邢雨霖,沈文康,王佳瑜,洪偉銘,張金基,艾鳳偉*

(1.徐州醫(yī)科大學(xué) 藥學(xué)院,江蘇 徐州 221004;2.江蘇恩華藥業(yè)股份有限公司藥物研究院 江蘇省中樞神經(jīng)藥物研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,江蘇 徐州 221000)

FNB是1975年首次上市的一個(gè)抗高脂血癥藥物,具有降低血液中膽固醇、甘油三酯、低密度和極低密度脂的作用,主要用于治療高膽固醇血癥、嚴(yán)重高甘油三酯血癥和血脂異常[1]。然而,FNB屬于生物制藥分類系統(tǒng)(BCS)Ⅱ類化合物中典型的低溶解度藥物,由于高親脂性幾乎完全不溶于水(logP=5.243),導(dǎo)致其通過上皮膜滲透性低而影響生物利用度[2-3]。因此,提高FNB的溶解度是擴(kuò)展其治療應(yīng)用的關(guān)鍵。

提高低水溶性藥物的生物利用度是當(dāng)前制藥行業(yè)面臨的一個(gè)重要挑戰(zhàn),據(jù)統(tǒng)計(jì),大約90%的新化學(xué)實(shí)體由于低溶解度而影響了臨床應(yīng)用[4]。一直以來(lái),多種制劑技術(shù)和制劑手段被研究應(yīng)用于提高難溶性藥物的溶解度,如固體分散體、納米制劑技術(shù)、微粉化和環(huán)糊精包合等,其中,環(huán)糊精具有提高藥物溶解度、增強(qiáng)藥物穩(wěn)定性、降低刺激性等優(yōu)良的藥劑學(xué)特性,引起研究人員的極大關(guān)注[5]。環(huán)糊精是葡萄糖單體通過α-1,4糖苷鍵連接的錐形環(huán)狀分子,具有親水的外表面和疏水內(nèi)空腔[6],常見的α,β和γ-環(huán)糊精由6,7,8個(gè)葡萄糖分子構(gòu)成,直徑分別為0.47,0.60 和 0.75 nm,不同直徑的環(huán)糊精對(duì)裝載的藥物分子有特定的選擇性。RMβCD是β-環(huán)糊精C2、C3、C8的羥基部分被甲基取代,具有更高的水溶性,在水中溶解度可以達(dá)到50%以上,生物體內(nèi)相容性好,是理想的藥物增溶載體材料[7-8]。

隨著計(jì)算機(jī)技術(shù)和量子化學(xué)的發(fā)展,利用計(jì)算機(jī)模擬環(huán)糊精包合物的研究能更好地了解主客體分子的結(jié)合方式,在分子水平上探討受體與客體分子相互作用以及結(jié)合過程的動(dòng)態(tài)變化。目前,環(huán)糊精包合物文獻(xiàn)的研究模式多是通過相溶解度法考察環(huán)糊精對(duì)藥物的增溶作用,制備環(huán)糊精包合物并進(jìn)行結(jié)構(gòu)表征,環(huán)糊精包合機(jī)理和制備表征相結(jié)合方面的研究相對(duì)較少,因此,本研究采用相溶解度實(shí)驗(yàn)和分子模擬相結(jié)合的方法研究RMβCD和FNB的包合過程,探索FNB和RMβCD分子間的相互作用和包合機(jī)理,此研究方法有望為其他難溶性藥物分子篩選環(huán)糊精載體材料提供一定的理論指導(dǎo)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與材料

SHA-B水浴振蕩器(上海力辰儀器科技有限公司);ATY-124電子天平(島津分析儀器有限公司);KQ-200KDE型高功率數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司);UV-3100 pc紫外可見分光度計(jì)(上海美普達(dá)儀器有限公司)。

FNB(上海麥克林生化科技有限公司,含量99%);RMβCD(平均取代度=12,山東濱州智源生物科技有限公司);0.45 μm微孔過濾器(天津津騰);無(wú)水乙醇、溴化鉀(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司),純凈水。

1.2 方法

1.2.1 FNB紫外含量測(cè)定方法的建立

稱取適量FNB,RMβCD分別配制成一定濃度溶液進(jìn)行紫外全波長(zhǎng)掃描,結(jié)果顯示FNB在290 nm處有最大吸收,而RMβCD在290 nm處無(wú)明顯紫外吸收,對(duì)FNB最大吸收無(wú)干擾,選擇290 nm作為FNB紫外含量測(cè)定檢測(cè)波長(zhǎng)。

精密稱取FNB 0.007 5 g,無(wú)水乙醇溶解定容于50 mL的量瓶中,精密移取上述FNB溶液10 mL置于100 mL量瓶中30%乙醇定容,得15 μg·mL-1的FNB儲(chǔ)備液,分別移取1.0,2.0,4.0,6.0,8.0,10.0 mL于10 mL容量瓶中,30%乙醇溶液定容,在波長(zhǎng)290 nm處測(cè)定吸光度。以吸光度(A)對(duì)濃度(C)作圖, 得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為A=0.052 2C+0.029 9,R2=0.999 9。在1.5～15 μg·mL-1質(zhì)量濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好,方法學(xué)考察精密度、穩(wěn)定性和回收率實(shí)驗(yàn)均符合要求。

1.2.2 相溶解度實(shí)驗(yàn)

配制0,2,4,6,8,10 mmol/L的RMβCD溶液10 mL于量瓶中,依次加入過量的FNB,置于恒溫水浴振蕩器在25,35,45 ℃條件下以100 r·min-1的轉(zhuǎn)速振搖24 h使FNB和RMβCD充分結(jié)合,所得樣品用0.45 μm微孔濾膜過濾,取濾液1.1 mL加入無(wú)水乙醇2 mL,30%的乙醇溶液適當(dāng)稀釋,紫外290 nm處測(cè)定吸光度,平行操作三次。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算FNB濃度,以RMβCD濃度為橫坐標(biāo),FNB濃度為縱坐標(biāo)繪制相溶解度曲線,由公式(1) 計(jì)算不同溫度下的包合穩(wěn)定常數(shù)(KS),其中,S0為RMβCD濃度等于0時(shí) FNB的溶解度,slope為相溶解度曲線的斜率。

KS=slope/[S0(1-slope)]

(1)

1.2.3 分子對(duì)接

β-CD(編號(hào):762697)和FNB(編號(hào):214632)的三維結(jié)構(gòu)均來(lái)自劍橋晶體結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫(kù)(https://ccdc.cam.ac.uk/),RMβCD的結(jié)構(gòu)是基于β-CD結(jié)構(gòu)使用Avogadro軟件進(jìn)行繪制獲得,RMβCD結(jié)構(gòu)作為對(duì)接過程的受體,FNB作為配體,將配體FNB和受體RMβCD利用AutoDockTools-1.5.7進(jìn)行去水和加全氫等預(yù)處理,使用 AutoDock-Vina進(jìn)行半柔性分子對(duì)接[9],以整個(gè)RMβCD結(jié)構(gòu)作為潛在的結(jié)合位點(diǎn)進(jìn)行盲對(duì)接。對(duì)接坐標(biāo)為x=21.0,y=15.0,z=15.0,選擇自由結(jié)合能最低的構(gòu)象使用 Pymol進(jìn)行結(jié)果分析。

1.2.4 分子動(dòng)力學(xué)模擬

2 結(jié)果與討論

2.1 相溶解度

不同溫度下的FNB-RMβCD相溶解度曲線如圖1所示,可見FNB濃度隨RMβCD濃度增加而增大,25,35,45 ℃下的相溶解度曲線方程分別為y=0.006 4x-0.006 2,y=0.009 2x-0.008 9和y=0.009 2x-0.008 9,曲線斜率小于1,根據(jù)Higuchi and Connors相溶解度曲線分類屬于AL型,即 RMβCD與FNB按照物質(zhì)的量比 1∶1形成包合物。三個(gè)溫度下的包合穩(wěn)定常數(shù)KS分別為4 969.90,5 833.21,7 141.07 L·mol-1,說(shuō)明隨著溫度的升高包合穩(wěn)定常數(shù)增大,越有利于包合物的生成,這可能與溫度升高可以增加主客體分子在溶液中的無(wú)序分布,進(jìn)而增加分子間接觸機(jī)會(huì)從而有利于包合物的生成。

圖1 FNB和RMβCD的相解度圖

2.2 分子對(duì)接

(a)大口端正視圖;(b)小口端正視圖。

2.3 結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性與結(jié)合構(gòu)象

分子動(dòng)力學(xué)模擬可驗(yàn)證分子對(duì)接結(jié)果的可靠性和形成包合物的動(dòng)力學(xué)穩(wěn)定性[13],均方根偏差(RMSD)是一種用于描述結(jié)構(gòu)偏差的標(biāo)準(zhǔn)測(cè)量,有助于分析生物結(jié)構(gòu)的時(shí)間依賴性運(yùn)動(dòng),RMSD值的變化反映了模擬過程中受體與配體分子之間相互作用姿態(tài)的改變,RMSD在一定范圍波動(dòng)達(dá)到收斂時(shí),可以認(rèn)為分子的構(gòu)型變化較小,結(jié)構(gòu)達(dá)到穩(wěn)定[14-15]。

圖3為200 ns的模擬時(shí)間內(nèi)包合物中主客體分子和包合物相對(duì)初始結(jié)構(gòu)的RMSD動(dòng)態(tài)變化圖。圖3(a)和(b)分別為FNB和RMβCD的RMSD圖,在分子動(dòng)力學(xué)模擬中FNB和RMβCD的RMSD均值分別為(0.193 3±0.040 2) nm和(0.146 8±0.028 8) nm,說(shuō)明主客體分子結(jié)構(gòu)的變化均在非常小的范圍內(nèi),而包合物圖3(c)的RMSD在0～20 ns的模擬時(shí)間內(nèi)有一個(gè)從初始的0.15 nm增加到0.30 nm的變化,結(jié)合圖3(d)不同模擬時(shí)間的包合物結(jié)合構(gòu)象可知在0 ns時(shí),FNB的芳香環(huán)已完全進(jìn)入RMβCD疏水性空腔內(nèi), 15 ns時(shí)與甲酯基連接的芳香環(huán)已部分脫離RMβCD空腔,在后續(xù)150 ns的模擬時(shí)間里主要維持這樣的結(jié)合構(gòu)象,這可能是由于環(huán)糊精小口端的甲基基團(tuán)與FNB分子的空間位阻所致,此外,RMβCD包合物在～25,～60,～90,～130 ns和顯示出更大的偏離收斂軌跡的現(xiàn)象,這些偏差表明包合物的多種不同穩(wěn)定構(gòu)象可能是FNB分子在RMβCD結(jié)構(gòu)空腔內(nèi)的重新取向。整個(gè)200 ns模擬中包合物的RMSD均值為(0.291 9±0.077 1) nm,可能是由于FNB和RMβCD形成了更大空間結(jié)構(gòu)的包合物結(jié)構(gòu)體,而且FNB分子在RMβCD在空腔中的位置和結(jié)構(gòu)動(dòng)態(tài)變化對(duì)兩者的構(gòu)象有一定程度的影響,所以包合物的RMSD較自由的FNB和RMβCD單體都有增加。然而,FNB-RMβCD包合物和主、客體分子RMSD波動(dòng)幅度都在較小的范圍內(nèi),說(shuō)明模擬過程中結(jié)構(gòu)已達(dá)穩(wěn)定狀態(tài)。

(a)FNB;(b)RMβCD;(c)FNB-RMβCD;(d)不同時(shí)間的結(jié)合構(gòu)象。

2.4 FNB-RMβCD結(jié)合能自由能分析

模擬體系結(jié)合自由能的變化直接反映了主客體分子間相互作用的大小[16]。FNB和RMβCD之間的相互作用自由能通過分子力學(xué)泊松-玻爾茲曼表面積(MM-PBSA)將熵貢獻(xiàn)、構(gòu)象波動(dòng)與MD模擬數(shù)據(jù)相結(jié)合計(jì)算。根據(jù)RMSD分析結(jié)果選擇結(jié)構(gòu)完全穩(wěn)定的180～200 ns時(shí)間的模擬數(shù)據(jù)進(jìn)行結(jié)合自由能分析,結(jié)果如圖4所示。

(a)結(jié)合自由能;(b)組成圖。

FNB和RMβCD的結(jié)合自由能(圖4a)為(-12.76 ±1.84) kcal/mol,結(jié)合自由能為負(fù)值說(shuō)明包合過程為非外力驅(qū)動(dòng)的自發(fā)過程,結(jié)合自由能數(shù)值越小,結(jié)合力越強(qiáng),在180～200 ns的模擬時(shí)間內(nèi)的結(jié)合自由能呈規(guī)律性的小范圍波動(dòng),說(shuō)明模擬結(jié)合構(gòu)象達(dá)到穩(wěn)定狀態(tài);MM-PBSA將結(jié)合自由能拆分成分子力學(xué)項(xiàng)(GGAS)和溶劑化能(GSOLV),其中GGAS包括范德華能量項(xiàng)(VDWAALS)和靜電能量項(xiàng) (EEL),而GSOLV又分為極性溶劑化能(EPB)和非極性溶劑化能(ENPOLAR)。圖4b所示為FNB和RMβCD的結(jié)合自由能組成,GGAS是結(jié)合自由能的主要貢獻(xiàn)者,反映出主客體分子間強(qiáng)烈的相互作用,GGAS中范德華力起到關(guān)鍵的作用,靜電力作用相對(duì)較小,而GSOLV對(duì)結(jié)合自由能呈負(fù)面作用,說(shuō)明溶劑化不利于主客體分子的結(jié)合。

3 結(jié)論

首先,在 25,35,45 ℃的相溶解度實(shí)驗(yàn)中,FNB 的溶解度隨RMβCD濃度的增加而呈線性的增大,不同溫度下相溶解度曲線均為 AL型,斜率小于1,表明FNB與RMβCD按1∶1的物質(zhì)的量比形成包合物,三個(gè)溫度下的包合穩(wěn)定常數(shù)分別為4 969.90,5 833.21,7 141.07 L·mol-1,提示隨著溫度的升高有利于包合物的形成,可能升高溫度增加了FNB和RMβCD分子的無(wú)序運(yùn)動(dòng)而促使包合物的生成。