譚珂 于艷紅 孫嬌 孫秀華 王悅 賈琳 邢黎莉 張威

肺結(jié)核是一種臨床上比較常見的傳染病, 是感染結(jié)核分枝桿菌誘發(fā)的, 患者的感染幾率和死亡幾率較高。研究發(fā)現(xiàn), 肺結(jié)核患者血漿hsa-miR-20b 的表達(dá)量較高, 故可以提示患有肺結(jié)核的可靠參照物［1］。同時(shí), 當(dāng)患者感染結(jié)核桿菌時(shí)免疫細(xì)胞會分泌許多的炎性因子, 故也可以輔助診斷肺結(jié)核, 同時(shí)炎性反應(yīng)還可以提示結(jié)核病的惡化及轉(zhuǎn)歸［2］。此次試驗(yàn)的目的是探究MicroRNA 對結(jié)核患者診斷和治療監(jiān)測及易感基因表達(dá)調(diào)控的意義, 為診治肺結(jié)核提供幫助?，F(xiàn)將詳細(xì)過程報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2021 年6 月～2022 年11 月沈陽市第十人民醫(yī)院136 例肺結(jié)核患者作為肺結(jié)核組, 并選擇同時(shí)間段內(nèi)同一醫(yī)院142 例健康體檢者作為對照組。肺結(jié)核組中男76 例, 女60 例；年齡31～52 歲, 平均年齡(43.8±5.6)歲。對照組中男78 例, 女64 例；年齡34～54 歲, 平均年齡(42.1±4.8)歲。兩組一般資料無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05), 具有可比性。

1.2 納入標(biāo)準(zhǔn) ①滿足《肺結(jié)核診斷和治療指南》［3］中關(guān)于診斷肺結(jié)核的標(biāo)準(zhǔn)；②患者自愿參與相關(guān)試驗(yàn)項(xiàng)目, 并簽署知情同意書。

1.3 排除標(biāo)準(zhǔn) ①患有嚴(yán)重的肝腎功能障礙；②對試驗(yàn)藥物過敏；③患有糖尿病、腫瘤等疾病；④患有嚴(yán)重的急性心腦血管疾?。虎萑焉锲诩安溉槠?；⑥患有精神性疾病或不能配合試驗(yàn)；⑦近期使用糖皮質(zhì)激素、抗感染、免疫等影響炎癥反應(yīng)的藥物。

1.4 方法

1.4.1 樣本收集 肺結(jié)核患者在住院第2 天采集靜脈血, 同時(shí)收集健康體檢者的靜脈血, 用3500 r/min 的速度離心3 min, 提取上清液, 保持在-80℃的環(huán)境中。

1.4.2 檢測hsa-miR-20b、CUL4A mRNA、GBP5 mRNA表達(dá)量 提取標(biāo)本后, 在無菌環(huán)境下操作, 通過BIOG血清miRNA 提取試劑法收集總RNA, 具體操作按BIOG血漿血清miRNA 提取試劑(常州百代生物科技股份有限公司)說明書進(jìn)行。以紫外分光光度計(jì)(Nano EX,澤尼薩爾有限公司)檢測RNA 濃度、純度, 并驗(yàn)其完整性。根據(jù)BIOG miRNA 探針法逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(常州百代生物科技股份有限公司)說明書將RNA 逆錄成cDNA。利用BIOG miRNA 探針法熒光定量PCR 試劑(常州百代生物科技股份有限公司)及PCR 儀(Rotor-Gene Q, 凱杰企業(yè)管理有限公司)將cDNA 擴(kuò)增, qPCR檢測。hsa-miR-20b、CUL4A mRNA、GBP5 mRNA 以hsa-miR-16 為 內(nèi) 參。以2-ΔΔCt法 計(jì) 算hsa-miR-20b、CUL4A mRNA、GBP5 mRNA 相對表達(dá)量。

1.4.3 檢測血清IRF8、hsa-circRNA-103571、IFN-γ水平 提取出樣本后, 用人IRF8 酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)試劑盒(KHG0111, 上海研卉生物科技有限公司)、hsa-circRNA-103571(ELISA) 試劑盒(OSD_H0170, 長沙達(dá)爾鋒生物科技有限公司)、IFN-γ(ELISA)試劑盒(BS-E3748 h1, 廣州徠智生物科技有限公司), 通過ELISA 法對IRF8、hsa-circRNA-103571、IFN-γ 水平進(jìn)行檢測。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 數(shù)據(jù)通過SPSS22.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差 (±s)表示, 采用t 檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以率(%)表示, 采用χ2檢驗(yàn)。肺結(jié)核患者的hsa-miR-20b 與IRF8、hsa-circRNA-103571、IFN-γ的相關(guān)性檢驗(yàn)采用Pearson 相關(guān)進(jìn)行；采用Logistic 回歸分析肺結(jié)核發(fā)生的危險(xiǎn)因素；采用受試者工作特征曲線(ROC 曲線)分析hsa-miR-20b 的表達(dá)量對肺結(jié)核的診斷效能。P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組血清hsa-miR-20b、GBP5 mRNA、CUL4A mRNA 的表達(dá)量比較 與對照組相比, 肺結(jié)核組患者血清hsa-miR-20b、GBP5 mRNA 的表達(dá)水平均升高,CUL4A mRNA 的表達(dá)水平降低, 差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。見表1。

表1 兩組血清hsa-miR-20b、GBP5 mRNA、CUL4A mRNA 的表達(dá)量比較( ±s)

表1 兩組血清hsa-miR-20b、GBP5 mRNA、CUL4A mRNA 的表達(dá)量比較( ±s)

注：與對照組比較, aP＜0.05

組別 例數(shù) hsa-miR-20b GBP5 mRNA CUL4A mRNA肺結(jié)核組 136 3.35±0.20a 2.94±0.23a 0.41±0.15a對照組 142 1.01±0.23 1.02±0.13 1.03±0.11 t 90.357 86.145 39.417 P 0.000 0.000 0.000

2.2 兩組血清IRF8、hsa-ciceRNA-103571、IFN-γ水平比較 與對照組相比, 肺結(jié)核組患者血清IRF8、hsa-circRNA-103571 水平較高, IFN-γ 水平明顯較低,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。見表2。

表2 兩組血清IRF8、hsa-ciceRNA-103571、IFN-γ 水平比較( ±s)

表2 兩組血清IRF8、hsa-ciceRNA-103571、IFN-γ 水平比較( ±s)

注：與對照組比較, aP＜0.05

組別 例數(shù) IRF8(pg/ml) hsa-circRNA-103571(ng/L) IFN-γ(pg/ml)肺結(jié)核組 136 389.39±46.85a 22.48±5.06a 5.58±1.36a對照組 142 327.62±41.76 11.36±3.17 12.72±4.78 t 11.616 22.056 17.093 P 0.000 0.000 0.000

2.3 肺結(jié)核患者h(yuǎn)sa-miR-20b 與IRF8、hsa-circRNA-103571、IFN-γ 的相關(guān)性分析 Pearson 相關(guān)性分析顯示, 肺結(jié)核患者血清hsa-miR-20b 與IRF8、hsacircRNA-103571 水平呈正相關(guān)(r=0.585、0.539, P＜0.05),與IFN-γ 水平呈負(fù)相關(guān)(r=-0.485, P＜0.05)。

2.4 肺結(jié)核發(fā)生的影響因素分析 以hsa-miR-20b、IRF8、hsa-circRNA-103571、IFN-γ 水平為自變量,以肺結(jié)核是否發(fā)生為因變量, 行Logistic 回歸分析, 結(jié)果 顯 示hsa-miR-20b、IRF8、hsa-circRNA-103571 是肺結(jié)核發(fā)生的危險(xiǎn)因素(P＜0.05), IFN-γ 是肺結(jié)核發(fā)生的保護(hù)因素(P＜0.05)。見表3。

表3 肺結(jié)核發(fā)生的影響因素分析

2.5 血清hsa-miR-20b 水平對肺結(jié)核的診斷效能分析 ROC 曲線顯示, 血清hsa-miR-20b 水平對肺結(jié)核發(fā)生診斷的曲線下面積(area under curve, AUC)為0.898［95%CI=(0.860, 0.936)］, 截?cái)嘀禐?.44, 其靈敏度、特異度分別為83.82%、88.03%。見圖1。

圖1 血清hsa-miR-20b 水平對肺結(jié)核的診斷效能

3 討論

miRNA 是大量存在于人體血液中的小RNA, 并且不參與生物編碼, 在人體新陳代謝等生命活動中都有參與, 所以肺結(jié)核等肺部疾病患者其水平會顯著升高。經(jīng)Ndzi 等［4］試驗(yàn)證實(shí), 當(dāng)發(fā)生肺結(jié)核時(shí)hsa-miR-20b會出現(xiàn)異常的表達(dá)。既往研究顯示, CUL4A 在肺結(jié)核患者的表達(dá)中會出現(xiàn)差錯(cuò), 其表現(xiàn)貫徹整個(gè)疾病的演變過程［5-9］。此次試驗(yàn)證實(shí), 肺結(jié)核患者的hsa-miR-20b 表達(dá)顯著高于健康人群, 同時(shí)CUL4A mRNA 的表達(dá)出現(xiàn)下降, 證明hsa-miR-20b 表達(dá)上升和CUL4A 表達(dá)下降可以預(yù)示肺結(jié)核的出現(xiàn)和惡化。在肺結(jié)核的惡化進(jìn)程中, 免疫因子都有相應(yīng)的參與, 其中, IRF8 作為一種重要的細(xì)胞因子, 在細(xì)胞的分化和發(fā)育中起重要作用［10-14］。circRNAs 是一類由3'端反向與5'端連接形成共價(jià)閉環(huán)結(jié)構(gòu)的新型內(nèi)源性RNA, 隨著對研究的不斷深入, 發(fā)現(xiàn)circRNAs 具有與常規(guī)線性RNA 不同的生物學(xué)特性, 包括廣泛性、高度保守性、高穩(wěn)定性以及組織特異性［15-19］。此外, IFN-γ 可激活免疫細(xì)胞, 在抗結(jié)核過程中發(fā)揮重要作用, 肺結(jié)核患者血清中IRF8、hsa-circRNA-103571 水平升高, IFN-γ 水平降低。相關(guān)研究［20］中, 經(jīng)結(jié)核藥聯(lián)合利福噴丁治療后,IRF8、hsa-circRNA-103571 水平降低, IFN-γ 水平升高, IRF8、hsa-circRNA-103571、IFN-γ 均可能參與且影響肺結(jié)核發(fā)病進(jìn)展。本研究中肺結(jié)核組患者血清IRF8、hsa-ciceRNA-103571 水平均明顯高于對照組,IFN-γ 水平明顯低于對照組(P＜0.05)；由此提示炎癥相關(guān)因子IRF8、hsa-circRNA-103571、IFN-γ 可能在肺結(jié)核發(fā)病過程中起一定作用。本研究中肺結(jié)核患者血清hsa-miR-20b 與IRF8、hsa-circRNA-103571 水平呈正相關(guān)(r=0.585、0.539, P＜0.05), 與IFN-γ 水平呈負(fù)相關(guān)(r=-0.485, P＜0.05)；由此提示hsa-miR-20b 可能與IRF8、hsa-circRNA-103571、IFN-γ 等因素關(guān)系密切, 可以對肺結(jié)核的演化進(jìn)行干預(yù)。本研究結(jié)果顯示, hsa-miR-20b、IRF8、hsa-circRNA-103571 是肺結(jié)核發(fā)生的危險(xiǎn)因素, IFN-γ 是肺結(jié)核發(fā)生的保護(hù)因素,提示hsa-miR-20b、IRF8、hsa-circRNA-103571 水平升高、IFN-γ 水平降低均可能使肺結(jié)核患病風(fēng)險(xiǎn)升高,及時(shí)監(jiān)測hsa-miR-20b、IRF8、hsa-circRNA-103571、IFN-γ 濃度可以提早發(fā)現(xiàn)肺結(jié)核。

綜上所述, 肺結(jié)核患者血清hsa-miR-20b 表達(dá)上調(diào), hsa-miR-20b 與炎癥相關(guān)因子具有一定相關(guān)性, 其可能與炎癥因子共同影響肺結(jié)核疾病病變過程。