洪文文 張若梅 譚善忠

細胞焦亡是一種相對新型的非凋亡性細胞程序性死亡方式,屬于機體免疫形式之一。近些年來,細胞焦亡相繼被發(fā)現(xiàn)參與多種疾病的發(fā)生、發(fā)展。代謝相關(guān)脂肪性肝病(metabolic associated fatty liver disease,MAFLD)因其高發(fā)病率目前已成為全球醫(yī)療系統(tǒng)巨大負擔,亟待開發(fā)出特效藥物。多項研究證實,細胞焦亡在MAFLD的進展過程中扮演重要角色,可多層面、多環(huán)節(jié)推動MAFLD進程。本文就細胞焦亡在MAFLD發(fā)展中的作用及目前治療機制研究現(xiàn)狀進行綜述。

一、細胞焦亡

細胞焦亡(pyroptosis),又稱細胞炎性壞死,是一種由Gasdermin(GSDM)家族介導的程序性細胞死亡。特定的含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(cysteinyl aspartate specific proteinase,Caspase)家族成員在被特異性炎癥小體激發(fā)后,對GSDMD進行切割,使其釋放出 GSDMD-N結(jié)構(gòu)域,該結(jié)構(gòu)域隨后與細胞膜膜脂結(jié)合,形成膜孔,最終導致細胞脹大破裂死亡。細胞焦亡屬于先天性免疫的一種,焦亡的過程是通過細胞的自我裂解,實現(xiàn)清除炎癥的目的。細胞焦亡形態(tài)特征包括離子內(nèi)流、細胞腫脹、膜孔形成、線粒體去極化、膜破裂等,且在過程中釋放白細胞介素(IL)-1b、IL-18等胞質(zhì)內(nèi)容物[1]。然而,過度激活的焦亡可引發(fā)/加重組織病理性炎癥。近年來多項研究已證實,細胞焦亡廣泛參與臨床各種感染性疾病、神經(jīng)系統(tǒng)疾病、心血管疾病、免疫系統(tǒng)疾病等[2-4]。

二、MAFLD

MAFLD舊稱非酒精性脂肪性肝病(NAFLD),是指以肝細胞內(nèi)脂質(zhì)過量沉積為主要特征,同時合并肥胖或代謝功能障礙的一組慢性肝病綜合征。MAFLD的定義更新于2020年,由來自22個國家的國際專家小組提議并就診斷標準達成共識[5]。MAFLD患病率在全球范圍內(nèi)激增。2017—2018年美國MAFLD的患病率為39.1%,其中約7.4%的MAFLD患者患有晚期肝纖維化[6]。肝纖維化程度是MAFLD患者重要的預后因素,MAFLD患者的全因病死率及肝臟相關(guān)病死率均與纖維化分期呈正相關(guān)[7]。同時,MAFLD患者群體具有更高的糖尿病、心血管疾病風險[8]。在MAFLD的管理方面,亞太肝病研究協(xié)會仍首推優(yōu)化生活方式,包括減重、優(yōu)化飲食結(jié)構(gòu)、運動干預等[9]。截至目前,尚無由FDA批準的關(guān)于MAFLD的特定治療藥物[10]。在對MAFLD病機研究中發(fā)現(xiàn),細胞焦亡在“單純性脂肪肝—非酒精性脂肪性肝炎(NASH)—肝硬化”發(fā)展過程中扮演不容忽視的角色[11]。

三、細胞焦亡與MAFLD進展的相關(guān)性

(一) MAFLD發(fā)病及進展的病理機制 MAFLD分為良性的單純非酒精性脂肪肝(NAFL)和NASH。后者是在前者肝臟5%以上肝細胞存在脂肪變性的基礎(chǔ)上,出現(xiàn)不同程度的肝小葉炎癥及肝纖維化。傳統(tǒng)理念中MAFLD病理進展路徑為“NASH—肝纖維化—肝硬化—肝癌”。主流的致病機制仍遵循“三次打擊”學說:①肝細胞內(nèi)脂質(zhì)沉積;②脂肪酸介導脂毒性物質(zhì)生成誘發(fā)肝細胞死亡;③肝內(nèi)外炎癥發(fā)生及肝纖維化形成。病理過程涉及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激、線粒體功能障礙、肝小葉及門靜脈炎癥、肝細胞程序性死亡/壞死、肝細胞外基質(zhì)積累等[12]。

代謝底物(主要是單糖葡萄糖、果糖)超負荷是脂肪肝發(fā)病的病理基礎(chǔ)。過量的底物轉(zhuǎn)化為過量的游離脂肪酸,肝細胞內(nèi)脂肪酸一部分經(jīng)線粒體氧化,一部分再酯化成為甘油三酯輸送至血液或再次回到肝臟游離脂肪酸池。當脂肪酸底物過載和(或)代謝途徑受損時,可刺激產(chǎn)生二酰基甘油、神經(jīng)酰胺、溶血磷脂酰膽堿等脂毒性物質(zhì),導致以內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激、線粒體功能障礙為主的細胞器功能衰竭,誘發(fā)肝細胞氧化應(yīng)激,同時活化炎癥小體,共同導致肝細胞死亡。同時,細胞內(nèi)脂質(zhì)沉積可誘發(fā)胰島素抵抗,導致機體整體代謝環(huán)境惡化,加重肝臟損傷,并誘導肝外代謝性疾病、心腦血管疾病的發(fā)生、發(fā)展。

近些年有關(guān)MAFLD發(fā)病機制的研究呈井噴式增長,結(jié)果均證明MAFLD的致病、進展受多因素驅(qū)動。除了公認的環(huán)境危險因素(包括飲食、運動習慣等)、遺傳因素外,肝臟與其他器官(脂肪組織、腸道菌群)之間的相互作用也是導致MAFLD進展個體異質(zhì)性的重要原因[13, 14]。關(guān)于肝纖維化的進展,盡管此前有項基于肝臟穿刺活檢開展的研究,結(jié)果指向NAFL、NASH群體表現(xiàn)出纖維化進展的患者數(shù)量比例沒有顯著差異,但NASH患者的纖維化進展速度顯然較NAFL患者更快[15, 16]。NASH的演變和進展是受眾多因素影響的復雜事件,它最終導致了肝星狀細胞(HSC)的活化,造成細胞外基質(zhì)的過度合成、沉積[17]。NASH與肝硬化和肝細胞癌發(fā)生的高風險有關(guān),炎癥無疑是促進肝纖維化發(fā)生的重要因素[18]。

(二)細胞焦亡參與并促進肝臟炎癥及肝纖維化 細胞焦亡屬于機體免疫方式之一,細胞裂解的初衷旨在緩解病原體導致的炎癥。GSDMD是焦亡的執(zhí)行者,目前研究發(fā)現(xiàn)能夠切割GSDM蛋白引發(fā)細胞焦亡的含半胱氨酸的Caspase家族成員包括Caspase-1、Caspase-4、Caspase-5,以及小鼠同源蛋白Caspase-11。根據(jù)切割GSDMD蛋白的上游蛋白不同,可將細胞焦亡發(fā)生通路分為以下兩種途徑。①Caspase-1依賴途徑:在病原體、細菌等信號的刺激下,細胞內(nèi)的炎癥小體識別信號,Pro-Caspase-1與銜接蛋白ASC結(jié)合,激活Caspase-1,活化的Caspase-1一方面切割GSDMD,形成GSDMD氮端和碳端,GSDMD-N和細胞膜上的磷脂蛋白結(jié)合形成孔洞,釋放內(nèi)容物,誘導焦亡發(fā)生;同時活化的Caspase-1對pro-IL-1β、pro-IL-18進行切割,形成IL-1β和IL-18,并釋放到胞外,造成炎癥反應(yīng)。②Caspase-4/Caspase-5、Caspase-11(鼠)依賴途徑:炎性刺激因子沒有通過受體直接進入細胞質(zhì)內(nèi),Caspase-4/Caspase-5、Caspase-11(鼠)被活化,對GSDMD 進行切割,誘導焦亡發(fā)生;同時,Caspase-4/Caspase-5、Caspase-11誘導Caspase-1活化,對IL-1β和IL-18的前體進行切割、釋放,造成細胞外炎癥反應(yīng)[19, 20]。

多項研究表明,在NASH患者及NASH實驗動物模型中,與細胞焦亡相關(guān)的通路蛋白表達、炎癥因子高于正常水平。Caspase-1在患者的肝臟和血清中增加,且上升水平與NASH的嚴重程度和纖維化階段相關(guān)[21]。另一項研究發(fā)現(xiàn),與健康肝組織相比,MAFLD/NASH患者肝臟中GSDMD和GSDMD-N蛋白水平升高。同時,與MAFLD患者相比,NASH患者的GSDMD-N水平顯著升高,且與纖維化和MAFLD活動評分呈正相關(guān)[22]。在實驗動物模型中研究發(fā)現(xiàn),野生Caspase-11基因缺乏小鼠體內(nèi)GSDMD、Caspase-1和成熟IL-1β的蛋白質(zhì)水平亦降低,伴隨MCS飲食誘導的小鼠肝臟脂肪性變、肝內(nèi)外炎癥和肝纖維化程度的降低;證實了Caspase-11介導的肝細胞焦亡亦促進 NASH 的進展,且Caspase-11的過度表達可能導致了NASH小鼠更嚴重的肝臟病變[23]。細胞焦亡參與并促進肝臟炎癥及纖維化這一事實是明確的,鑒于MAFLD具有復雜的發(fā)病機制,焦亡對MAFLD的影響也相繼在多個、不同的病理環(huán)節(jié)被發(fā)現(xiàn)。

細胞焦亡直接參與肝臟炎癥及后續(xù)的肝纖維化:細胞焦亡發(fā)生的兩個通路,尤其是Caspase-1介導的經(jīng)典通路,依賴不同炎癥小體的介導。焦亡的底物均是GSDMD-N結(jié)構(gòu)域。來自空軍軍醫(yī)大學的徐冰團隊,通過對臨床45名招募者肝組織檢測并對比,結(jié)果證實GSDMD-N蛋白水平在NAFLD/NASH患者肝組織中上調(diào),且GSDMD-N蛋白水平與肝小葉炎癥及肝細胞氣球樣變程度呈正相關(guān)。該團隊還通過動物實驗證實,在同樣MCD飲食誘導下,GSDMD基因缺乏小鼠肝臟炎癥細胞浸潤均較野生小鼠明顯減輕。GSDMD可促進IL-1β、TNF-α、MCP-1分泌,持續(xù)激活Nf-κB 信號通路引發(fā)炎癥及巨噬細胞募集。同時該研究還發(fā)現(xiàn)在MCD誘導的脂肪性肝炎中,GSDMD促進肝營養(yǎng)性纖維化進展[22]。

目前研究發(fā)現(xiàn)的可介導細胞焦亡的幾種炎癥小體有NLRP1、NLRP3、NLRC4、AIM2、Pyrin等[24]。GAUL S等證明了原代小鼠和人肝細胞在NLRP3炎癥小體激活后發(fā)生細胞焦亡,并釋放NLRP3炎癥小體蛋白。肝星狀細胞吞噬細胞外NLRP3炎癥小體顆粒后,在分泌IL-1β的同時,誘發(fā)α-平滑肌肌動蛋白表達,直接導致肝損傷和纖維化的發(fā)生[21]。高脂飲食誘導的NAFLD小鼠肝臟中AIM2炎性體相關(guān)蛋白質(zhì)水平,以及血清中IL-1β和IL-18水平升高,而抑制AIM2炎性小體激活可抑制NAFLD小鼠肝細胞焦亡、緩解肝臟炎癥[25]。Eun Hee Koh等證實游離膽固醇可誘導肝細胞中SMS1表達,敲除Sms1后,高脂飲食誘導的脂肪肝小鼠肝細胞上清液中乳酸脫氫酶、GSDMD-N含量均降低。具體機制推測為由SMS1活化蛋白激酶Cδ(PKCδ)和NLR家族CARD結(jié)構(gòu)域蛋白4(NLRC4)炎性小體產(chǎn)生的二?；视?DAG),誘導了肝細胞焦亡,加重肝臟炎癥[26]。一項體外細胞培養(yǎng)實驗發(fā)現(xiàn),TNF-α的增加促進了NLRC4炎癥小體的激活,繼而增加IL-18和IL-1β的產(chǎn)生,促進非酒精性脂肪性肝病的炎癥反應(yīng)[27]。膜聯(lián)蛋白A2(ANXA2)通過經(jīng)典Caspase-1通路誘導焦亡,加重NASH小鼠的肝臟炎癥及肝纖維化[28]。

細胞焦亡可通過影響機體代謝環(huán)境間接影響MAFLD進程:胰島素抵抗(insulin resistance,IR)是MAFLD發(fā)病核心病理機制之一,也是引發(fā)肝外代謝性疾病的主要原因。胰腺組織的細胞焦亡與糖尿病的發(fā)生聯(lián)系密切,發(fā)生于胰腺外的細胞焦亡也可通過提高脂肪組織、骨骼肌、血清等焦亡相關(guān)分子的表達,間接誘發(fā)胰島素抵抗。有研究發(fā)現(xiàn),通過高脂飲食喂養(yǎng)誘導的肥胖小鼠脂肪組織中Caspase-1、ASC、NLRP3、IL-1β、GSDMD的mRNA表達水平增加,脂肪組織的胰島素敏感性降低,同時體外細胞實驗證實胰島素抵抗的發(fā)生與NLRP3激發(fā)的脂肪組織細胞焦亡相關(guān)[29]。IL-1β可刺激免疫細胞增殖,造成胰島吞噬細胞浸潤,損傷胰島功能[30]。機制研究發(fā)現(xiàn)IL-1β可能通過減少胰島素受體底物-1(IRS-1)的酪氨酸磷酸化,負調(diào)節(jié)IRS-1基因表達,直接抑制胰島素信號通路,誘導胰島素抵抗[31]。對2型糖尿病患者使用IL-1β受體拮抗劑可其血糖水平和胰島分泌功能[32]。NLRP3炎癥小體激活I(lǐng)L-1β途徑是誘發(fā)IR的重要機制之一[33]。

IL-18的生理作用受細胞因子和免疫環(huán)境的共同影響。NLRP-1炎癥小體刺激狀態(tài)下產(chǎn)生的IL-18可通過影響脂肪分解和胰島素敏感性對機體代謝產(chǎn)生正面調(diào)控作用[34]。然而,同樣有研究發(fā)現(xiàn)糖尿病患者IL-18循環(huán)水平升高,這種病理狀態(tài)下IL-18主要是NLRP3激活的產(chǎn)物[35, 36]。故細胞焦亡過程中的NLRP3/IL-18軸可能是胰島素抵抗發(fā)生的促進因素之一。

細胞焦亡可能加重肝細胞脂肪變性:肝細胞脂肪變性是MAFLD發(fā)病機制中第一次打擊及病理基礎(chǔ)。海軍軍醫(yī)大學的徐冰團隊同樣發(fā)現(xiàn),GSDMD缺乏小鼠成脂基因Srebp1c(Srebf1)的表達減少,脂解基因,包括Pparα、Aco (Klk15)、Lcad(Acadl)、Cyp4a10、Cyp4a14的表達上調(diào),使GSDMD缺乏表現(xiàn)出較低的脂肪變性[22]。推測肝細胞焦亡可能加重肝細胞脂肪變性,具體機制尚不明確。

四、治療機制探索

細胞焦亡參與MAFLD病程進展目前已明確,故細胞焦亡可作為我們延緩MAFLD進展的治療措施之一。已有許多動物實驗研究證實可通過干預細胞焦亡途徑治療脂肪肝。干預措施包括降糖藥物、植物來源化合物、中藥復方制劑等[37-40]。研究靶點以由NLRP3介導的炎癥通道為主。

NLRP3炎癥小體是誘導細胞焦亡的重要介質(zhì)之一。近期的一篇綜述總結(jié)了包括31種植物來源活性成分(包括萜類、黃酮、生物堿和酚類等),通過NLRP3炎性小體途徑調(diào)控細胞焦亡,從而減輕非酒精性脂肪肝模型脂質(zhì)沉積及肝臟炎癥程度[38]。而影響NLRP3炎性小體的上游信號各有不同。線粒體衍生的活性氧是激活NLRP3炎性小體的重要信號之一,研究發(fā)現(xiàn)利拉魯肽可通過誘導肝細胞線粒體自噬,抑制部分NLRP3炎性小體的激活,減少肝細胞焦亡[37]。一項動物實驗表明芒果苷可通過調(diào)控AMPK信號通路,抑制NLRP3炎癥小體活化,減輕小鼠肝細胞焦亡;實驗組用體外實驗證實除緩解肝損傷外,芒果苷同時還可促進細胞內(nèi)葡萄糖消耗,減輕胰島素抵抗[41]。黃芩苷能夠通過調(diào)節(jié)NRF2 / HO-1 / NRLP3途徑減輕NASH小鼠肝細胞焦亡[42, 43]。一種來源于牛樟芝的三萜類化合物(Antcin A),可通過NLRP3炎性小體途徑抑制肝巨噬細胞的焦亡[44]。紫衫葉素可通過抑制P2X7R(介導微生物進入細胞從而激活NLRP3的受體之一)表達,抑制脂肪肝小鼠肝細胞Caspase-1依賴經(jīng)典途徑細胞焦亡[45]。經(jīng)典化合物小檗堿,可能通過 ROS/TXNIP 軸抑制NLRP3炎癥小體活化來實現(xiàn)延緩NASH的進展[46]。中藥復方“丹參澤瀉湯”可能通過上調(diào)Nrf2水平,抑制ROS / NLRP3/ IL-1β軸系列信號表達,抑制肝細胞焦亡,緩解非酒精性脂肪肝大鼠肝臟炎癥[47]。梔子苷可能通過CTCF/DPP4信號通路抑制Caspase-1介導的肝細胞焦亡[48]。Dieckol,來源于韓國的海帶提取物,被證實可減少高脂飲食飼養(yǎng)小鼠肝臟中的NLRP3炎癥小體表達,減輕肝細胞焦亡,同時抑制肝臟脂肪生成并增加脂肪分解,但后者脂肪代謝的調(diào)控是否與細胞焦亡存在因果關(guān)系,此課題未作研究[49]。此外,雌激素受體α、維生素D均被證實可通過靶向NLRP3-GSDMD軸介導的肝細胞焦亡來干預MAFLD[50, 51]。

除以NLRP3炎性小體為核心的通路外,其他許多通路也可作為潛在干預靶點。藍莓的主要單體之一TEC,可通過上調(diào)tRF-47表達,激活NASH模型小鼠肝細胞自噬,從而抑制焦亡發(fā)生、減少炎癥介質(zhì)釋放[52]。梔子苷的產(chǎn)物京尼平,可通過下調(diào)解偶聯(lián)蛋白-2表達,抑制游離脂肪酸誘導的肝細胞焦亡[53]。用中藥復方降脂理肝湯干預高脂飲食誘導的脂肪肝大鼠模型,結(jié)果顯示與細胞焦亡發(fā)生相關(guān)的NLRP3、Caspase-1、脂多糖、Caspase-11表達水平均下降,推測其調(diào)控機制同時包括了經(jīng)典通路和非經(jīng)典通路[54]。

五、總結(jié)討論

細胞焦亡這種較新型的細胞死亡方式,從被發(fā)現(xiàn)、被定義至今并時間不長,故迄今已開展的研究數(shù)量有限。在研究深度上,單純細胞焦亡的發(fā)生機制較清晰,已明確數(shù)個關(guān)鍵靶點(如NLRP3炎癥小體、AIM2、Caspase-1、Caspase-11、GSDMD等)。MAFLD屬于代謝性疾病,發(fā)病機制復雜,涉及多個臟器、多個病理環(huán)節(jié),且不同的病程表現(xiàn)不同,還具有明顯的個體差異性。細胞焦亡參與并促進MAFLD進展是明確的,不僅表現(xiàn)出直接促炎、促纖維化作用,還可對機體代謝環(huán)境產(chǎn)生負面影響而加速病程進展,另外或可通過加劇肝細胞脂肪變性途徑。治療方面,因NLRP3炎癥小體對細胞焦亡的發(fā)生舉足輕重,目前研究大都圍繞其開展。NLRP3的激活亦受多因素影響,前文研究囊括了活性氧、AMPK、NRF2、P2X7R、CTCF/DPP4等介導通路,更多的上游信號通道等待被挖掘。此外,tRF-47、解偶聯(lián)蛋白-2也可作為干預細胞焦亡的潛在靶點。

因肝臟與腸道在生理、病理上關(guān)系密切,腸道環(huán)境可影響肝臟細胞代謝。在Caspase-11依賴的非經(jīng)典通路介導的細胞焦亡發(fā)生過程中,腸道來源LPS扮演重要角色?！皬哪c治肝”由來已久,而通過干預腸道菌群來抑制肝臟的細胞焦亡是新的內(nèi)容之一,可進一步深入研究。此外,細胞焦亡過程釋放的炎癥介質(zhì)(IL-1β、IL-18),對機體發(fā)生胰島素抵抗有促進作用,正如MAFLD代謝性疾病的特點,治療上除了著眼于發(fā)生在肝臟的細胞焦亡,還應(yīng)考慮到肝外相關(guān)臟器。降糖藥物(如利拉魯肽、艾賽那肽)之所以被寄予厚望,也與它們治療范圍波及整體代謝環(huán)境有關(guān)?？傊?細胞焦亡作為促進MAFLD進展的重要病理機制之一,有望成為干預MAFLD的重要切點。在遴選關(guān)鍵靶點、開發(fā)行效安全的抑制劑之前,研究者們?nèi)郧奥仿?/p>

利益沖突聲明：所有作者均聲明不存在利益沖突。