豆 薇,趙 龍,郝 峰,呂長榮,王 棟,陳 晨,高?；?韓生義,顧慶云,李生慶*,郭抗抗*

(1.西北農(nóng)林科技大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院,陜西楊凌712100;2.青海省畜牧獸醫(yī)科學(xué)院,青海西寧 810016;3.西藏職業(yè)技術(shù)學(xué)院 西藏獸藥重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,西藏拉薩 850030)

藏藥是發(fā)源于青藏高原的古老民族藥,藥物種類繁多,資源豐富,作為中國傳統(tǒng)醫(yī)藥學(xué)的重要組成部分,我國對(duì)藏藥的開發(fā)和使用在長期與疾病斗爭中積累了豐富的經(jīng)驗(yàn)[1-2]。早在2 000多年前就因其獨(dú)特的理論和療效而著名[3],成為僅次于中醫(yī)藥而有系統(tǒng)理論的民族醫(yī)藥。臨床實(shí)踐證明藏藥在預(yù)防和治療病毒性疾病方面具有明顯的作用,在新型冠狀病毒肺炎(COVID-19)、嚴(yán)重急性呼吸綜合征(SARS)、禽流感等傳染性疾病防治中有一定的作用[4-5]。研究表明,藏藥訶子提取物對(duì)單純皰疹病毒(HSV)、人免疫缺陷病毒(HIV)、乙型肝炎病毒(HBV)等病毒具有較好地抑制作用[6],對(duì)多種致病性革蘭氏陽性(G+)和革蘭氏陰性(G-)細(xì)菌具有廣譜抗菌作用[7],也是目前防治COVID-19藏藥復(fù)方中使用頻數(shù)最多的藥物。甘青烏頭提取物可有效抑制單純皰疹病毒(HSV-2)和牛病毒性腹瀉病毒(BVDV)活性[8-10]。矮紫堇水提物對(duì)BVDV有較好的體外抑制作用,同時(shí)也具有抗菌消炎的作用。研究發(fā)現(xiàn),多種藏藥對(duì)病毒和細(xì)菌均有顯著的抑制活性,對(duì)其進(jìn)行成分鑒定和深入研究是開發(fā)新型抗菌、抗病毒天然藥物的一個(gè)重要來源[11-15]。

本課題組近年來開展抗病毒天然產(chǎn)物的篩選和機(jī)制研究,對(duì)數(shù)十種的藏藥水提物抗病毒作用進(jìn)行了研究,初步篩選到了具有潛在抗病毒作用的8種藏藥,為后續(xù)研究提供了基礎(chǔ)材料。本研究以豬輪狀病毒為靶標(biāo)病原,對(duì)篩選到的8種藏藥水提物的體外抗病毒作用進(jìn)行了初步研究,以期為抗病毒藏藥的篩選、成分鑒定及作用機(jī)制研究提供基礎(chǔ)資料。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 藥物 訶子(TerminaliachebulaRetz.)、甘青烏頭(AconitumtanguticumMaxim.)、矮紫堇(CorydalisedulisMaxim.)、甘青青蘭(DracocephalumtanguticumMaxim.)、川西獐牙菜(SwertiamussotiiFranch.)、短穗兔耳草(LagotisbrachystachyaMaxim.)、鐵棒錘(AconitumpendulumBusch.)、瑞香狼毒(StellerachamaejasmeLinn.)等,西藏自治區(qū)拉薩市堆龍?jiān)粕锕井a(chǎn)品;利巴韋林標(biāo)準(zhǔn)品(貨號(hào):SR8570),索萊寶公司產(chǎn)品。

1.1.2 細(xì)胞與病毒 恒河猴腎細(xì)胞傳代細(xì)胞系(MA-104)由本實(shí)驗(yàn)室保存;豬輪狀病毒(PoRV)G9P[23]型毒株由西北農(nóng)林科技大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院獸醫(yī)公共衛(wèi)生與畜禽產(chǎn)品安全實(shí)驗(yàn)室(本實(shí)驗(yàn)室)分離鑒定和保存,按Reed-Muech氏法計(jì)算PoRV的TCID50為10-6.02/0.1 mL。

1.1.3 主要試劑 CCK-8細(xì)胞增殖毒性檢測試劑盒,米鼠生物科技公司產(chǎn)品;EvoM-MLV反轉(zhuǎn)錄預(yù)混型試劑盒、SYBR?GreenProTaqHS預(yù)混型qPCR試劑盒,AG艾科瑞生物科技有限公司產(chǎn)品;4%多聚甲醛、DAPI溶液,北京索萊寶科技有限公司產(chǎn)品;Triton X-100穿透液、TPCK胰酶,Sigma有限公司產(chǎn)品;兔抗PoRV多克隆抗體由本實(shí)驗(yàn)室制備;CoraLite488-conjugated Goat Anti-Rabbit IgG(H+L),Proteintech Group產(chǎn)品;胎牛血清,依科賽生物科技公司產(chǎn)品;DMEM培養(yǎng)基、0.25%-EDTA-胰酶,Cytiva公司產(chǎn)品;其他試劑均為進(jìn)口或國產(chǎn)分析純。

1.1.4 主要儀器 酶標(biāo)儀(Multiskan FC),美國Thermo公司產(chǎn)品;倒置熒光顯微鏡(Axio Observer),德國ZEISS公司產(chǎn)品;熒光定量PCR儀(CFX Connect),美國Bio-Rad公司產(chǎn)品;高速離心機(jī)(Centrifuge 5417R),德國Eppendorf公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 藏藥水提取物的制備 分別將訶子、甘青烏頭、矮紫堇、甘青青蘭、川西獐牙菜、短穗兔耳草、鐵棒錘、瑞香狼毒等8種藏藥用去離子水洗凈雜質(zhì)后置于55℃烘箱中烘干,備用。分別稱取單個(gè)藏藥50 g,剪切至長度約1 cm左右,加入500 mL去離子水于4℃浸泡12 h,轉(zhuǎn)入砂鍋中大火煮沸,然后用文火煎煮1 h,用8層紗布過濾,將濾液于燒杯中收集,將濾渣中加入500 mL去離子水再次煎煮1 h并過濾,此操作重復(fù)2次,將3次煎煮所得濾液合并,5 000 r/min離心10 min,取上清液于60℃水浴中濃縮,真空干燥制成干粉后密封,4℃避光保存。

1.2.2 藥物稀釋 根據(jù)各種藏藥水提物干燥粉末的黏稠度,選擇適量體積無血清DMEM培養(yǎng)液對(duì)8種藏藥提取物粉末進(jìn)行溶解,以此為原始濃度進(jìn)行2倍梯度稀釋。取100 mg利巴韋林標(biāo)準(zhǔn)品加入1 mL無血清DMEM培養(yǎng)液溶解制成原始濃度藥液,然后進(jìn)行2倍梯度稀釋。稀釋后的藥液經(jīng)0.22 μm濾器過濾,4℃避光保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 藥物對(duì)MA-104細(xì)胞最大安全濃度測定 細(xì)胞按照每孔約1×105個(gè)/mL的密度接種于96孔板,生長至單層細(xì)胞后加入2倍梯度稀釋后的藥物,各藥物的稀釋梯度為2-1～2-20,每孔100 μL,每個(gè)稀釋度設(shè)8個(gè)復(fù)孔,同時(shí)設(shè)立正常細(xì)胞和無細(xì)胞對(duì)照,待致細(xì)胞病變效應(yīng)(CPE)不再繼續(xù)時(shí),用Hank＇s液洗滌96孔板3次,每孔加入10 μL CCK-8試劑后將96孔板在細(xì)胞培養(yǎng)箱(37℃、5% CO2)中繼續(xù)培養(yǎng)2 h,用酶標(biāo)儀測定波長為450 nm處OD值,根據(jù)公式計(jì)算細(xì)胞的存活率。

細(xì)胞存活率=[(As-Ab)/(Ac-Ab)]×100%,As為加藥組OD值,Ab為無細(xì)胞組OD值,Ac為無藥組OD值。最大安全濃度(MNTC)是能夠使90%以上的細(xì)胞存活的藥物濃度。以MNTC為基準(zhǔn),繼續(xù)進(jìn)行5個(gè)梯度的2倍梯度稀釋,用于后續(xù)試驗(yàn)。

1.2.4 藥物對(duì)豬輪狀病毒致細(xì)胞病變作用的影響 將含有200 TCID50PoRV病毒液分別與8種藥物稀釋液等體積混合,每種藥物以安全濃度為基準(zhǔn)各進(jìn)行5個(gè)梯度稀釋(20～2-4),置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中作用2 h,然后將病毒—藥物稀釋液混合物加入96孔板中的MA-104細(xì)胞上(80%細(xì)胞密度)[16],每個(gè)濃度設(shè)8個(gè)復(fù)孔,每孔加入100 μL混合物,細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育2 h,棄上清液,每孔加入100 μL細(xì)胞維持液繼續(xù)培養(yǎng),12、24、36、48、72 h后觀察每孔的CPE情況。同時(shí)設(shè)置正常細(xì)胞對(duì)照組、病毒對(duì)照組(DMEM代替藥物)和空白對(duì)照組,繼續(xù)培養(yǎng)72 h后按1.2.3操作進(jìn)行CCK-8細(xì)胞活力檢測,并計(jì)算藥物對(duì)PoRV引起細(xì)胞病變的抑制率。

抑制率(%)=[(試驗(yàn)加藥組平均OD值-病毒對(duì)照組平均OD值)/(細(xì)胞對(duì)照組平均OD值-病毒對(duì)照組平均OD值)]×100%。

1.2.5 藥物對(duì)豬輪狀病毒復(fù)制的影響 用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測PoRV mRNA相對(duì)表達(dá)量,評(píng)價(jià)藥物對(duì)病毒復(fù)制的影響。將等體積的200 TCID50PoRV病毒液與對(duì)PoRV最大抑制率超過50%的5種藥物稀釋液混合均勻,各藥物濃度均為最大安全濃度,置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中作用2 h后,將病毒-藥物稀釋液混合物加入12孔板中的MA-104細(xì)胞上(80%細(xì)胞密度),每個(gè)濃度設(shè)3個(gè)復(fù)孔,每孔500 μL混合物,置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育2 h,棄上清液,每孔加1 mL細(xì)胞維持液繼續(xù)培養(yǎng)36 h后收取樣本。同時(shí)設(shè)置正常細(xì)胞對(duì)照組、病毒對(duì)照組(DMEM代替藥物)。各組細(xì)胞樣本均使用Trizol法進(jìn)行總RNA提取,然后立即使用Evo M-MLV反轉(zhuǎn)錄預(yù)混型試劑盒合成cDNA。按照本實(shí)驗(yàn)室前期設(shè)計(jì)的VP6基因的引物進(jìn)行檢測[17],以β-actin作為內(nèi)參基因。β-actin引物序列為:上游引物F(GCCAACCGTGAGAAGATGAC),下游引物R(AGGCATACAGGGACAGCACA)。引物序列由西安擎科生物科技有限公司合成,引物使用濃度為10 μmol/L。結(jié)果使用 2-ΔΔCt方法計(jì)算 mRNA 的相對(duì)表達(dá)量,并用GraphPad軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)差異性分析。

1.2.6 藥物對(duì)豬輪狀病毒復(fù)制增殖的影響 間接免疫熒光技術(shù)檢測PoRV蛋白表達(dá),評(píng)價(jià)藥物對(duì)病毒復(fù)制增殖的影響。將等體積的200 TCID50PoRV病毒液與對(duì)PoRV最大抑制率超過50%的5種藥物稀釋液混合均勻,各藥物濃度均為最大安全濃度,置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中作用2 h后,將病毒-藥物稀釋液混合物加入12孔板中的MA-104細(xì)胞上(80%細(xì)胞密度),每個(gè)濃度設(shè)3個(gè)復(fù)孔,每孔500 μL混合物,置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育2 h,棄上清液,每孔加1 mL細(xì)胞維持液繼續(xù)培養(yǎng)36 h后收取樣本。同時(shí)設(shè)置正常細(xì)胞對(duì)照組、病毒對(duì)照組(DMEM代替藥物)。

將處理的各組細(xì)胞樣本用PBS洗滌3次,用4%多聚甲醛固定細(xì)胞25 min;用PBS洗滌3次后,加入穿透液(1% Trition)室溫下作用15 min;PBS洗滌3次后,加入5%脫脂奶粉,37℃封閉1 h;PBS洗滌后,加入1∶100稀釋的兔抗PoRV多克隆抗體,室溫作用1 h;PBS洗滌3次;用1∶500稀釋的CoraLite488-conjugated Goat Anti-Rabbit IgG(H+L) 抗體室溫孵育1 h;PBS洗滌3次后,用DAPI染核8 min;PBS洗滌3次,置倒置熒光顯微鏡觀察熒光強(qiáng)度。

2 結(jié)果

2.1 藥物稀釋濃度

將8種藏藥利用水提法提取并烘干成粉保存?zhèn)溆?。?為各藏藥和利巴韋林藥物的原始稀釋濃度,訶子、甘青烏頭、甘青青蘭、短穗兔耳草、川西獐牙菜、鐵棒錘、瑞香狼毒、矮紫堇和利巴韋林的原始稀釋濃度分別為500.0、500.0、500.0、333.3、250.0、250.0、166.7、500.0、100.0 mg/mL。

表1 藥物原始稀釋濃度

2.2 藏藥水提物對(duì)MA-104細(xì)胞的最大安全濃度

藥物作用細(xì)胞后在顯微鏡下觀察得知,隨藥物濃度的不斷擴(kuò)大,試驗(yàn)加藥組表現(xiàn)出不同程度的細(xì)胞病變,細(xì)胞逐漸皺縮變圓、出現(xiàn)胞質(zhì)空泡化、細(xì)胞脫落聚集成簇等病理變化。訶子、甘青烏頭、甘青青蘭、短穗兔耳草、川西獐牙菜、鐵棒錘、瑞香狼毒、矮紫堇和利巴韋林的稀釋濃度分別在0.02、0.49、0.98、2.60、7.81、15.63、1.30、31.25、0.20 mg/mL之內(nèi)時(shí)的細(xì)胞形態(tài)與正常細(xì)胞對(duì)照組相比基本一致。因此,將該濃度判定為各藥物對(duì)MA-104細(xì)胞的最大安全濃度,如表2所示。

表2 藥物的最大安全濃度

2.3 藥物對(duì)豬輪狀病毒致細(xì)胞病變作用觀察

在藥物與PoRV混合處理2 h后,對(duì)照組細(xì)胞拉絲呈網(wǎng)格狀病變,呈現(xiàn)CPE。而訶子、短穗兔耳草、川西獐牙菜、鐵棒錘、瑞香狼毒5種藏藥水提物組及利巴韋林藥物組在安全濃度下可顯著減輕CPE,未出現(xiàn)典型的細(xì)胞網(wǎng)格狀現(xiàn)象(圖1)。對(duì)PoRV致細(xì)胞病變的最大抑制率分別為63.74%、86.19%、87.37%、91.88%、91.55%、96.33%。甘青烏頭、甘青青蘭和矮紫堇提取物對(duì)PoRV致細(xì)胞病變的最大抑制率均低于20%(圖2)。在安全濃度范圍內(nèi),8種藏藥提取物對(duì)PoRV的抑制率呈一定的量效關(guān)系(表3)。

a.PoRV陽性;b.陰性;c.川西獐牙菜;d.利巴韋林a.PoRV positive; b.control; c.Swertia mussotii; d.Ribavirin

表3 藏藥對(duì)PoRV的有效抑制率

2.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測結(jié)果

5種藏藥水提物對(duì)PoRV在細(xì)胞中mRNA相對(duì)表達(dá)量的影響見圖3,在藥物與PoRV處理2 h后,川西獐牙菜、瑞香狼毒、短穗兔耳草、鐵棒錘、訶子5種藏藥組和利巴韋林用藥組細(xì)胞的PoRV mRNA相對(duì)表達(dá)量顯著低于陽性對(duì)照組細(xì)胞。各用藥組與陽性對(duì)照組相比差異極顯著(P<0.001),表明5種藏藥提取物和利巴韋林藥物能有效抑制PoRV的復(fù)制。

a.PoRV;b.PoRV+訶子;c.PoRV+鐵棒錘;d.PoRV+短穗兔耳草;e.PoRV+川西獐牙菜 ;f.PoRV+瑞香狼毒;g.PoRV+利巴韋林.P<0.05(*),P<0.01(**),P<0.001(***)a.PoRV;b.PoRV+Terminalia chebula; c.PoRV+Aconitum pendulum; d.PoRV+Lagotis brachystachya; e.PoRV+Swertia mussotii; f.PoRV+Stellera chamaejasme; g.PoRV+Ribavirin;P<0.05 (*),P<0.01 (**),P<0.001 (***)

2.5 間接免疫熒光試驗(yàn)結(jié)果

間接免疫熒光結(jié)果顯示感染組PoRV特異性綠色熒光最多,表明PoRV感染了大多數(shù)MA-104細(xì)胞,用藥組綠色熒光明顯減少(圖4),提示訶子、鐵棒錘、短穗兔耳草、川西獐牙菜、瑞香狼毒5種藏藥水提物和利巴韋林能有效抑制PoRV感染,對(duì)PoRV具有抑制作用。

圖4 間接免疫熒光試驗(yàn)觀察藥物對(duì)PoRV感染的抑制作用

3 討論

PoRV屬于呼腸孤病毒科輪狀病毒屬,是引起仔豬腹瀉的重要腸道病原之一,主要造成感染仔豬厭食、嘔吐、腹瀉、水樣糞便等, 嚴(yán)重者甚至導(dǎo)致仔豬死亡[18]。PoRV在我國全國范圍內(nèi)均有流行,具有高發(fā)病率和病死率的特征。該病毒主要存在于患病和帶毒豬的消化道,隨糞便排到外界環(huán)境后,污染飼料、飲水、墊草及土壤等,經(jīng)消化道途徑使易感豬感染[19-20]。由于PoRV與其他引起腸道癥狀的病毒感染臨床癥狀相似,在實(shí)際生產(chǎn)中通常被忽略,而延誤最佳防控時(shí)間,導(dǎo)致大量仔豬死亡,給養(yǎng)殖業(yè)造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。目前對(duì)于PoRV無特效的治療藥物,臨床中常采用疫苗進(jìn)行防控,而傳統(tǒng)疫苗存在免疫失效和交叉保護(hù)性差等問題[21]。因此,篩選和研制抗病毒藥物顯得尤為重要[22-23]。

為篩選出有抗病毒作用的中藥,本課題組從藏藥入手以PoRV為靶標(biāo)病原進(jìn)行抗病毒天然產(chǎn)物的篩選和研究。本研究采用藥物與病毒預(yù)先作用的方式進(jìn)行體外抗病毒試驗(yàn)。CCK-8試驗(yàn)結(jié)果顯示,藏藥訶子、鐵棒錘、短穗兔耳草、川西獐牙菜、瑞香狼毒提取物及利巴韋林藥物對(duì)PoRV有較高的抑制率,最大抑制率均大于50%,能有效減輕細(xì)胞病變效應(yīng)。實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果顯示,5種藏藥提取物和利巴韋林藥物與陽性對(duì)照組相比可顯著降低PoRV mRNA的相對(duì)表達(dá)量,抑制PoRV的復(fù)制增殖。間接免疫熒光結(jié)果顯示,5種藏藥提取物和利巴韋林藥物與陽性對(duì)照組相比PoRV特異性綠色熒光明顯減少,能有效抑制PoRV的感染,與實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果相符。對(duì)3個(gè)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析,推測5種藏藥提取物在體外對(duì)PoRV存在直接殺傷作用,藥物可能影響病毒表面抗原或受體的表達(dá),進(jìn)而影響病毒的黏附和入侵,使細(xì)胞病變減輕,起到抗病毒作用[18]。目前對(duì)5種藏藥提取物的抗病毒作用機(jī)制尚不明確,仍需進(jìn)一步研究。本研究結(jié)果與李曉惠和韻海霞等[24-25]報(bào)道的藏藥具有抗病毒作用的結(jié)果基本相符,進(jìn)一步表明5種藏藥提取物對(duì)PoRV均存在一定的抗病毒作用,研究結(jié)果為藏藥的開發(fā)利用提供了參考。

綜上所述,本研究成功從8種藏藥水提物中篩選出訶子、鐵棒錘、短穗兔耳草、川西獐牙菜、瑞香狼毒5種藏藥水提物,具有一定的體外抗豬輪狀病毒作用。