彭美萍，郭思彤，藍(lán) 穎，劉曉霞，譚思濤

（廣西醫(yī)學(xué)科學(xué)院·廣西壯族自治區(qū)人民醫(yī)院，廣西 南寧 530021）

傳統(tǒng)中藥湯劑六君子湯源于《世醫(yī)得效方》，有益氣健脾、燥濕化痰之功效，主要用于脾胃不和、食欲不振，或反胃腹痛腹瀉、脾胃消化功能下降，即現(xiàn)代西醫(yī)理論中所說(shuō)的慢性胃炎、胃潰瘍、胃輕癱等胃腸道疾病。近年來(lái)，也有很多高質(zhì)量的多中心、雙盲、隨機(jī)試驗(yàn)證實(shí)了六君子湯有助于恢復(fù)脾胃功能，減輕消化不良癥狀，改善胃排空情況[1]。 但是關(guān)于六君子湯發(fā)揮療效的關(guān)鍵靶點(diǎn)與分子機(jī)制鮮有報(bào)道。與研究化學(xué)藥的藥理特征以單一成分對(duì)應(yīng)單一靶點(diǎn)相比，中藥具有多組分、多靶標(biāo)和多途徑協(xié)同作用的特點(diǎn)。如何闡釋清楚其物質(zhì)基礎(chǔ)及作用原理一直是中藥研究的一大難題，網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)可為中藥復(fù)方作用機(jī)制研究提供嶄新的思路與手段，這有助于揭示中藥復(fù)方的科學(xué)內(nèi)涵、發(fā)掘復(fù)雜中藥的有效成分、預(yù)測(cè)作用靶點(diǎn)和新的適應(yīng)證，為提升中醫(yī)藥創(chuàng)新研究和大數(shù)據(jù)挖掘提供理論支撐[2]。為此，本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，從六君子湯的物質(zhì)基礎(chǔ)出發(fā)，著眼于整體角度分析六君子湯治療胃輕癱的分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 六君子湯相關(guān)靶點(diǎn)篩選

利用中醫(yī)藥系統(tǒng)藥理學(xué)平臺(tái)（TCMSP 數(shù)據(jù)庫(kù)）[3]查找人參、半夏、白術(shù)、陳皮、茯苓、甘草六味中藥的化學(xué)組成成分，根據(jù)口服利用度（OB）≥30%且類(lèi)藥性（DL）≥0.18 這兩項(xiàng)藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)對(duì)活性化合物及其作用的蛋白質(zhì)靶點(diǎn)進(jìn)行初篩，結(jié)合化學(xué)專(zhuān)業(yè)數(shù)據(jù)庫(kù)[4],使用SwissADME（https://www.swissadme.ch）工具預(yù)測(cè)化合物的ADME（吸收、分布、代謝、排泄）性質(zhì)并進(jìn)行篩選，補(bǔ)充有效成分及其靶點(diǎn)，并參考相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道補(bǔ)充未預(yù)測(cè)到的活性化合物的已知靶點(diǎn)。匯總并刪除重復(fù)的靶點(diǎn)信息后，將化合物作用的蛋白質(zhì)靶點(diǎn)全部在Uniprot 蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)（https://www.uniprot.org）進(jìn)行規(guī)范。轉(zhuǎn)化為標(biāo)準(zhǔn)的蛋白靶點(diǎn)編號(hào)。

1.2 胃輕癱相關(guān)靶點(diǎn)篩選

以“Gastroparesis， Dysmotility，Esophageal Dysmotility，Gastric stasis，Gastrointestinal ulceration，Gastrointestinal Dysfunction，digestive disturbance” 作 為關(guān)鍵詞，收集OMIM 數(shù)據(jù)庫(kù)（https://www.omim.org）胃輕癱的潛在靶點(diǎn)信息。在DisGeNET數(shù)據(jù)庫(kù)（https://www.disgenet.org）中，選取與“Gastroparesis”聯(lián)系密切的相關(guān)疾病“Cyclical vomiting syndrome （disorder），Abnormality of the stomach，Abnormality of the gastric mucosa，Gastric ulcer，F(xiàn)unctional Gastrointestinal Disorders”。根據(jù)查詢(xún)結(jié)果進(jìn)行篩選，保留相關(guān)度較高的目標(biāo)靶點(diǎn)作為胃輕癱的潛在靶點(diǎn)，合并兩個(gè)疾病數(shù)據(jù)庫(kù)靶點(diǎn)后，刪除重復(fù)值得到該疾病靶點(diǎn)。

1.3 六君子湯成分-胃輕癱靶點(diǎn)的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用（PPI）網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

為明晰六君子湯藥物相關(guān)靶點(diǎn)與胃輕癱靶點(diǎn)間的關(guān)聯(lián)，利用Excel 提取二者有交集的靶點(diǎn)并通過(guò)韋恩圖的方式來(lái)表達(dá)。用交集靶點(diǎn)通過(guò)STRING11.0 數(shù)據(jù)庫(kù)（https://string-db.org）構(gòu)建PPI 網(wǎng)絡(luò)模型[5]，將生物種類(lèi)設(shè)定為“Homosapiens”，最小互相作用閾值設(shè)定為“highest confidence ”（大于0.9），除此之外均為默認(rèn)值，得到PPI網(wǎng)絡(luò)模型，通過(guò)CytoScape3.7.1 中的hubba 插件對(duì)PPI 網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行分析排序發(fā)現(xiàn)最佳的前20 個(gè)靶點(diǎn)，得到潛在的關(guān)鍵靶點(diǎn)基因，并通過(guò)分析其參與的生物學(xué)進(jìn)程對(duì)其功能進(jìn)行描述。

1.4 六君子湯成分-胃輕癱靶點(diǎn)功能與通路的富集分析

Metascape 平臺(tái)（https://metascape.org/gp/index.html）對(duì)基因擁有強(qiáng)大的分析功能，其覆蓋面也相當(dāng)廣泛，整合了GO、KEGG、UniProt 和DrugBank 等多個(gè)權(quán)威的數(shù)據(jù)資源，可靠性強(qiáng)，通過(guò)該平臺(tái)可以對(duì)提交數(shù)據(jù)進(jìn)行通路富集和生物過(guò)程注釋[6,7]。將六君子湯調(diào)節(jié)治療胃輕癱的靶點(diǎn)提交到Metascape 平臺(tái)進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，P值設(shè)置為小于0.01，除此之外均為默認(rèn)值，分析其主要的生物學(xué)過(guò)程與代謝通路并進(jìn)行富集分析。

2 結(jié)果

2.1 六君子湯活性成分靶點(diǎn)的獲取

初步提取的中藥化學(xué)成分結(jié)果如下：人參190 種、半夏116 種、白術(shù)55 種、陳皮63 種、茯苓34 種、甘草280 種，經(jīng)藥物ADME 篩選后共獲得白術(shù)7 種活性成分，陳皮5 種活性成分，茯苓15 種活性成分，甘草92 種活性成分，繼續(xù)篩選刪除無(wú)對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)成分。各成分初步提取的作用靶點(diǎn)結(jié)果如下：人參116 個(gè)、半夏97 個(gè)、陳皮66 個(gè)、茯苓23 個(gè)、甘草230 個(gè)，合并除去相同的數(shù)值后共得到靶點(diǎn)267個(gè)。六君子湯成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖的構(gòu)建，核心靶點(diǎn)的提取，主要產(chǎn)生藥效的活性成分的提取都可以通過(guò)CytoScape3.7.1 中的“NetworkAnalyzer”分析有效成分及靶點(diǎn)的網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋮?shù)得到并將結(jié)果可視化，見(jiàn)表1 與圖1。

圖1 六君子湯成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖

表1 六君子湯有效成分篩選結(jié)果

2.2 胃輕癱相關(guān)靶點(diǎn)的獲取

由OMIM 及DisGeNET 數(shù)據(jù)庫(kù)根據(jù)疾病相關(guān)性進(jìn)行篩選，分別獲得胃輕癱靶點(diǎn)1989、328 個(gè)。結(jié)合DRUGBANK 數(shù)據(jù)庫(kù)補(bǔ)充相關(guān)靶點(diǎn)，合并去除相同的數(shù)值，最終得到1902 個(gè)胃輕癱相關(guān)靶點(diǎn)。

2.3 六君子湯成分-胃輕癱靶點(diǎn)PPI 網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

將篩選的六君子湯活性成分靶點(diǎn)與胃輕癱靶點(diǎn)取交集，繪制韋恩圖，得到六君子湯成分-胃輕癱共同靶點(diǎn)68 個(gè)，見(jiàn)圖2。六君子湯靶點(diǎn)PPI 網(wǎng)絡(luò)可以通過(guò)STRING11.0 平臺(tái)構(gòu)建，見(jiàn)圖3。通過(guò)CytoScape3.7.1 中的hubba 插件對(duì)PPI 網(wǎng)絡(luò)進(jìn)一步分析得到潛在的關(guān)鍵靶點(diǎn)基因，見(jiàn)圖4。分析得出AKT1 在網(wǎng)絡(luò)中的連接度、節(jié)點(diǎn)介度 、緊密度分別為51、0.0552、0.7791，推測(cè)AKT1 為六君子湯治療胃輕癱的最主要靶點(diǎn)。TNF、

圖2 六君子湯成分-胃輕癱靶點(diǎn)韋恩圖

圖3 六君子湯-胃輕癱靶點(diǎn)PPI 網(wǎng)絡(luò)

圖4 六君子湯-胃輕癱靶點(diǎn)PPI 網(wǎng)絡(luò)中的Module

IL-6、IL-1β、VEGFA、MAPK3、PPARG、PTGS2、CASP3、MMP9 亦為相對(duì)重要的靶點(diǎn)。

由于PPI 網(wǎng)絡(luò)中蛋白與蛋白之間的關(guān)系是相互作用的，因此可視化結(jié)果多以無(wú)向圖表示。PPI 復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)中存在部分連線(xiàn)密度較高的模塊，其內(nèi)部網(wǎng)絡(luò)是PPI 網(wǎng)絡(luò)的核心子網(wǎng)，是潛在的具有生物學(xué)意義的集合[8]。因此，為更精確地分析六君子湯治療胃輕癱的作用機(jī)制，在得到六君子湯PPI 網(wǎng)絡(luò)后，要應(yīng)用Metascape 數(shù)據(jù)平臺(tái)中的MCODE 分析功能，通過(guò)分子復(fù)合物檢測(cè)算法對(duì)相互作用關(guān)系進(jìn)行分析聚類(lèi)（見(jiàn)圖4）。分別保留PPI 網(wǎng)絡(luò)與聚類(lèi)模塊中排名前三的生物學(xué)進(jìn)程對(duì)其進(jìn)行功能描述，見(jiàn)表2。

表2 聚類(lèi)模塊評(píng)分前3

2.4 靶點(diǎn)功能與通路的富集分析

把六君子湯治療胃輕癱相關(guān)靶點(diǎn)通過(guò)Metascape 數(shù)據(jù)平臺(tái)進(jìn)行信號(hào)通路分析，并對(duì)結(jié)果可視化，見(jiàn)圖5。由結(jié)果可見(jiàn)六君子湯主要參與的生物學(xué)過(guò)程（GO BP）包括對(duì)脂多糖的應(yīng)答、對(duì)細(xì)胞遷移的正調(diào)控、對(duì)無(wú)機(jī)物質(zhì)的反應(yīng)、對(duì)損傷的應(yīng)答、凋亡信號(hào)通路。參與的通路（KEGG）主要有糖尿病并發(fā)癥中的AGE-RAGE 信號(hào)通路、流體剪切應(yīng)力與動(dòng)脈粥樣硬化、VEGF 信號(hào)通路、TNF 信號(hào)通路、麻疹等。相關(guān)靶點(diǎn)治療胃輕癱的功能（GO MF）主要富集于細(xì)胞因子活性、血紅素結(jié)合、蛋白質(zhì)同源二聚化活性、蛋白酶結(jié)合、磷酸酶結(jié)合等，以及細(xì)胞組分（GO CC）的富集，見(jiàn)圖6。

圖5 靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)

圖6 六君子湯主要成分潛在靶點(diǎn)的富集分析

3 討論

在對(duì)六君子湯治療胃輕癱作用機(jī)制的網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究中對(duì)“成分-成分靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)”“胃輕癱相關(guān)蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)”“成分-胃輕癱靶點(diǎn)蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)”進(jìn)行綜合分析得到，六君子湯治療胃輕癱的10 個(gè)潛在核心靶點(diǎn)AKT1、TNF、IL-6、IL-1β、VEGFA、MAPK3、PPARG、PTGS2、CASP3、MMP9。

AKT1 即蛋白激酶B，可通過(guò)一系列下游底物的絲氨酸或蘇氨酸磷酸化的介導(dǎo)參與調(diào)控細(xì)胞的代謝、增殖、細(xì)胞存活、生長(zhǎng)和血管生成等各種進(jìn)程。AKT 調(diào)控的通路是人類(lèi)癌癥中最常見(jiàn)的激活信號(hào)通路。一半以上的人類(lèi)腫瘤含有過(guò)度活化的AKT[9-10]。VEGFA 即血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子A，是調(diào)節(jié)脂肪組織中血管生成的關(guān)鍵因子。VEGFA 可誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞增殖，促進(jìn)細(xì)胞遷移，抑制細(xì)胞凋亡，誘導(dǎo)血管通透性的改變[11]，也會(huì)造成血管系統(tǒng)功能紊亂，生成高密度和高通透性的微血管促進(jìn)腫瘤擴(kuò)張。腫瘤組織血管生成主要依賴(lài)于VEGFA 的應(yīng)答。

KEGG 通路富集分析顯示，六君子湯治療胃輕癱所調(diào)控的核心靶點(diǎn)主要參與AGE-RAGE 信號(hào)通路、VEGF信號(hào)通路、流體剪切應(yīng)力與動(dòng)脈粥樣硬化。GO 富集分析顯示，六君子湯所調(diào)控的核心靶點(diǎn)顯著富集對(duì)脂多糖的應(yīng)答、對(duì)細(xì)胞遷移的正調(diào)控、對(duì)無(wú)機(jī)物的應(yīng)答等生物過(guò)程。通過(guò)對(duì)關(guān)鍵通路及靶點(diǎn)的綜合分析，發(fā)現(xiàn)PI3KAKT 通路作為子網(wǎng)絡(luò)在上述多個(gè)關(guān)鍵通路中都有很高的參與度，該途徑是AKT 激活的關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)。PI3K-AKT 信號(hào)通路被不同種類(lèi)的細(xì)胞刺激或遭遇毒性損傷而激活，參與調(diào)節(jié)細(xì)胞促進(jìn)生長(zhǎng)和分裂，創(chuàng)建代謝反應(yīng)、輔助繁殖等基本功能[12]。當(dāng)酪氨酸激酶（RTK）或G 蛋白偶聯(lián)受體（GPCR）與生長(zhǎng)因子結(jié)合，會(huì)分別激活PI3K 的兩個(gè)異源二聚體，催化細(xì)胞膜上PIP2 轉(zhuǎn)化為PIP3，生成物PIP3 又成為下游通路的第二信使幫助激活A(yù)KT，進(jìn)而通過(guò)磷酸化下游底物參與凋亡、蛋白質(zhì)合成、代謝和細(xì)胞周期來(lái)控制關(guān)鍵的細(xì)胞過(guò)程[13]。而且該通路為關(guān)鍵通路AGE-RAGE 信號(hào)通路的下游，通過(guò)PI3K-AKT 通路調(diào)節(jié)NF-κB 的表達(dá)可以對(duì)TNF、IL-6、IL-1β 等炎癥因子產(chǎn)生雙向調(diào)節(jié)的作用。

通過(guò)復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)分析藥理特性的研究對(duì)于準(zhǔn)確識(shí)別中藥成分的復(fù)雜機(jī)制具有重要意義。KEGG 通路富集分析表明靶點(diǎn)PTGS2 參與如花生四烯酸、TNF、NF-κB 和VEGF信號(hào)通路等炎癥途徑。PTGS2作為一種炎癥介質(zhì)，是一種限速酶，可催化花生四烯酸產(chǎn)生前列腺素，發(fā)揮促炎癥作用并破壞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)，從而促進(jìn)白細(xì)胞分泌并加重炎癥反應(yīng)[14]。許多炎癥性疾病的發(fā)病機(jī)制與花生四烯酸代謝途徑相關(guān)。PTGS2 是前列腺素的誘導(dǎo)酶，不僅參與炎癥反應(yīng)前列腺素的生物合成，而且是該途徑的關(guān)鍵酶，這可以作為后續(xù)驗(yàn)證PTGS2 作為關(guān)鍵蛋白的有力基礎(chǔ)。

研究結(jié)果表明六君子湯作為一個(gè)復(fù)方中藥制劑含有多種有效成分可以通過(guò)多個(gè)靶點(diǎn)干預(yù)疾病的進(jìn)程，而同一靶點(diǎn)可在不同的生物學(xué)過(guò)程及信號(hào)通路發(fā)揮作用，體現(xiàn)了六君子湯多通路、多靶點(diǎn)聯(lián)合作用的復(fù)雜性。本文借助網(wǎng)絡(luò)藥理思維，構(gòu)建六君子湯的“組分-靶點(diǎn)-疾病途徑”關(guān)聯(lián)網(wǎng)絡(luò)并預(yù)測(cè)其潛在的作用機(jī)制。使六君子湯治療胃輕癱更好地應(yīng)用于臨床，為后續(xù)評(píng)價(jià)六君子湯臨床療效指標(biāo)的挖掘提供了重要線(xiàn)索，也為深入研究六君子湯可能存在的作用機(jī)制提供了新的思路和技術(shù)手段。但由于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法僅僅是單純的數(shù)據(jù)分析，有自身的局限性，加上中藥復(fù)方制劑成分較多，在熬制時(shí)可能會(huì)產(chǎn)生復(fù)雜的化學(xué)反應(yīng)，所以熬制后六君子湯的化學(xué)成分變化以及活性成分在體內(nèi)的代謝物并不在本次研究分析范圍內(nèi)。本研究主要利用數(shù)據(jù)庫(kù)提取數(shù)據(jù)分析，結(jié)合生物信息學(xué)，對(duì)六君子湯做了初步的功能和調(diào)控作用的注釋和預(yù)測(cè)，后續(xù)將在此數(shù)據(jù)挖掘的基礎(chǔ)上進(jìn)一步對(duì)六君子湯的有效活性成分進(jìn)行更深入的篩選與通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證，從而進(jìn)一步明晰六君子湯的主要調(diào)控靶點(diǎn)。