潘章超，張人諭，黎歡昶，曾念開(kāi)，王 勇

（熱帶藥物創(chuàng)新與轉(zhuǎn)化教育部工程研究中心，人機(jī)智能協(xié)同腫瘤精準(zhǔn)診療國(guó)際聯(lián)合研究中心，海南省熱帶藥用植物研究開(kāi)發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，海南醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，海南 ?？?571199）

糖尿病是一種以胰島素分泌不足或自身無(wú)法正常使用胰島素控制血糖水平為特征的疾病[1]。臨床上糖尿病通?？梢苑譃?型糖尿病、2型糖尿病和妊娠糖尿病，其中2型糖尿病占糖尿病患者總?cè)藬?shù)的90%以上[2]。我國(guó)糖尿病患者人數(shù)已超過(guò)1.14億，據(jù)國(guó)際糖尿病聯(lián)盟預(yù)測(cè)，到2030年，這一數(shù)值將達(dá)到3.66億[3-4]。糖尿病的經(jīng)久不愈容易對(duì)各種器官造成危害甚至引發(fā)一系列并發(fā)癥，如房顫[5]、動(dòng)脈粥樣硬化、高血壓[6]、糖尿病腎病和糖尿病視網(wǎng)膜病變[7]等，已經(jīng)嚴(yán)重危害著人們的身體健康。目前口服降糖藥和注射胰島素是治療2型糖尿病的主要方法，但其藥物都存在一定的不良反應(yīng)。因此開(kāi)發(fā)一種安全、有效和副作用小的降血糖藥物至關(guān)重要。

天然來(lái)源多糖因其具有降血糖[8-9]、抗氧化[10]、免疫調(diào)節(jié)[11]和抗炎[6-12]等作用引起越來(lái)越多人的關(guān)注。文丹等[13]采用水提取法得到麥冬多糖的粗提物，通過(guò)自由基清除實(shí)驗(yàn)證明了麥冬多糖在體外具有很好的抗氧化效果；在體內(nèi)H2O2誘導(dǎo)的NIH/3T3細(xì)胞損傷模型中，麥冬多糖的預(yù)處理可以很好地降低NIH/3T3細(xì)胞的死亡率、單線態(tài)氧的產(chǎn)生和炎癥因子的表達(dá)量，進(jìn)一步證明了麥冬多糖在細(xì)胞體內(nèi)的抗氧化效果；最后在葡萄糖苷酶活性實(shí)驗(yàn)中，麥冬多糖對(duì)葡萄糖苷酶具有呈濃度依賴(lài)性的抑制作用。因此，從天然產(chǎn)物中制備多糖，開(kāi)發(fā)新型、安全、高效的降血糖藥物已成為該領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。

暗褐脈柄牛肝菌（Phlebopus portentosus(Berk.&Broome) Boedijn）又名暗褐網(wǎng)柄牛肝菌，俗稱(chēng)“黑牛肝菌”，為小牛肝菌科（Boletinellaceae）、脈柄牛肝菌屬（Phlebopus）真菌[14-16]。該種主要分布在中國(guó)海南、云南和廣西等地區(qū)[17]。暗褐脈柄牛肝菌個(gè)體肥美，富含多種礦物質(zhì)，是高蛋白、低脂肪、備受公眾喜愛(ài)的食用菌，同時(shí)具有較好的藥用價(jià)值[18]，具有清熱解煩、補(bǔ)虛提神、疏筋活血等功效[19]。現(xiàn)代藥理研究表明真菌多糖具有顯著的免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤、抗氧化、抗菌、抗炎、降血脂等生物學(xué)活性[20-22]。Karnchanatat等[23]利用水提醇沉法得到多糖蛋白質(zhì)復(fù)合物，經(jīng)分離純化后，獲得大量的多糖片段PPC-P11，實(shí)驗(yàn)表明PPC-P11具有很強(qiáng)的抗氧化能力。當(dāng)前，暗褐脈柄牛肝菌多糖的體外降血糖活性的研究較少，有待對(duì)其進(jìn)行深入研究。本研究首先獲得暗褐脈柄牛肝菌粗多糖，并對(duì)其進(jìn)一步分離純化得到純化多糖組分，通過(guò)紫外光譜、紅外光譜、核磁共振和掃描電子顯微鏡等對(duì)純化多糖進(jìn)行初步結(jié)構(gòu)表征，通過(guò)α-葡萄糖苷酶抑制實(shí)驗(yàn)篩選活性最好的組分，并闡明其降血糖活性及機(jī)制，為暗褐脈柄牛肝菌降血糖相關(guān)醫(yī)藥產(chǎn)品的研發(fā)和生產(chǎn)提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

暗褐脈柄牛肝菌子實(shí)體購(gòu)自云南西雙版納傣族自治州，由海南醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院曾念開(kāi)教授鑒定為小牛肝菌科脈柄牛肝菌屬真菌暗褐脈柄牛肝菌（Phlebopus portentosus）的子實(shí)體。

DEAE-52纖維素 浙江聯(lián)碩生物科技有限公司；日本三菱化學(xué)大孔吸附樹(shù)脂（HP 20、HP 2MGL、SP 825、SP 850）上海摩速科學(xué)器材有限公司；4-硝基酚-α-D-吡喃葡萄糖苷（4-nitrophenyl-alpha-Dglucopyranoside，PNPG）、α-葡萄糖苷酶（10 U/mg）、阿卡波糖、牛血清白蛋白、丙烯葡聚糖凝膠S-400HR 上海源葉生物科技有限公司；對(duì)硝基苯酚（4-nitrophenol，PNP）百靈威科技有限公司；D2O上海麥克林生化科技有限公司；溴化鉀（光譜純）天津市大茂化學(xué)試劑廠；考馬斯亮藍(lán) 伯樂(lè)生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品（上海）有限公司；其余試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

T6新世紀(jì)紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì) 北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；Spectra Max 190全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀 上海美谷分子儀器有限公司；RE-3000A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海亞榮生化儀器廠；CBS-A程控全自動(dòng)部分收集器 上海滬西儀器廠有限公司；HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋 金壇區(qū)西城新瑞儀器廠；JNM-ECZ400S/L1核磁共振波譜儀日本電子株式會(huì)社；1100高效液相色譜儀 美國(guó)安捷倫公司；1525高效液相色譜儀 沃特世科技（上海）有限公司；Nicolet iS5紅外光譜儀 美國(guó)賽默飛世爾科技有限公司；Quanta FEG250場(chǎng)發(fā)射掃描電子顯微鏡 美國(guó)FEI公司。

1.3 方法

1.3.1 暗褐脈柄牛肝菌粗多糖的提取

稱(chēng)取暗褐脈柄牛肝菌子實(shí)體粉末100 g，加體積分?jǐn)?shù)95%乙醇溶液1 000 mL，置于超聲波提取器中超聲30 min（40 ℃）；離心（4 000 r/min、10 min），保留沉淀；沉淀加入1 000 mL去離子水，在80 ℃的水浴鍋內(nèi)浸提2 h，過(guò)濾，保留濾液，濾渣加入1 000 mL去離子水在同條件下繼續(xù)提取，重復(fù)提取4 次，合并4 次濾液，將上清液濃縮；在濃縮液中緩慢加入4 倍體積的體積分?jǐn)?shù)95%乙醇溶液進(jìn)行沉淀，并在4 ℃靜置24 h；離心（4 000 r/min、10 min）得到沉淀，沉淀加200 mL去離子水溶解；加入200 mL的Sevag試劑（氯仿∶正丁醇＝4∶1，V/V）進(jìn)行萃取，去除蛋白質(zhì)，保留上清液，重復(fù)此過(guò)程3 次。

1.3.2 大孔樹(shù)脂的篩選及脫色

對(duì)HP 2MGL、HP 20、SP 850、SP 825 4 種型號(hào)的大孔樹(shù)脂進(jìn)行篩選，測(cè)定多糖脫色前后的吸光度，分別記為A前和A后，按式（1）計(jì)算脫色率，脫色前后蛋白質(zhì)量分別記為M前和M后，按式（2）計(jì)算脫蛋白率，脫色前后多糖質(zhì)量分別記為m前和m后，按式（3）計(jì)算多糖保留率，按照多糖保留率50%、脫色率30%、脫蛋白率20%進(jìn)行加權(quán)，再選擇合適的大孔吸附樹(shù)脂進(jìn)行脫色。將上清液置于燒杯中，加入體積分?jǐn)?shù)6%的經(jīng)篩選出的最優(yōu)大孔樹(shù)脂進(jìn)行攪拌脫色[24]；脫色后得到的溶液加入4 倍體積95%乙醇溶液進(jìn)行沉淀，靜置過(guò)夜，離心，沉淀冷凍干燥得暗褐脈柄牛肝菌子實(shí)體粗多糖。

1.3.3 暗褐脈柄牛肝菌多糖的分離純化

稱(chēng)取1.5 g暗褐脈柄牛肝菌粗多糖粉末，溶解至10 mL去離子水中，分裝至2 mL離心管中，離心，保留上清液；在已處理好的DEAE-52纖維素色譜柱中加入粗多糖溶液，分別用蒸餾水、NaCl溶液（0.1、0.2、0.4 mol/L）洗脫，用苯酚-濃硫酸法[25]檢測(cè)多糖含量，得到暗褐脈柄牛肝菌子實(shí)體純化多糖含量梯度曲線；將各級(jí)洗脫液濃縮、透析和冷凍干燥48 h；對(duì)含量較高的洗脫組分進(jìn)行丙烯葡聚糖凝膠S-400HR二次分級(jí)純化，冷凍干燥即得到暗褐脈柄牛肝菌子實(shí)體純化多糖。

1.3.4 多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)的測(cè)定

精密稱(chēng)取烘干至恒質(zhì)量的葡萄糖對(duì)照品10 mg于100 mL容量瓶中，加蒸餾水溶解并定容至刻度，配成質(zhì)量濃度為0.1 mg/mL的葡萄糖溶液備用。移取0.1 mg/mL葡萄糖對(duì)照品溶液0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7 mL分別置于10 mL具塞試管中，分別加蒸餾水補(bǔ)至2.0 mL。在試管中加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)6%苯酚溶液1.0 mL后再快速加濃硫酸5.0 mL，混勻靜置10 min，于沸水浴內(nèi)加熱15 min，然后取出快速冷卻至室溫。在490 nm處測(cè)吸光度，以葡萄糖質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

配制0.1 mg/mL的暗褐脈柄牛肝菌多糖溶液，吸取0.1 mL，用蒸餾水補(bǔ)至2.0 mL，同對(duì)照品方法操作，最后在490 nm處測(cè)吸光度，代入標(biāo)準(zhǔn)曲線換算即可求得多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)。

1.3.5 蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)的測(cè)定

稱(chēng)取10 mg牛血清白蛋白于100 mL容量瓶中定容至刻度線，配制成0.1 mg/mL牛血清白蛋白標(biāo)準(zhǔn)溶液。精確稱(chēng)取0.020 1 g的考馬斯亮藍(lán)G-250溶于10.0 mL體積分?jǐn)?shù)為95%的乙醇溶液中，加入20.0 mL 85%的濃H3PO4溶液，用蒸餾水定容至200 mL，經(jīng)雙層濾紙過(guò)濾后得考馬斯亮藍(lán)溶液，避光保存?zhèn)溆?。分別吸取0.00、0.20、0.40、0.60、0.80、1.00 mL牛血清白蛋白標(biāo)準(zhǔn)溶液，依次加入純水補(bǔ)至1 mL，再加入5.0 mL考馬斯亮藍(lán)備用液，靜置15 min，在595 nm處測(cè)定吸光度，根據(jù)數(shù)據(jù)繪圖，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線。

取1 mg/mL多糖溶液1 mL，同牛血清白蛋白方法操作，最后在595 nm處測(cè)吸光度，代入標(biāo)準(zhǔn)曲線換算即可求得蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)。

1.3.6 分子質(zhì)量的測(cè)定

采用水相凝膠滲透色譜法測(cè)定多糖的分子質(zhì)量，色譜條件：示差折光檢測(cè)器；色譜柱（PL aquqgel-OH MIXED 8 μm；7.8 mm×30 cm）；柱溫30 ℃；流動(dòng)相為0.2 mol/L NaNO3和NaH2PO4混合溶液（pH 7）；流速1 mL/min，進(jìn)樣量10 μL，進(jìn)行不同相對(duì)分子質(zhì)量的葡聚糖標(biāo)準(zhǔn)品（1×103～1×105）和樣品分析。通過(guò)Breeze軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，最后確定該多糖的平均分子質(zhì)量。

1.3.7 單糖組成的測(cè)定

稱(chēng)取10 mg（精確到0.1 mg）多糖樣品于20 mL的鉗口瓶中，加入5 mL的2 mol/L三氟乙酸溶液，充N(xiāo)2封管（10 L/min、1 min），100 ℃烘箱中水解2 h；冷卻后打開(kāi)蓋，取1 mL加入1 mL甲醇后，70 ℃水浴下用N2吹干，加入1 mL 0.3 mol/L NaOH溶液。分別取400 μL的混合單糖標(biāo)準(zhǔn)液或多糖水解液于5 mL的具塞試管中，加400 μL PMP甲醇溶液，于70 ℃水浴中反應(yīng)2 h；加400 μL 0.3 mol/L的HCl溶液中和（pH 6～7）；加水1 200 μL，再加等體積的氯仿，渦旋混勻振搖，靜置，棄去氯仿相，萃取2 次。將水相用0.45 μm微孔膜（水系）過(guò)濾后供高效液相色譜儀進(jìn)樣分析。色譜條件：色譜柱C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相A：90 mmol/L磷酸鈉緩沖液（pH 7.8）；流動(dòng)相B：乙腈；檢測(cè)波長(zhǎng)：250 nm；柱溫：30 ℃；流速：1 mL/min；進(jìn)樣體積：10 μL；梯度洗脫條件：0～9 min，86% A、14% B；9～28 min，83% A、17% B；28～29 min，78% A、22% B；29～32 min，50% A、50% B；32～36 min，86% A、14% B。

1.3.8 紫外光譜分析

取暗褐脈柄牛肝菌粗多糖10 mg，置10 mL容量瓶中定容，在200～400 nm范圍進(jìn)行掃描測(cè)定[26]。

1.3.9 紅外光譜分析

取暗褐脈柄牛肝菌粗多糖2 mg加入0.2 g KBr固體混合研磨均勻，取約80 mg壓片，在4 000～400 cm-1范圍進(jìn)行紅外光譜測(cè)定[27]。

1.3.10 核磁共振分析

稱(chēng)取暗褐脈柄牛肝菌粗多糖10 mg溶于0.6 mL D2O中，溶解后轉(zhuǎn)移至核磁管，密封。在核磁共振波譜儀上進(jìn)行1H-NMR和13C-NMR測(cè)定[28]。

1.3.11 掃描電子顯微鏡觀察

取少量多糖粉末直接粘到導(dǎo)電膠上后噴金，在10 kV加速電壓下，分別在500、1 000 倍和2 000 倍條件下采用Quanta FEG250場(chǎng)發(fā)射掃描電子顯微鏡觀察并記錄樣品的微觀形態(tài)。

1.3.12α-葡萄糖苷酶抑制率測(cè)定

精密稱(chēng)取暗褐脈柄牛肝菌多糖樣品1 0 m g，用4 mL 0.01mol/L的磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）溶解，得到2.5 mg/mL的暗褐脈柄牛肝菌子實(shí)體多糖溶液，并將其分別稀釋成質(zhì)量濃度為0.25、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mg/mL的多糖溶液。

參考文獻(xiàn)[29]方法，并作適當(dāng)改進(jìn)。暗褐脈柄牛肝菌子實(shí)體多糖樣品組：吸取不同質(zhì)量濃度的多糖溶液40 μL于96 孔板中，加入30 μL的α-葡萄糖苷酶（0.2 U/mL），輕晃混勻，在37 ℃的生化培養(yǎng)箱中孵育10 min，然后加入30 μL的PNPG溶液（0.5 mmol/L），在37 ℃的生化培養(yǎng)箱中孵育20 min，最終每孔加入50 μL的碳酸鈉溶液（0.5 mol/L）終止反應(yīng)，5 min后用酶標(biāo)儀在405 nm處測(cè)定其吸光度。樣品對(duì)照組：將上述步驟中的“加入30 μL的α-葡萄糖苷酶（0.2 U/mL）”改為“加入30 μL的PBS”，其余步驟相同?？瞻讓?duì)照組：用等量的PBS溶液代替多糖溶液，其余步驟相同。用阿卡波糖溶液作為陽(yáng)性對(duì)照，每個(gè)樣品做3 次平行實(shí)驗(yàn)。

α-葡萄糖苷酶抑制率計(jì)算如式（4）所示：

式中：A0為空白對(duì)照組吸光度；A1為多糖樣品組吸光度；A2為樣品對(duì)照組吸度。

1.3.13α-葡萄糖苷酶抑制機(jī)理的確定

參考文獻(xiàn)[30]方法，并稍作修改。在固定底物濃度的條件下，改變酶的用量，測(cè)定不同質(zhì)量濃度的多糖組分對(duì)α-葡萄糖苷酶抑制率的影響。取40 μL不同質(zhì)量濃度的多糖（0、2、4 mg/mL），每個(gè)質(zhì)量濃度分別加入0.2 U/mL的α-葡萄糖苷酶液30、60、90、120 μL，30 μL 0.5 mmol/L的PNPG為底物，按1.3.12節(jié)方法測(cè)定，利用酶標(biāo)儀在405 nm處測(cè)定吸光度。以酶用量（橫坐標(biāo)）對(duì)應(yīng)反應(yīng)速率（縱坐標(biāo)）作圖，由此圖反映α-葡萄糖苷酶經(jīng)暗褐脈柄牛肝菌多糖組分作用后剩余的酶活力與加入酶量間的關(guān)系。并根據(jù)動(dòng)力學(xué)分析，判斷是可逆抑制還是不可逆抑制。

1.3.14α-葡萄糖苷酶抑制動(dòng)力學(xué)

依次向試管中加入0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL的PNP溶液（0.5 mmol/L），再加入0.5 mol/L的碳酸鈉溶液至2.31 mL，以蒸餾水為空白對(duì)照，利用酶標(biāo)儀在405 nm處測(cè)定吸光度；以PNP的體積為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，繪制線性回歸方程，得到PNP標(biāo)準(zhǔn)曲線。

參考文獻(xiàn)[31]方法，并稍作修改。在固定酶濃度為0.2 U/mL的條件下，改變加入底物PNPG的濃度，測(cè)定暗褐脈柄牛肝菌子實(shí)體多糖對(duì)α-葡萄糖苷酶活力的影響。方法同1.3.12節(jié)，改變底物PNPG濃度為0.125、0.25、0.5、1.0、2.0 mmol/L。以酶反應(yīng)的初速度對(duì)底物濃度作圖，通過(guò)Lineweaver-Burk雙倒數(shù)方程作圖，并判斷抑制類(lèi)型。

1.4 數(shù)據(jù)處理及分析

采用Excel和GraphPad 8.0.2軟件處理數(shù)據(jù)，用表示結(jié)果，采用Origin 2021軟件作圖，其中P＜0.05代表具有顯著差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 暗褐脈柄牛肝菌多糖的提取結(jié)果

100 g暗褐脈柄牛肝菌粉末經(jīng)水提醇沉得到暗褐脈柄牛肝菌粗多糖8.9 g，得率為8.9%。以標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖為對(duì)照品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到擬合方程為Y＝12.425X-0.036 7（R2＝0.999 8），計(jì)算得到粗多糖中多糖的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為44.13%。以牛血清白蛋白為對(duì)照品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到擬合方程為Y＝7.775X+0.062 9（R2＝0.999 8），計(jì)算得到粗多糖中的蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)為51.4%。

2.2 4 種大孔樹(shù)脂的篩選結(jié)果

如表1所示，HP 2MGL具有較高的多糖保留率，但脫色率較差，僅41.82%，而SP 825的脫色率最好，其也具有較高的多糖保留率，綜合加權(quán)平均結(jié)果分析，SP 825型大孔樹(shù)脂最適用于暗褐脈柄牛肝菌多糖提取液的脫色并用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

表1 4 種樹(shù)脂對(duì)暗褐脈柄牛肝菌多糖的脫色實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 1 Decolorization efficiencies of four types of resin for the crude polysaccharide from P.portentosus

2.3 暗褐脈柄牛肝菌多糖的分離純化結(jié)果

如圖1所示，通過(guò)DEAE-52纖維素柱色譜后，獲得了3 個(gè)明顯的洗脫峰。其中，蒸餾水洗脫峰與NaCl（0.1 mol/L）的洗脫峰面積比較大，含量相對(duì)較多，合并洗脫液，經(jīng)透析、冷凍干燥后得3 種暗褐脈柄牛肝菌純化多糖組分粉末：PPP-0、PPP-1、PPP-2，其中PPP-0含量最高，PPP-2含量最低。由于另外兩個(gè)組分較少且不易收集，因此只將PPP-0收集后進(jìn)行下一步分離純化。PPP-0經(jīng)Sephacryl凝膠S-400HR柱分離純化后得到單一對(duì)稱(chēng)的吸收峰見(jiàn)圖2，證明PPP-0均一性良好，將洗脫液收集凍干得絮狀組分PPP-0。

圖1 暗褐脈柄牛肝菌多糖的DEAE-52纖維素色譜洗脫曲線Fig.1 Elution curves of polysaccharides from P.portentosus by DEAE-52 cellulose column chromatography

圖2 圖1中PPP-0的丙烯葡聚糖凝膠S-400HR柱層析洗脫曲線Fig.2 Elution curve of PPP-0 shown in Fig.1 by Sephacryl S-400HR column chromatography

2.4 分子質(zhì)量

表2為暗褐脈柄牛肝菌多糖（PPP-0）分子質(zhì)量表，圖3為暗褐脈柄牛肝菌多糖的分子質(zhì)量測(cè)定色譜圖，暗褐脈柄牛肝菌多糖的水相凝膠滲透色譜洗脫曲線只有一個(gè)峰，重均分子質(zhì)量為31 059 Da，說(shuō)明多糖組分均一。

圖3 暗褐脈柄牛肝菌多糖的凝膠滲透色譜圖Fig.3 Gel permeation chromatogram of PPP-0

表2 暗褐脈柄牛肝菌多糖的分子質(zhì)量Table 2 Molecular mass of PPP-0

2.5 單糖組成

如圖4所示，與13 種單糖混合對(duì)照品標(biāo)準(zhǔn)圖譜進(jìn)行對(duì)比，暗褐脈柄牛肝菌多糖由4 種單糖組成，分別為甘露糖Man、葡萄糖Glc、半乳糖Gal、巖藻糖Fuc，其物質(zhì)的量比為1.029∶5.312∶14.022∶2.925，其物質(zhì)的量百分比依次為4.4%、22.8%、60.2%、12.6%。

圖4 13 種單糖標(biāo)準(zhǔn)品（A）及暗褐脈柄牛肝菌多糖（B）的高效液相色譜圖Fig.4 High performance liquid chromatograms of mixture of 13 monosaccharide standards (A) and PPP-0 (B)

2.6 紫外光譜分析

如圖5所示，黑色曲線是DEAE-52纖維素柱色譜分離后得到的多糖溶液紫外光譜圖，紅色曲線是該多糖經(jīng)過(guò)丙烯葡聚糖凝膠S-400HR柱色譜分離后的紫外光譜圖，可以看出，該多糖在260 nm附近有紫外吸收，結(jié)合多糖含量測(cè)定結(jié)果，推測(cè)可能為成分均一的糖蛋白復(fù)合體。

圖5 暗褐脈柄牛肝菌多糖的紫外光譜圖Fig.5 UV spectra of PPP-0

2.7 紅外光譜分析

由圖6可知，3 405 cm-1處的吸收峰寬且強(qiáng)，為多糖分子中—OH的分子間締合的氫鍵，2 937 cm-1處的中等強(qiáng)度的吸收峰是飽和C—H伸縮振動(dòng)，1 652 cm-1處為酰胺羰基峰，說(shuō)明組分中含有氨基糖，多糖中可能含有部分與糖結(jié)合的蛋白。1 384 cm-1處出現(xiàn)弱的吸收峰，是由于C—H的變角振動(dòng)。1 081 cm-1處是醇羥基的變角振動(dòng)吸收峰。這些都是典型的多糖特征峰。988 cm-1處的吸收峰表明該多糖為吡喃型糖環(huán)，866 cm-1處附近的一系列的吸收峰表明該多糖同時(shí)存在α和β兩種構(gòu)型。

圖6 暗褐脈柄牛肝菌多糖的紅外光譜圖Fig.6 Infrared spectrum of PPP-0

2.8 核磁共振波譜分析

一般情況下，在δ4.3～5.5端基質(zhì)子區(qū)，α-糖苷的端基質(zhì)子的化學(xué)位移一般大于δ4.95，β-構(gòu)型的糖端基質(zhì)子化學(xué)位移小于δ4.95，根據(jù)圖7A，δ4.94、4.93、4.48是β型H1質(zhì)子信號(hào)，δ5.01和δ5.02處是α型H1質(zhì)子信號(hào)，表明該多糖既有β型吡喃糖環(huán)結(jié)構(gòu)也有α型吡喃糖環(huán)結(jié)構(gòu)，δ1.17、1.18、1.27、1.25為巖藻糖CH3的質(zhì)子信號(hào)。δ3.17、3.42等化學(xué)位移在δ3.0～4.0區(qū)域?yàn)樘菤埢蟹嵌嘶|(zhì)子的次甲基和亞甲基共振區(qū)。圖7B中，在端基碳的共振區(qū)（δ90～110）中，δ97.91是α型C1的共振信號(hào)，δ15.74為巖藻糖CH3上C的共振信號(hào)，對(duì)于游離C6共振信號(hào)約在δ62氧取代后則位移到δ68，所以δ68.32和δ68.86是發(fā)生氧取代的C6信號(hào)，說(shuō)明該多糖有(1→6)糖苷鍵。綜合以上信息，可知該多糖包括α和β兩種構(gòu)型，具有(1→6)糖苷鍵，但該多糖是結(jié)構(gòu)較為復(fù)雜的雜多糖，僅憑現(xiàn)有數(shù)據(jù)無(wú)法分析其具體結(jié)構(gòu)，還需要結(jié)合甲基化實(shí)驗(yàn)和二維核磁共振相關(guān)譜進(jìn)一步分析確定其結(jié)構(gòu)。

圖7 暗褐脈柄牛肝菌多糖的1H-NMR（A）和13C-NMR（B）圖Fig.7 1H-NMR (A) and 13C-NMR (B) spectra of PPP-0

2.9 掃描電子顯微鏡圖分析

從圖8可以看出，暗褐脈柄牛肝菌多糖呈片狀，有的卷曲，大小、形狀不均勻，在更高倍數(shù)下，表面相對(duì)緊密，說(shuō)明此組分多糖分子間交聯(lián)非常緊密，彼此間相互作用較強(qiáng)。

圖8 暗褐脈柄牛肝菌多糖的掃描電子顯微鏡圖Fig.8 SEM images of PPP-0

2.10 α-葡萄糖苷酶抑制活性

通過(guò)α-葡萄糖苷酶抑制實(shí)驗(yàn)，測(cè)得暗褐脈柄牛肝菌子實(shí)體粗多糖抑制率曲線，相同情況下對(duì)比陽(yáng)性對(duì)照藥物阿卡波糖的抑制率曲線。由此可初步判定暗褐脈柄牛肝菌子實(shí)體粗多糖對(duì)α-葡萄糖苷酶具有一定的抑制作用。

為篩選出降血糖活性最好的純化多糖組分，將暗褐脈柄牛肝菌子實(shí)體粗多糖、PPP-0、PPP-1、PPP-2分別進(jìn)行酶抑制實(shí)驗(yàn)，抑制率曲線如圖9所示，當(dāng)多糖質(zhì)量濃度在0.25～2.5 mg/mL時(shí)，暗褐脈柄牛肝菌多糖的粗多糖、PPP-0、PPP-1、PPP-2均有一定的α-葡萄糖苷酶抑制活性，其中PPP-1與PPP-2抑制率與多糖質(zhì)量濃度呈正相關(guān)的量效關(guān)系，PPP-0抑制率與多糖質(zhì)量濃度量效關(guān)系不明顯，并且抑制率均低于陽(yáng)性對(duì)照藥品阿卡波糖。純化多糖組分中PPP-1與PPP-2在多糖質(zhì)量濃度為0.25～2.5 mg/mL的范圍內(nèi)呈現(xiàn)上升的趨勢(shì)，且隨著質(zhì)量濃度的增大，PPP-1對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制率從32.20%到57.15%，PPP-2對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制率從39.04%到70.55%。在同等多糖質(zhì)量濃度（1.0 mg/mL）下，不同的多糖組分對(duì)α-葡萄糖苷酶抑制率為PPP-2＞PPP-0＞粗多糖＞PPP-1；在同等多糖質(zhì)量濃度（2.0 mg/mL）下，不同的多糖組分對(duì)α-葡萄糖苷酶抑制率為PPP-2＞粗多糖＞PPP-0＞PPP-1，其中PPP-2的抑制活性遠(yuǎn)高于另外3 個(gè)組分。由于提取分離純化實(shí)驗(yàn)所得的多糖組分PPP-2含量最少，多糖組分PPP-0含量最大，所以最終選擇PPP-0組分進(jìn)行酶抑制動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)，探究其抑制機(jī)理及類(lèi)型。

圖9 暗褐脈柄牛肝菌子實(shí)體多糖抑制率曲線Fig.9 Inhibitory effects of polysaccharides from P.portentosus on α-glucosidase

2.11 α-葡萄糖苷酶抑制機(jī)理的確定

在測(cè)定酶活性體系中，如果有一定量的不可逆性抑制物質(zhì)存在時(shí)，會(huì)使酶的分子構(gòu)象發(fā)生永久性變化而失活，表現(xiàn)在其速率直線不經(jīng)過(guò)原點(diǎn)；如果有一定量的可逆性抑制物質(zhì)存在時(shí)，由于抑制劑的量恒定，所以可以得到一條經(jīng)過(guò)原點(diǎn)的速率直線。

通過(guò)酶標(biāo)儀在405 nm處測(cè)得各組的吸光度，代入PNP回歸方程，計(jì)算得到加入不同酶量后的反應(yīng)速率，以酶用量對(duì)應(yīng)反應(yīng)速率作圖，結(jié)果如圖10所示，得到不同質(zhì)量濃度的PPP-0對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制動(dòng)力學(xué)曲線，以此分析α-葡萄糖苷酶經(jīng)PPP-0多糖組分作用后剩余的酶活力與加入不同酶量之間的關(guān)系。α-葡萄糖苷酶經(jīng)過(guò)1 mg/mL PPP-0作用后，通過(guò)對(duì)數(shù)據(jù)分析，酶活力和酶添加量之間的關(guān)系是一條直線，方程為y＝0.017 4x-7×10-5，R2＝0.999 9；隨著PPP-0質(zhì)量濃度增加到2 mg/mL時(shí)，酶活力和酶添加量之間的關(guān)系是一條斜率減小的直線，方程為y＝0.016 9x-9×10-5，R2＝0.999 8。由于兩條曲線的縱截距很小，近似于0，所以可認(rèn)為其過(guò)原點(diǎn)，說(shuō)明PPP-0對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制為可逆作用。PPP-0和α-葡萄糖苷酶可逆性地結(jié)合，抑制了酶的活力，使其催化效率降低，而不是因?yàn)镻PP-0質(zhì)量濃度的增加，使酶分子構(gòu)象發(fā)生永久變化導(dǎo)致有效酶量的減少，以至于酶催化效率的下降。酶活力單位的定義為在37 ℃、pH 6.8的條件下1 min內(nèi)PNPG能轉(zhuǎn)化為1 μmol PNP的酶量。

圖10 PPP-0對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制動(dòng)力學(xué)曲線Fig.10 Inhibition of kinetic curves of α-glucosidase by PPP-0

2.12 α-葡萄糖苷酶抑制動(dòng)力學(xué)

以蒸餾水為空白對(duì)照，利用酶標(biāo)儀在405 nm處測(cè)定吸光度；以PNP的體積為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，作線性回歸方程，得到PNP回歸方程：y＝2.084x+0.010 8，R2＝0.999 7。在測(cè)定酶活性體系中，改變底物PNPG的濃度，加入濃度0.2 U/mL的α-葡萄糖苷酶溶液，測(cè)定不同濃度PPP-0對(duì)酶活力的影響，以未加酶液PPP-0組作對(duì)照。由Lineweaver-Burk法雙倒數(shù)作圖，即以1/[S]為橫坐標(biāo)（[S]表示底物濃度），1/[V]為縱坐標(biāo)（[V]表示酶促反應(yīng)速率），結(jié)果如圖11所示，可知PPP-0和無(wú)抑制的兩條直線相交于縱坐標(biāo)，存在抑制劑時(shí)，米氏常數(shù)Km值逐漸增大，最大反應(yīng)速率Vmax保持恒定，可推測(cè)出PPP-0組分對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制作用類(lèi)型是競(jìng)爭(zhēng)性抑制。

圖11 PPP-0對(duì)α-葡萄糖苷酶的Lineweaver-Burk圖Fig.11 Lineweaver-Burk plot for α-glucosidase inhibition by PPP-0

3 結(jié)論

4 種大孔樹(shù)脂（HP 2MGL、HP 20、SP 850、SP825）中，SP 825大孔樹(shù)脂脫色綜合效果最好，且對(duì)多糖溶液的脫色率為63.49%，醇沉得到粗多糖8.9 g（得率8.9%），且粗多糖中多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)為44.13%，蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)為51.4%。

通過(guò)DEAE-52纖維素和丙烯葡聚糖凝膠S-400HR柱色譜分離和純化得到暗褐脈柄牛肝菌多糖3 個(gè)組分：PPP-0、PPP-1、PPP-2，其中PPP-0含量最高且為均一成分，重均分子質(zhì)量為31 059 Da；單糖組成分析表明PPP-0是一種由半乳糖Gal、葡萄糖Glc、巖藻糖Fuc和甘露糖Man組成的雜多糖，其物質(zhì)的量占比依次為60.2%、22.8%、12.6%、4.4%。

通過(guò)紫外光譜分析得出所制備的多糖，可能為成分均一的糖蛋白復(fù)合體；紅外光譜與核磁共振波譜分析得出該多糖結(jié)構(gòu)中存在α型和β型吡喃糖；掃描電子顯微鏡顯示，所制備的暗褐脈柄牛肝菌多糖呈片狀卷曲。

粗多糖、PPP-0、PPP-1和PPP-2均可抑制α-葡萄糖苷酶活性，但抑制率均低于陽(yáng)性對(duì)照藥品阿卡波糖；測(cè)定酶活體系中，PPP-0組分對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制為可逆性抑制，即不會(huì)使酶的分子構(gòu)象發(fā)生永久性變化而失活；通過(guò)酶抑制動(dòng)力學(xué)分析，可知PPP-0對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制為競(jìng)爭(zhēng)性抑制。