吳 嫻,畢海洋,張燕茹,李向臣,何玉龍,舒建洪*,武永淑*

(1.浙江理工大學生命科學與醫(yī)藥學院,浙江杭州 310018;2.浙江理工大學紹興生物醫(yī)藥研究院,浙江紹興 312366;3.浙江農(nóng)林大學動物科技學院 動物醫(yī)學院,浙江省畜禽綠色生態(tài)健康養(yǎng)殖應用技術(shù)研究重點實驗室,動物健康互聯(lián)網(wǎng)檢測技術(shù)浙江省工程實驗室,動物醫(yī)學與健康管理浙江省國際科技合作基地,中澳動物健康大數(shù)據(jù)分析聯(lián)合實驗室,浙江杭州 311300)

雞傳染性鼻炎(infectious coryza,IC)是雞的一種細菌性急性上呼吸道傳染病,其病原為副雞禽桿菌(Avibacteriumparagallinarum,Apg)。該病主要在育成雞和蛋雞群中出現(xiàn),導致蛋雞繁殖停滯、淘汰率顯著上升,產(chǎn)蛋量明顯減少,發(fā)病高峰期產(chǎn)蛋可下降70%,發(fā)病雞所產(chǎn)蛋品質(zhì)下降,不能留作種用;育成雞生長不良,采食量下降10%～50%,該病不易根治且易復發(fā),給家禽養(yǎng)殖戶造成嚴重的經(jīng)濟損失[1]。該病臨床癥狀主要表現(xiàn)為鼻腔分泌黏液性液體、面部水腫、結(jié)膜炎以及淚液分泌增多。該病潛伏期短,發(fā)病迅速。發(fā)病率高,病死率雖較低,但可能與其他病原混合感染而升高。

雞傳染性鼻炎于1920年被Beach首次報道,1932年De Blieck首次分離到該細菌并為其命名為副雞嗜血桿菌,2005年Blaclall重新將該菌命名為副雞禽桿菌[2]。Page依據(jù)抗原結(jié)構(gòu)首次將副雞禽桿菌分為A、B和C共3個血清型[1]。

1986年我國首次報道該病,自1987年后,許多養(yǎng)雞場都有該病發(fā)生,發(fā)病率逐年增加,目前在全國各地都有流行[3]。李秀娟等[3]研究表明,從2014-2019年,雞傳染性鼻炎的陽性檢出率由3.8%增長到13.1%,呈逐年遞增趨勢。該病一年四季均發(fā),冬春季多發(fā)。初產(chǎn)雞及產(chǎn)蛋高峰期發(fā)病最多,其次是青年雞。研究發(fā)現(xiàn)分離株對高達16種藥物有不同程度的耐藥性。另外,與大腸埃希氏菌、H9亞型禽流感病毒等混合感染的比重增加,占62%[4]。馬國明等對2017-2019年我國部分規(guī)模養(yǎng)殖雞場的感染現(xiàn)狀分析,結(jié)果表明3年期間副雞禽桿菌的陽性檢出率分別為38.1%、45.7%和36.4%,其中A型菌株占47.1%,B型菌株占11.8%,C型菌株占41.2%,說明3種血清型副雞禽桿菌在我國廣泛流行,感染情況復雜,增加了防控難度[5]。印度尼西亞日惹市副雞禽桿菌陽性檢出率達80%[6],說明雞傳染鼻炎的流行在全世界都很嚴重。

我國養(yǎng)雞業(yè)發(fā)展迅速,集約化養(yǎng)殖程度快速攀升,雞場飼養(yǎng)密度大,面臨細菌性疾病感染的壓力加重。尤其是近年減抗政策的推行、食品藥殘監(jiān)管和處罰力度增大,導致雞傳染性鼻炎的發(fā)病率升高,給規(guī)?；B(yǎng)雞場的防控帶來巨大挑戰(zhàn)[7]。近年來,雞傳染性鼻炎發(fā)生率顯著增加,其中免疫雞群也有發(fā)生,這可能與現(xiàn)用疫苗菌株和大多數(shù)流行株血清型不匹配有關(guān),雞傳染性鼻炎已成為困擾養(yǎng)雞業(yè)發(fā)展的重要疫病[8]。因此,了解和研制針對目前國內(nèi)流行株疫苗對防控雞傳染性鼻炎顯得尤為重要。

本研究通過對2016年5月至2017年2月分別從浙江杭州、浙江金華、安徽宣城、安徽黃山、浙江舟山、杭州蕭山、江蘇常州和浙江寧波等8個養(yǎng)殖場分離到疑似雞傳染性鼻炎病雞的眶下竇樣品122份進行病原菌分離,對其中10個分離株進一步進行形態(tài)學、衛(wèi)星現(xiàn)象試驗、PCR鑒定和血清平板凝集試驗,對分離株進行人工感染SPF雞的動物回歸試驗,通過臨床表現(xiàn)和組織病理學觀察進一步探究分離株的毒力和致病性。通過以上試驗,了解江浙皖地區(qū)雞傳染性鼻炎的流行情況和病菌致病力,為雞傳染性鼻炎三價疫苗研發(fā)和防控提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病料 病雞樣品采集于2016年5月至2017年2月,分別從浙江杭州、浙江金華、安徽宣城、安徽黃山、浙江舟山、杭州蕭山、江蘇常州和浙江寧波等8個養(yǎng)雞場發(fā)現(xiàn)的疑似雞傳染性鼻炎發(fā)病雞采集病料122份。

1.1.2 實驗動物 12～14周齡SPF雞,購自北京梅里亞維通實驗動物技術(shù)有限公司;SPF兔(成年),購自青島康大生物科技有限公司。

1.1.3 標準菌株和陽性血清 標準副雞禽桿菌血清A型菌株CVCC3007、B型菌株CVCC3006和C型菌株CVCC3008,購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所;陽性血清,由以上菌株免疫兔獲得高免兔血清。

1.1.4 主要試劑 TSA培養(yǎng)基(TB650),雞血清(S9080),氧化型輔酶Ⅰ(NAD)(N8110),50×TAE緩沖液,北京索萊寶科技有限公司產(chǎn)品;TSB培養(yǎng)基(HB4114),葡萄糖瓊脂(HB0135-2),乳糖發(fā)酵培養(yǎng)基(HB8420),蔗糖微量生化鑒定管(GB171),硝酸鹽培養(yǎng)基(HB8460),硝酸鹽還原試劑盒(HB8282),尿素酶瓊脂基礎(HB4095),快速硫化氫試驗瓊脂(HB0246),蛋白胨水(色氨酸肉湯)(GS001),青島海博生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品;革蘭氏染色液,湖南比克曼生物科技有限公司產(chǎn)品;2×TaqPCR Master Mix,北京康為世紀生物科技有限公司產(chǎn)品;DL 2 000 DNA Maker,寶日醫(yī)生物技術(shù)(北京)有限公司產(chǎn)品。

1.1.5 主要儀器 垂直層流潔凈工作臺(HCB-1300VS),青島海爾特種電器有限公司產(chǎn)品;PCR儀(K960),杭州晶格科學儀器有限公司產(chǎn)品;生物顯微鏡(ECLIPSE E100),尼康儀器(上海)有限公司產(chǎn)品;恒溫振蕩器(HZ-9211K),太倉市科教儀器廠產(chǎn)品;二氧化碳培養(yǎng)箱(BC-J160),上海博迅醫(yī)療生物儀器股份有限公司產(chǎn)品;DNA凝膠成像系統(tǒng)(Tanon 2500),天能科技(上海)有限公司產(chǎn)品;臺式高速離心機(Neofuge 1600R),力康發(fā)展有限公司產(chǎn)品;數(shù)顯恒溫水浴鍋(HH-3),國華電器有限公司產(chǎn)品;電子天平(BSA124S),賽多利斯科學儀器(北京)有限公司產(chǎn)品;電泳儀(DYY-8C),北京六一生物科技有限公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 樣品細菌分離 2016年5月至2017年2月在8個養(yǎng)殖場共采集122 份疑似樣品,參考《雞傳染性鼻炎診斷技術(shù)》(NY/T538-2015)[9],合成副雞禽桿菌鑒定引物序列F:5′-TGAGGGTAGTCTTGCACGCGAAT-3′;R:5′-CAAGGTATCGATCGT- CTCTCTACT-3′,擴增片段大小為464 bp。取分離菌株的純培養(yǎng)物加入TSB肉湯(含100 mL/L雞血清和0.1 mg/mL NAD),置于搖床200 r/min培養(yǎng)10 h后,所有分離株各取菌液1 mL于12 000 r/min離心10 min后取沉淀;分別向樣品沉淀中加入滅菌TE緩沖液400 μL,吹打混勻,置于水浴鍋100℃煮沸10 min后,冰浴10 min,再次12 000 r/min離心10 min取上清液,上清液即為樣品DNA模板。PCR擴增反應體系為:2×TapPCR Master Mix酶15 μL,cDNA模板2 μL,上、下游引物各1 μL,滅菌雙蒸水11 μL。PCR反應條件:95℃ 6 min;95℃ 30 s,55℃ 30 s,72℃ 90 s,共32個循環(huán);72℃終延伸7 min。反應結(jié)束取擴增產(chǎn)物10 μL加入1%瓊脂糖凝膠孔中,130 V恒壓電泳20 min后,置于紫外成像儀觀察。

1.2.2 病原分離與形態(tài)學觀察 從PCR檢測的Apg陽性樣品隨機抽取10個樣品進行形態(tài)學鑒定。在無菌條件下,將病死雞取頭部并對眶下竇外表面進行消毒處理,使用滅菌手術(shù)剪打開眶下竇后直接滅菌棉拭子擦拭采集其內(nèi)分泌物,接種于TSA(含100 mL/L雞血清和0.1 mg/mL NAD)瓊脂平板,將平板倒置于含5% CO2培養(yǎng)箱,37℃培養(yǎng)18～36 h,觀察菌落形態(tài)。挑取可疑單菌落劃線接種于含雞血清和NAD的TSA瓊脂平板,置于含5% CO2培養(yǎng)箱,37℃培養(yǎng)18～36 h后觀察菌落形態(tài)并進行革蘭氏染色鏡檢。

1.2.3 PCR鑒定 參考《雞傳染性鼻炎診斷技術(shù)》(NY/T538-2015)[9],對挑取的10株分離菌株樣品再次進行PCR檢測鑒定。

1.2.4 衛(wèi)星試驗 挑取TSA瓊脂平板培養(yǎng)的可疑單菌落至TSB肉湯(含100 mL/L雞血清和0.1 mg/mL NAD),于搖床200 r/min培養(yǎng)8～12 h。取適量菌液滴加于不含NAD的瓊脂平板,取金黃色葡萄球菌純培養(yǎng)物垂直交叉劃線于平板,倒置于含5% CO2培養(yǎng)箱,37℃培養(yǎng)24～36 h后,觀察菌落生長情況。

1.2.5 生化及培養(yǎng)特性鑒定 參考已發(fā)表文獻[9-10],分別對10株Apg陽性單菌落進行生化鑒定,包括糖類發(fā)酵試驗(葡萄糖、乳糖和蔗糖)、硝酸鹽還原試驗、靛基質(zhì)試驗、過氧化氫酶鑒定試驗、尿素酶試驗和硫化氫試驗。將10株菌樣分別加入含100 mL/L雞血清和0.1 mg/mL NAD的試管培養(yǎng)基中進行培養(yǎng),其中蔗糖發(fā)酵試驗和靛基質(zhì)試驗在添加0.1 mg/mL NAD的生化鑒定管中進行,置于含5% CO2培養(yǎng)箱,37℃培養(yǎng)24～36 h后觀察現(xiàn)象。接種環(huán)挑取菌樣涂抹于載玻片后滴加3%過氧化氫溶液,觀察是否產(chǎn)生氣泡以鑒定該菌是否具有過氧化氫酶。

1.2.6 血清型鑒定 依據(jù)國家行業(yè)標準[9]制備血凝抑制試驗所需抗原,并且通過雞醛化紅細胞對所制備抗原進行血凝效價(HA效價)測定。使用PBS配制抗原工作液為4 HA單位,并對副雞禽桿菌A型、B型和C型陽性血清稀釋不同倍數(shù)(200倍、400倍和800倍),進行血凝抑制試驗。觀察陽性血清能否抑制待檢菌株抗原凝集紅細胞的現(xiàn)象。

1.2.7 分離菌株的動物回歸試驗 對10株分離株進行動物回歸試驗,分別劃線接種于TSA(含100 mL/L雞血清和0.1 mg/mL NAD)平板,在5% CO2培養(yǎng)箱,37℃培養(yǎng)24～48 h,分別挑取3～5個典型菌落接種于含雞血清和NAD的TSB培養(yǎng)基,于37℃搖床180 r/min培養(yǎng)10～12 h收獲菌液,并進行活菌計數(shù)。選擇55只12～14周齡SPF雞進行動物回歸試驗,隨機分為11組,每組5只,1～10組為試驗組,分別對10個分離株進行攻毒試驗,11組為對照組。試驗組A、B和C 3個血清型的攻毒劑量分別為2×104CFU/0.2 mL、1×104CFU/0.2 mL和1×104CFU/0.2 mL,每只雞接種0.2 mL菌液于眶下竇,對照組接種0.2 mL無菌PBS。將接種完成的雞只于負壓區(qū)隔離器中進行飼養(yǎng)并連續(xù)觀察7 d,對出現(xiàn)典型臨床癥狀的雞只進行解剖和病理觀察。同時,在無菌條件下,采集攻毒7 d和14 d試驗雞只的眶下竇、氣管、肺、心、肝、脾和腎等組織,進行病理組織學觀察。

2 結(jié)果

2.1 樣品細菌分離結(jié)果

對2016年5月至2017年2月8個養(yǎng)殖場的122份疑似樣品進行PCR 擴增,Apg陽性數(shù)為48個,陽性率為39.3%,8個養(yǎng)殖場的陽性率為36.8%～50%,具體見表1。

表1 8個養(yǎng)殖場副雞禽桿菌PCR檢測結(jié)果

2.2 細菌分離

采集的病雞樣品劃線培養(yǎng)后,有形態(tài)大小各異的單菌落長出。對10株分離株進行純培養(yǎng)后在TSA瓊脂平板上初期呈現(xiàn)形態(tài)為針尖樣大小、灰白色、圓形露珠樣菌落。革蘭氏染色鏡檢結(jié)果表明分離菌株為革蘭氏陰性菌,其形態(tài)為短小桿狀或球狀。

2.3 細菌PCR鑒定結(jié)果

使用特異性引物對10株分離株樣品的DNA進行擴增,對PCR產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳,結(jié)果如圖1,擴增片段大小為464 bp,符合預期結(jié)果。

M.DNA標準;1.陰性對照;2.陽性對照;3～12.ZJ09,ZZ01,ZN07,HX05,ZH02,JC03,AX07,AX10,AH10,ZN02

2.4 衛(wèi)星試驗

將純化培養(yǎng)的10株分離菌株分別涂布于不含NAD的瓊脂平板上與金黃色葡萄球菌交叉劃線處理培養(yǎng)后,均出現(xiàn)明顯“衛(wèi)星現(xiàn)象”,其中3個菌株的結(jié)果見圖2。副雞禽桿菌均在金黃色葡萄球菌周圍生長,且隨著距葡萄球菌距離越遠,副雞禽桿菌菌落越小。

a.ZZ01株;B.HX05株;C.ZN02株A.ZZ01 strain; B.HX05 strain; C.ZN02 strain

2.5 生化及培養(yǎng)特性鑒定結(jié)果

對10株分離菌株進行生化及培養(yǎng)特性鑒定,結(jié)果顯示10株分離菌株均能分解蔗糖和葡萄糖,不分解乳糖,硝酸鹽還原試驗陽性,過氧化氫酶試驗、靛基質(zhì)試驗、尿素酶試驗和硫化氫試驗均為陰性。

2.6 血清型鑒定結(jié)果

10株分離株的血清型鑒定結(jié)果見表2。最終獲得副雞禽桿菌A型菌株3株,B型菌株4株,C型菌株3株,A型、B型和C型3個菌株的陽性率分別為30%、40%和30%。

表2 10株分離株血清型鑒定結(jié)果

2.7 動物回歸試驗

A、B和C3個血清型毒株在攻毒后24 h,雞只面部明顯腫脹且精神沉郁;有的雞只出現(xiàn)眼睛閉合、頭下垂和縮脖子等嗜睡現(xiàn)象;糞便呈淡黃色或白色水樣。攻毒后48 h,面部腫脹加重,甚至無法睜眼,鼻竇內(nèi)有黃褐色干酪樣滲出物。攻毒后72 h,面部腫脹減弱,鼻竇內(nèi)滲出物增多。攻毒后96 h,鼻腔和口腔有大量深褐色干酪樣滲出物,有的雞只出現(xiàn)頻繁的張口呼吸和呻吟等現(xiàn)象。攻毒后120 h,A血清型(ZZ01毒株)攻毒組1只雞死亡,其余雞只癥狀無明顯加重。攻毒組雞只的采食量和飲水量明顯下降,攻毒144 h后癥狀再無加重現(xiàn)象,有的雞只慢慢恢復正常。A、B和C 3個血清型的發(fā)病率為60%～100%,A血清型(ZZ01株)死亡率為20%,B和C血清型死亡率為0。另外,A血清型(ZZ01株)、B血清型(HX05株)和C血清型(ZN02株)表現(xiàn)出更強的毒力,結(jié)果見表3。

表3 10株分離株攻毒試驗結(jié)果

對攻毒后7 d雞只進行剖檢和病理組織學觀察,病變主要表現(xiàn)在上呼吸道,有干酪樣壞死物滲出阻塞在鼻腔、氣管及咽部等,并散發(fā)出具有濃烈的惡臭氣味。部分病死雞肺臟變白、變大;攻毒后14 d,鼻腔癥狀減輕,有少量褐色黏液,水腫和出血基本消失,肺臟變白現(xiàn)象明顯緩解。

進一步對采集的樣品進行病理組織切片觀察。ZN01株結(jié)果表明,與對照組相比,攻毒后7 d,眶下竇以炎癥反應為主,有大量異嗜性粒細胞浸潤和聚集(圖3A2);肺臟出現(xiàn)少量炎性細胞浸潤,肺泡融合變大,界限不清晰(圖3B2);氣管黏膜上皮細胞壞死、脫落,有纖維素性物質(zhì)滲出(圖3C2)。攻毒后14 d,眶下竇內(nèi)的異嗜性粒細胞裂解,數(shù)量減少并形成壞死灶,逐漸被上皮樣細胞吸收、包裹形成肉芽腫樣結(jié)構(gòu)(圖3A3);肺臟炎性細胞浸潤減輕,肺泡結(jié)構(gòu)有明顯恢復(圖3B3);氣管黏膜脫落減輕,黏膜層及黏膜下層有淋巴細胞浸潤減少(圖3C3)。心、肝、脾和腎等其他組織均未見明顯病理變化,結(jié)果見圖4。

a1～A3.眶下竇切片;B1～B3.肺臟切片;C1～C3.氣管切片A1-A3.Infraorbital sinus sections; B1-B3.Lung sections; C1-C3.Tracheal sections

a1～A3.心臟切片;B1～B3.肝臟切片;C1～C3.脾臟切片;D1～D3.腎臟切片A1-A3.Heart sections; B1-B3.Liver sections; C1-C3.Spleen sections; D1-D3.Kidney sections

3 討論

雞傳染性鼻炎是雞的一種急性上呼吸道傳染病,在季節(jié)更替時尤其多發(fā),主要以育成雞和產(chǎn)蛋雞發(fā)病為主。該病在世界范圍內(nèi)流行,已被中國、美國以及南非等多國報道[11]。近年來,我國多個地區(qū)發(fā)病率呈上升趨勢,而且3個血清型均有流行,其中B型最多,A型次之,C型相對較少[5]。本研究對2016年5月至2017年2月從浙江杭州、浙江金華、安徽宣城、安徽黃山、浙江舟山和浙江寧波等8個養(yǎng)雞場發(fā)現(xiàn)的疑似雞傳染性鼻炎發(fā)病雞群采集的122份樣品進行分離鑒定,副雞禽桿菌陽性數(shù)為48個,陽性率為39.3%,8個養(yǎng)殖場的陽性率為36.8%～50.0%。對10株分離株進行生物特性分析,血清A型3株,血清B型4株,血清C型3株,A型、B型和C型3個菌株的陽性率分別為30%、40%和30%。以上結(jié)果表明江浙皖地區(qū)雞傳染性鼻炎流行依然很嚴重,3個血清型都存在。

接種滅活疫苗仍然是防控雞傳染性鼻炎的主要手段,目前主要有二價苗和三價苗[12-14]。然而,我國多地暴發(fā)雞傳染性鼻炎,甚至在接種了二價或三價滅活疫苗的雞群中仍然發(fā)生,這給雞傳染性鼻炎的防控帶來了困難。另外,不同血清型之間交叉保護性差,現(xiàn)有疫苗能否完全抵抗田間流行菌株對疫病防控是個挑戰(zhàn)。本研究對江浙皖部分地區(qū)疑似雞傳染性鼻炎發(fā)病雞場采樣進行流行病學調(diào)查,經(jīng)形態(tài)學、衛(wèi)星現(xiàn)象試驗、PCR鑒定和血清型鑒定進一步確認為副雞禽桿菌,結(jié)果表明副雞禽桿菌3個血清型均在流行。攻毒試驗表明分離株人工感染SPF雞出現(xiàn)雞傳染性鼻炎的典型癥狀,以呼吸道癥狀為主,面部腫脹、嗜睡、張口呼吸、鼻腔內(nèi)有黃褐色干酪樣滲出物,采食量和飲水量顯著下降,面部和皮下組織出現(xiàn)不同程度的水腫,眼瞼腫脹,發(fā)病率為60%～80%,A血清型(ZZ01株)致死率20%,說明分離到的菌株毒力較強。部分病死雞肺臟出現(xiàn)淤血。病理組織切片觀察發(fā)現(xiàn)眶下竇、肺臟和氣管都有炎性細胞浸潤以及氣管黏膜層脫落,黏膜層及黏膜下層有淋巴細胞浸潤,這與雞傳染性鼻炎典型癥狀一致[15]。

本研究從江浙皖不同地區(qū)分離獲得了A型、B型和C型3種不同血清型的副雞禽桿菌菌株,初步掌握了雞傳染性鼻炎流行情況及不同血清型菌株的毒力及致病力,為雞傳染性鼻炎的防控和三價疫苗研發(fā)奠定了基礎。