣。根據(jù)試驗分組,每天采集1組,每次收集的全血樣本放置在室溫下靜置2 h后,置于低溫離心機中,1 000 r/min離心20 min,取上清保存于-80 ℃冰箱備用。

因陰道檢栓法存在假陽性現(xiàn)象,在實驗樣本收集過程中共有16只假陽性小鼠,在數(shù)據(jù)分析時將其從實驗組剔除。至見栓小鼠分娩結(jié)束,除16只假陽性小鼠外,正常分娩的小鼠(順產(chǎn)組)為36只,12只小鼠發(fā)生流產(chǎn)或早產(chǎn)(早產(chǎn)組),8只小鼠的妊娠期超過了20 d(難產(chǎn)組)。

1.2.3 繪制CRH標準曲線 CRH標準品購自睿信生物科技有限公司,測定不同濃度的標準品的OD值,并繪制CRH標準曲線。

表1 不同濃度的CRH標準品OD值

1.2.4 血漿CRH的測定 采用雙抗體一步夾心法酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)。反應體積為100 μL,450 nm波長下測定樣品的吸光度(OD值),計算各樣本濃度。具體操作如下:從4℃冰箱中將試驗所需的板條取出,放置在室溫下平衡20 min。在板條上標記好標準品孔和樣本孔,根據(jù)濃度由低到高,依次加入50 μL標準品至標準品孔中。向樣本孔中加入50 μL待測樣本。設置空白孔作為陰性對照。除陰性對照外,標準品孔和樣本孔中分別加入100μL辣根過氧化物酶(HRP)標記的檢測抗體,并用封板膜封住反應孔,放置于37℃恒溫箱中孵育60 min。孵育結(jié)束后棄去液體,用吸水紙吸去剩余的液體,然后每孔加入350 μl洗滌液,靜止1 min,棄去洗滌液,并在吸水紙上拍干。重復上述操作5次。每孔加入底物A和底物B各50 μL,放置于37℃恒溫箱中避光孵育15 min。每孔中加入50 μL終止液,室溫下放置15 min,在450 nm波長處測定各孔的OD值。

2 結(jié)果

2.1 CRH標準曲線

CRH標準曲線見圖1。

2.2 正常分娩組孕鼠不同妊娠時間血漿中CRH水平含量

正常分娩組孕鼠血漿中的CRH水平在妊娠早期即升高,妊娠13.5 d起血漿CRH水平呈進行性升高,妊娠晚期升高顯著,至分娩時達最高水平,分娩后24 h CRH值基本恢復至正常值,結(jié)果如圖2所示。

圖2 不同妊娠期小鼠CRH水平

2.3 早產(chǎn)組和難產(chǎn)組孕鼠不同時期血漿中CRH含量的變化

從13.5 d起,早產(chǎn)組血漿CRH水平即持續(xù)高于正常分娩組,兩者差異顯著(P<0.05),分娩時無明顯差異;從13.5 d起,難產(chǎn)組CRH水平低于正常分娩組(P<0.05),分娩時無明顯差異,詳細結(jié)果見表2。

表2 早產(chǎn)組和難產(chǎn)組孕鼠不同時期血漿CRH水平的變化

2.4 妊娠中期(13.5dpc)孕鼠血漿中CRH水平與妊娠持續(xù)時間的關(guān)系

懷孕13.5 d時小鼠血漿CRH水平與妊娠持續(xù)時間呈負性相關(guān),相關(guān)系數(shù)R2=-0.9119(P<0.001)。懷孕13.5 d的小鼠,血漿中CRH水平異常升高時,則后續(xù)妊娠持續(xù)時間短;而血清CRH水平偏低時,后續(xù)妊娠持續(xù)時間長,結(jié)果見圖3。

圖3 孕鼠13.5 d時血漿CRH水平與妊娠時間的關(guān)系

3 討論

促腎上腺皮質(zhì)激素釋放激素(CRH)是一種參與應激反應的肽類激素,含有41個氨基酸殘基,屬于促皮質(zhì)素釋放因子家族,最初從綿羊下丘腦分離得到,主要功能是刺激垂體合成ACTH,作為下丘腦-垂體-腎上腺(HPA)軸的一部分。在豬的黃體中期,CRH降低了孕激素,而不是雌激素或PGF2α[11],在大鼠的雌性生殖組織中發(fā)現(xiàn)CRH可能通過受體介導的機制抑制胚胞著床[12],在小鼠中也有類似的發(fā)現(xiàn)[13]。在人來和非人靈長類動物的研究中發(fā)現(xiàn),妊娠期胎盤和胎膜產(chǎn)生大量CRH[14],CRH在這些組織中的合成隨著妊娠的進展而增加,到足月時,CRH在母體和胎兒的血液以及羊水中以高濃度存在[15]。足月妊娠時,胎盤CRH通過刺激蛻膜和胎膜分泌前列腺素來促進子宮肌層收縮,并增強催產(chǎn)素和前列腺素對子宮肌層的收縮作用[16]。

通過對正常分娩和早產(chǎn)孕婦血漿中CRH的研究發(fā)現(xiàn),早產(chǎn)孕婦CRH血漿水平明顯高于足月分娩的孕婦,而足月延后分娩的孕婦CRH血漿水平明顯低于足月分娩孕婦[14]。在非靈長類哺乳動物中,妊娠結(jié)束與母體孕酮濃度下降有關(guān),這有助于分娩的開始。在人胎盤中,皮質(zhì)醇能夠與黃體酮競爭CRH調(diào)節(jié)作用[17]。因此,皮質(zhì)醇對孕酮的阻斷可能是分娩啟動的一個機制。

在大鼠研究中發(fā)現(xiàn)CRH-R1可誘導皮膚肥大細胞發(fā)生脫顆粒作用[18],進而引發(fā)血管舒張,使血管的通透性增大,而肥大細胞膜穩(wěn)定劑則可抑制這一作用的發(fā)生;采用利多卡因局部浸潤麻醉的方法并沒有改善CRH-R1增大血管滲透性的作用。而在缺乏肥大細胞的大鼠皮膚中, CRH-R1沒有引發(fā)血管舒張作用。由此我們推測,胎膜中的CRH-R1與CRH結(jié)合后,介導了肥大細胞脫顆粒作用,激活了相關(guān)的炎癥因子,從而增大血管的通透性,引發(fā)胎膜發(fā)生一系列的反應,最終發(fā)動分娩。

小鼠的妊娠周期相比其他哺乳動物而言較短,一般為19 d±0.5 d。在剖宮產(chǎn)手術(shù)凈化中,準確判定小鼠的分娩時間至關(guān)重要,而陰道栓推斷方法需要實驗人員每天進出飼養(yǎng)室兩次檢查陰栓,不僅增加了實驗人員的工作量,耗費時間,而且存在漏檢和假陽性的現(xiàn)象。觸診法對實驗人員要求較高,需具有準確而熟練的觸診技術(shù),否則觸診摸胎將會引發(fā)孕鼠應激反應,出現(xiàn)早產(chǎn)或難產(chǎn)。另外,摸胎判斷也會因人而異,不能完全準確判斷手術(shù)時間,進而影響手術(shù)的成功率。

本試驗以C57BL/6小鼠為研究對象,從見栓當天起對孕鼠血漿中CRH含量進行連續(xù)測定,至分娩后24 h結(jié)束,分析不同妊娠時間小鼠血漿CRH水平的變化和與血漿CRH與妊娠持續(xù)時間的關(guān)系。結(jié)果顯示正常懷孕的小鼠自妊娠13.5 d起血漿中CRH水平呈進行性升高,至分娩時達到最高值,而分娩結(jié)束后很快降至正常水平。出現(xiàn)早產(chǎn)的小鼠,在妊娠期CRH水平變化趨勢與正常分娩小鼠相似,但在相同妊娠時間的CHR水平高于正常分娩組;超過20 d之后生產(chǎn)的小鼠,雖然分娩時CRH水平與正常分娩組相似,但在相同妊娠時間CHR水平卻低于正常分娩組。結(jié)果表明血漿中CRH水平是隨著妊娠時間的增加而逐漸升高的,當血漿中CRH水平升高達到一定水平時則發(fā)動分娩。

綜上所述,通過檢測孕鼠妊娠期血漿中CRH水平,對比CRH在妊娠期的變化規(guī)律,能夠準確判斷孕鼠的妊娠時間,進而可以知道孕鼠的分娩時間,大大提高剖宮產(chǎn)手術(shù)的成功率,為基因工程小鼠的剖宮產(chǎn)生物凈化,悉生動物的培養(yǎng)和無菌小鼠的生產(chǎn)奠定了基礎(chǔ)。