黎婉瑩 申笙 劉詩 孫劍

慢性乙型肝炎(chronic hepatitis B, CHB)是由乙型肝炎病毒(hepatitis B virus, HBV)感染后引起的慢性肝臟疾病。據(jù)估計,全球約有2.96億的慢性HBV感染者,占總?cè)丝诘?.8%[1]。而我國是HBV感染的中高流行地區(qū),現(xiàn)有慢性HBV感染者7500萬例,占全球慢性HBV感染者人數(shù)的1/3[2, 3]。近年來,血清HBV RNA作為CHB的新型病毒學(xué)標志物備受關(guān)注,我國的《慢性乙型肝炎防治指南(2022 年版)》以及歐洲肝病學(xué)會2017年的指南均提出血清HBV RNA在臨床上應(yīng)用于預(yù)測停藥后復(fù)發(fā)的可能性[4, 5],2022年我國發(fā)表的血清HBV RNA專家共識也總結(jié)了目前血清HBV RNA在臨床應(yīng)用中的進展[6]。然而,在血清HBV RNA廣泛應(yīng)用于臨床實踐之前,仍有一些關(guān)于血清HBV RNA的關(guān)鍵問題亟待解決,本文梳理出三個方面的關(guān)鍵科學(xué)問題:(1)缺乏標準化、經(jīng)多方驗證并被廣泛認可的血清HBV RNA檢測方法;(2)血清HBV RNA可較好地反映肝內(nèi)共價閉合環(huán)狀DNA(covalently closed circular DNA,cccDNA)遺傳組成,但在反映cccDNA拷貝數(shù)和轉(zhuǎn)錄活性方面仍有局限性;(3)HBV 前基因組RNA(pregenome RNA,pgRNA)與HCC相關(guān)性已得到初步證實,但其是否驅(qū)動HCC的發(fā)生、發(fā)展仍未明確。

一、關(guān)鍵問題一:缺乏標準化、經(jīng)多方驗證并被廣泛認可的血清HBV RNA檢測方法

血清HBV RNA目前缺乏統(tǒng)一標準化的檢測方法,主要有以下原因:第一,血清HBV RNA的種類較為復(fù)雜,研究表明其主要為pgRNA,包括全長的pgRNA、內(nèi)含子缺失的剪接型pgRNA以及3’截斷型的pgRNA,此外還有少量HBx相關(guān)轉(zhuǎn)錄本等[7, 8]。當前難以建立一種可以覆蓋所有種類的HBV RNA定量方法,而且尚不清楚不同種類的血清HBV RNA的臨床應(yīng)用價值是否一致。第二,不同實驗室采用的實驗方法不同,包括核酸提取方法、引物和探針位置的設(shè)計以及定量技術(shù)等,導(dǎo)致不同平臺建立的方法檢測的血清HBV RNA種類、檢測性能、檢測結(jié)果等不盡一致。國內(nèi)外不同平臺所建立的血清HBV RNA定量檢測方法主要有基于cDNA末端快速克隆的PCR法(rapid amplification of cDNA ends PCR,RACE-PCR)、逆轉(zhuǎn)錄-實時熒光定量PCR法(reverse transcription real-time fluorescent quantitative PCR,RT-qPCR)、微滴數(shù)字PCR法(droplet digital PCR,ddPCR)和RNA實時熒光恒溫擴增檢測技術(shù)等多種方法[9-12]。第三,目前尚缺乏血清HBV RNA國際標準品,使得國內(nèi)外所建立的血清HBV RNA定量方法無法進行直接比較和均一化。我們團隊前期研究表明,不同檢測方法,定量的血清HBV RNA水平不盡一致,而且不同方法定量結(jié)果之間的差異在不同人群中也不盡相同[13]。盡管不同方法定量的結(jié)果對抗病毒治療后乙型肝炎e抗原(hepatitis B e antigen,HBeAg)血清學(xué)轉(zhuǎn)換的預(yù)測效能相當,但最佳截斷值卻是不同的,且不同方法對核苷(酸)類似物[nucleos(t)ide analogues,NAs]停藥后復(fù)發(fā)的預(yù)測效能也不盡一致,說明了在臨床實踐中,在未出現(xiàn)標準統(tǒng)一的血清HBV RNA定量檢測方法或國際標準品之前,難以規(guī)范不同檢測方法在指導(dǎo)CHB 臨床診療中的應(yīng)用條件。

因此,為了推動血清HBV RNA在臨床上的應(yīng)用,未來的策略是建立一個檢測性能和臨床應(yīng)用效能優(yōu)異且穩(wěn)定、易于推廣應(yīng)用的血清HBV RNA定量方法。該方法應(yīng)經(jīng)過國內(nèi)外不同的大型前瞻性臨床隊列進行多方驗證,并廣泛認可其臨床應(yīng)用效能,如穩(wěn)定有效地預(yù)測抗病毒治療應(yīng)答、NAs停藥后復(fù)發(fā)和預(yù)測肝細胞癌發(fā)生、發(fā)展等。只有定量的結(jié)果具有穩(wěn)定的臨床應(yīng)用價值,才是當前臨床上亟需的血清HBV RNA定量方法,并且可以基于此方法,對其他平臺所建立的方法進行標準化,從而推動血清HBV RNA在臨床上的廣泛應(yīng)用,進一步優(yōu)化CHB臨床診療與管理策略。

二、關(guān)鍵問題二:血清HBV RNA可較好地反映cccDNA遺傳組成,但在反映cccDNA拷貝數(shù)和轉(zhuǎn)錄活性方面仍有局限性

檢測肝內(nèi)cccDNA的數(shù)量和轉(zhuǎn)錄活性可準確反映CHB患者機體內(nèi)病毒活性和評估藥物的抗病毒效果,但cccDNA的檢測需要進行有創(chuàng)的肝活檢,極大地阻礙了其在臨床上的應(yīng)用。因此,亟需尋找可有效反映肝內(nèi)cccDNA狀態(tài)的無創(chuàng)標志物。HBV病毒顆粒感染肝細胞后,部分雙鏈環(huán)狀DNA(relaxed circular DNA,rcDNA)在肝細胞核內(nèi)修復(fù)形成cccDNA。cccDNA作為原始模板可以轉(zhuǎn)錄成不同類型的HBV RNA,其中pgRNA在進入細胞質(zhì)后,一方面會翻譯成聚合酶蛋白和核心蛋白,另一方面,pgRNA作為逆轉(zhuǎn)錄模板形成rcDNA,而未被逆轉(zhuǎn)錄的pgRNA以裸衣殼形式或者被乙型肝炎表面抗原(hepatitis B surface antigen,HBsAg)包裝成病毒樣顆粒分泌出胞[14]。因此,理論上血清HBV RNA作為肝內(nèi)cccDNA的直接下游產(chǎn)物,可有效反映其遺傳組成、拷貝數(shù)以及轉(zhuǎn)錄活性。

我們團隊前期研究表明,CHB患者血清HBV RNA可準確反映肝內(nèi)cccDNA的遺傳組成。在HBV復(fù)制過程中,由于病毒逆轉(zhuǎn)錄酶缺乏校對功能,HBV突變主要發(fā)生在pgRNA逆轉(zhuǎn)錄為rcDNA這一環(huán)節(jié)。攜帶突變rcDNA可進一步合成突變型的cccDNA,接著轉(zhuǎn)錄生成突變型的HBV RNA。因此,我們創(chuàng)新性地以拉米夫定耐藥突變位點(rtM204I/V)的突變作為血清HBV DNA、RNA和肝內(nèi)cccDNA的遺傳標記,同時檢測CHB患者血清HBV DNA、RNA和肝內(nèi)cccDNA的rtM204I/V突變比率并進行相關(guān)性分析,發(fā)現(xiàn)肝內(nèi)cccDNA的 rtM204I/V突變比率與血清HBV RNA的突變比率高度相關(guān)(r=0.96,P=0.0001),但與HBV DNA的突變比率無相關(guān)性[15],表明了血清HBV RNA是準確反映肝內(nèi)cccDNA遺傳組成的重要無創(chuàng)標志物。

在反映cccDNA拷貝數(shù)和轉(zhuǎn)錄活性方面,血清HBV RNA在不同疾病階段的CHB患者中的表現(xiàn)不盡相同。在初治患者中,有研究發(fā)現(xiàn)血清HBV RNA與cccDNA拷貝數(shù)呈弱相關(guān)性(r=0.25～0.36)[16, 17],但也有研究報道二者相關(guān)系數(shù)高達0.59～0.78[18, 19]。不同研究報道的結(jié)果不盡一致,可能與不同研究的人群臨床特征差異性大以及當前血清HBV RNA與肝內(nèi)cccDNA的提取與檢測方法還未完善、統(tǒng)一相關(guān)。對于NAs治療后的患者,一項小樣本量研究(HBeAg陽性14例,HBeAg陰性17例)報道,血清HBV RNA水平與cccDNA拷貝數(shù)不存在相關(guān)性,但與cccDNA轉(zhuǎn)錄活性(胞內(nèi)HBV RNA與cccDNA的比值)顯著相關(guān)(r=0.584,P=0.001)[20]。對于PEG-IFN-α治療患者,一項納入30例經(jīng)PEG-IFN-α治療48周的HBeAg陽性患者的研究顯示,血清HBV RNA與cccDNA具有中度相關(guān)(r=0.728,P<0.001)[18]。但由于Peg-IFN-α一方面可以直接降解cccDNA、HBV RNA[21, 22],另一方面也能通過沉默cccDNA間接下調(diào)HBV RNA水平[23],因此Peg-IFN-α治療后兩者的相關(guān)性仍需要更多研究明確。綜上所述,對于自然史患者,血清HBV RNA可以一定程度上反映cccDNA水平,但在反映cccDNA轉(zhuǎn)錄活性方面的證據(jù)仍欠缺;對于經(jīng)治患者,目前的證據(jù)不足以支持血清HBV RNA可較好地反映cccDNA拷貝數(shù)和轉(zhuǎn)錄活性,仍需大樣本量、包含不同治療手段的治療史隊列進一步明確。

三、關(guān)鍵問題三:HBV pgRNA與HCC相關(guān)性已得到初步證實,但其是否驅(qū)動HCC的發(fā)生、發(fā)展仍未明確

近期,我們在一項大樣本量、前瞻性、觀察性的長期隨訪抗病毒治療CHB隊列中發(fā)現(xiàn),血清HBV RNA水平與CHB患者HCC發(fā)生風(fēng)險獨立相關(guān),表明血清HBV RNA水平與血清HBV DNA水平類似,也是能反映CHB疾病進展的血清標志物[24]。有意思的是,最近的一項研究顯示,對于接受長期NAs治療且血清HBV DNA檢測不到的患者,血清pgRNA水平高者的總生存率較差,肝癌切除后累積復(fù)發(fā)率較高。這項研究的體內(nèi)外實驗顯示,HBV pgRNA自身能直接通過系列機制促進肝癌細胞的惡性表型[25]。由此我們不禁思考,HBV pgRNA在CHB疾病進展過程中所扮演的究竟是一個風(fēng)險標志物,還是一個疾病進展直接驅(qū)動因素的角色?

目前主流觀點認為HBV病毒本身直接促進HCC發(fā)生的主要機制有以下三種:(1)通過將病毒DNA整合到宿主癌基因(如TERT和CCNE1等)中,導(dǎo)致癌基因表達上調(diào)[26, 27];(2)病毒DNA的整合以及病毒蛋白的表達導(dǎo)致宿主基因組的不穩(wěn)定性[28];(3)野生型和突變/截短病毒蛋白(HBx、HBc和preS)影響細胞功能,激活致癌信號通路并使肝細胞對誘變因素敏感[28]。既往沒有文獻表明HBV pgRNA自身具備直接促進HCC發(fā)生、發(fā)展的功能,僅有部分文獻顯示HBV pgRNA的一些剪接變異體能夠翻譯形成某些功能蛋白,這些功能蛋白能促進HCC發(fā)生、發(fā)展[29, 30]。因此研究HBV pgRNA是否具有直接促進HCC發(fā)生的生物學(xué)效應(yīng)之前,也需要排除這些功能蛋白的影響。

探討HBV pgRNA自身是否具有直接促進HCC發(fā)生、發(fā)展作用,還有以下幾個方面值得深入探討:(1)大多數(shù)慢性HBV感染者從感染HBV到形成HCC需要經(jīng)歷較為漫長的慢性肝炎和肝硬化階段,這也是HBV相關(guān)HCC發(fā)生、發(fā)展的主要驅(qū)動因素。而從HBV感染自然史來看,大多數(shù)患者也需要經(jīng)歷時間較長的HBeAg陽性慢性感染(免疫耐受)階段,在該階段患者肝內(nèi)病毒復(fù)制活躍,有巨量的HBV pgRNA存在,無明顯或只有輕微炎癥和纖維化,而HCC發(fā)生的風(fēng)險反而較低[31, 32]。盡管HCC發(fā)生是多因素共同作用的結(jié)果,但如果HBV pgRNA自身具有直接促進HCC發(fā)生的生物學(xué)效應(yīng),那么如何用這種效應(yīng)去解釋自然史不同階段HCC發(fā)生風(fēng)險上的差異?這種效應(yīng)與肝臟炎癥和纖維化等因素間具有何種內(nèi)在聯(lián)系?(2)肝細胞內(nèi)HBV pgRNA主要有三條去路:1)HBV pgRNA被降解;2)通過逆轉(zhuǎn)錄合成HBV DNA;3)以病毒顆粒或裸衣殼包裹等形式分泌出胞。抑制其中一條去路將可能導(dǎo)致胞內(nèi)HBV pgRNA蓄積增多。目前,各類臨床試驗在研的HBV衣殼抑制劑能抑制pgRNA包裝,從而減少其逆轉(zhuǎn)錄合成HBV DNA。目前尚未發(fā)現(xiàn)衣殼抑制劑對肝細胞內(nèi)pgRNA水平的影響[33],那么衣殼抑制劑治療是否會導(dǎo)致肝內(nèi)pgRNA水平升高進而增加HCC發(fā)生的風(fēng)險,這值得通過體內(nèi)外實驗進行探究。(3)HBV cccDNA不僅轉(zhuǎn)錄pgRNA,還轉(zhuǎn)錄3.5 kb長度的precore mRNA。從序列上看,precore mRNA僅在5’端略長于pgRNA,二者的其余序列完全一致,如果pgRNA能直接驅(qū)動HCC發(fā)生、發(fā)展,那么precore mRNA是否也存在類似功能?這也值得通過體內(nèi)外實驗進行探究。

綜上所述,我們認為HBV pgRNA是否具有直接促進HCC發(fā)生的生物學(xué)作用仍需要更多的實驗和臨床數(shù)據(jù)進行論證。從已發(fā)表的文獻來看,血清HBV RNA更多是扮演反映HCC發(fā)生風(fēng)險的血清標志物的角色。需要注意的是,在NAs治療下,血清HBV DNA被抑制轉(zhuǎn)陰而血清HBV RNA仍檢測陽性,提示了肝內(nèi)cccDNA仍有較高的轉(zhuǎn)錄活性,這樣的患者仍有相對較高的HCC發(fā)生風(fēng)險。

四、總結(jié)與展望

總體來說,血清HBV RNA作為新型病毒學(xué)標志物,已經(jīng)在預(yù)測NAs停藥后復(fù)發(fā)、預(yù)測IFN治療應(yīng)答和監(jiān)測肝臟疾病進展等方面體現(xiàn)了潛在的應(yīng)用價值。但在進一步廣泛應(yīng)用于臨床實踐之前,開發(fā)經(jīng)過不同人群的隊列驗證并被廣泛認可的血清HBV RNA提取和檢測方法是亟待解決的關(guān)鍵問題之一。在臨床應(yīng)用方面,血清HBV RNA作為cccDNA的下游產(chǎn)物,可以較好地反映cccDNA遺傳組成,但在反映cccDNA的拷貝數(shù)和轉(zhuǎn)錄活性上有待在更大樣本量和不同臨床場景中研究。近年有研究發(fā)現(xiàn),血清HBV RNA可預(yù)測HCC發(fā)生風(fēng)險,但HBV RNA本身是否具有直接的促癌作用仍需要進行更深入的臨床和基礎(chǔ)研究。

利益沖突聲明：所有作者均聲明不存在利益沖突。

作者貢獻聲明：黎婉瑩、劉詩和申笙負責(zé)撰寫論文及文獻收集;孫劍負責(zé)擬定寫作思路,指導(dǎo)撰寫文章并最后定稿。