張子然 李柯然

生理狀態(tài)下,角膜在促血管及淋巴管生成和抗血管及淋巴管生成之間保持動態(tài)平衡,從而維持角膜的透明性[1]。角膜血管的缺失一定程度上限制了免疫效應(yīng)細胞進入角膜組織,角膜淋巴管的缺失使抗原物質(zhì)難以進入引流區(qū)的淋巴結(jié),引起免疫耐受。角膜對移植物或其他抗原刺激產(chǎn)生的無免疫應(yīng)答狀態(tài),稱為角膜的“免疫赦免”。然而,在角膜感染、堿燒傷、干眼癥、角膜移植等病理狀態(tài)下,平衡狀態(tài)被打破,血管和淋巴管由角膜緣向角膜中央延伸[2]。角膜血管和淋巴管的生成不僅嚴重損害視功能,更打破了角膜的“免疫赦免”狀態(tài)。隨著LYVE-1等淋巴內(nèi)皮特異性標志物的發(fā)現(xiàn)[3],越來越多的課題開始聚焦于角膜淋巴管生成的研究,但是目前臨床上仍然缺少特異性調(diào)節(jié)淋巴管生成的治療策略。本文綜述了角膜淋巴管生成的內(nèi)源性調(diào)控因素及新生淋巴管相關(guān)眼表疾病的治療策略。

1 角膜淋巴管生成的內(nèi)源性調(diào)控因素

1.1 調(diào)節(jié)因子

在眾多與淋巴管生成有關(guān)的內(nèi)源性調(diào)節(jié)因子中,血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)和血管生成素(Ang)等可直接作用于淋巴管內(nèi)皮細胞(LECs),調(diào)控淋巴管生成,而成纖維細胞生長因子(FGF)和炎癥細胞因子等可通過調(diào)節(jié)VEGF的表達發(fā)揮間接調(diào)控作用。

1.1.1 VEGF

VEGF是調(diào)節(jié)角膜新生淋巴管形成的關(guān)鍵細胞因子。當(dāng)VEGF受體(VEGFR)與VEGF結(jié)合后,激酶區(qū)構(gòu)象發(fā)生改變產(chǎn)生激酶活性,進而催化底物蛋白磷酸化,最終通過信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分子的級聯(lián)反應(yīng)發(fā)揮一系列生物效應(yīng)。其中,成人的血管內(nèi)皮細胞主要表達VEGFR-1和VEGFR-2,而LECs主要表達VEGFR-3[4]。

VEGF-A激活VEGFR-2可促進LECs增殖。Bj?rndahl等[5]通過建立小鼠角膜淋巴管生成模型發(fā)現(xiàn),VEGFR-3拮抗劑無法成功抑制VEGF-A所誘導(dǎo)的淋巴管生成,證明VEGF-A以獨立于VEGF-C/-D/R-3信號軸的方式促進淋巴管生成。而后,Dellinger等[6]證明VEGF-A激活VEGFR-2,通過PI3-K和ERK1/2信號通路直接驅(qū)動LECs增殖和遷移,揭示了VEGF-A促進淋巴管生成的潛在機制。

VEGF-C和VEGF-D結(jié)合并激活VEGFR-2和VEGFR-3,使其形成同源二聚體并促進細胞質(zhì)酪氨酸殘基的自磷酸化,從而激活A(yù)kt和ERK等下游信號通路,誘導(dǎo)淋巴管生成[7]?，F(xiàn)已在小鼠模型中證明,使用單克隆抗體或可溶性VEGFR(VEGFC/D traps)能夠阻斷VEGF-C、VEGF-D與LECs膜表面VEGFR的有效結(jié)合,從而降低淋巴管的密度和出芽能力[8-9]。最近,Le等[10]研究發(fā)現(xiàn),全身應(yīng)用VEGF TrapR1R2幾乎能夠完全抑制角膜縫線小鼠模型中的血管和淋巴管生成。隨后該團隊進一步研究顯示,在角膜移植術(shù)后局部應(yīng)用VEGF TrapR1R2滴眼液可以抑制角膜淋巴管生成[11-12]。

1.1.2 Ang

除了VEGF/VEGFR途徑外,Ang/Tie系統(tǒng)是淋巴管生成所必需的另一種內(nèi)皮細胞特異性配體-受體信號系統(tǒng)。Ang家族包括Ang-1、Ang-2、Ang-3和Ang-4,且均作用于其特異性受體Tie-2[13-14]。

Ang-1是Tie-2的強激動劑,可以誘導(dǎo)內(nèi)皮細胞遷移、出芽和成管。而Ang-2是Tie-2的弱激動劑或拮抗劑,可以抑制Ang-1/Tie-2信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路[15]。Gale等[16]在小鼠模型中發(fā)現(xiàn),Ang-1可以挽救Ang-2突變小鼠的淋巴管生成障礙,證明Ang-1在淋巴管生成中發(fā)揮調(diào)節(jié)作用。

Toyono等[17]發(fā)現(xiàn),在縫線誘導(dǎo)的角膜新生淋巴管模型中,Ang-2在角膜組織中表達顯著升高,其對于誘導(dǎo)炎性角膜新生淋巴管至關(guān)重要。此外,研究發(fā)現(xiàn),Ang-2不僅能夠調(diào)控淋巴管生成,還參與調(diào)節(jié)LECs間連接的轉(zhuǎn)換并維持連接的完整性[18]。Zhang等[19]通過拮抗Ang-2減少了淋巴管介導(dǎo)的供體細胞向引流淋巴結(jié)的運輸,最終提高了角膜移植物的存活率,這進一步證明Ang-2的重要作用。

1.1.3 FGF

FGF 家族至少包含22種不同亞型,其特異性細胞表面受體(FGFR)是具有酪氨酸激酶活性的單程跨膜蛋白[20]。特別的是,FGF與FGFR的相互作用需要肝素或硫酸肝素蛋白聚糖的干預(yù)以穩(wěn)定其受體二聚體的形成。因此,FGF的活性在多個水平上受到調(diào)節(jié),包括生長因子表達、受體結(jié)合親和力和與硫酸肝素蛋白聚糖的相互作用等[21]。

研究發(fā)現(xiàn),FGF-2通過激活FGFR-1介導(dǎo)的信號通路直接作用于LECs,促進其增殖和遷移。此外,FGF-2和VEGF-C在體內(nèi)協(xié)同刺激淋巴管生成的過程中,利用中和抗體阻斷VEGFR-3,能夠顯著抑制FGF-2誘導(dǎo)的淋巴管生成,這表明FGF-2通過VEGF-C/VEGFR-3信號系統(tǒng)間接調(diào)控淋巴管生成[22]。Xie等[23]研究發(fā)現(xiàn),Notch信號通路參與堿性FGF誘導(dǎo)的角膜淋巴管生成,Notch通路的抑制上調(diào)了VEFG-A的表達,從而促進堿性FGF誘導(dǎo)淋巴管生成。

除了誘導(dǎo)淋巴管生成,FGF-2還可調(diào)控某些細胞因子的表達。Gurung等[24]在單純皰疹病毒性角膜炎的研究中發(fā)現(xiàn),阻斷FGF-2抑制了病毒感染小鼠角膜淋巴管的生成,降低了包括肝細胞生長因子、白細胞介素(IL)-6和VEGF-A在內(nèi)的血管生成因子的表達,提示FGF-2有望成為抑制病理性淋巴管生成的潛在治療靶點。

1.1.4 炎癥細胞因子

炎癥反應(yīng)在淋巴管生成和重塑過程中發(fā)揮重要作用[25],許多促炎細胞因子,例如腫瘤壞死因子α(TNF-α)、IL、血小板源性生長因子等已被證明可促進血管和淋巴管生成。

角膜炎癥狀態(tài)下,TNF-α在角膜上皮、基質(zhì)和內(nèi)皮中表達均升高[26]。Zhang等[27]研究發(fā)現(xiàn),TNF-α可通過NF-κB誘導(dǎo)巨噬細胞產(chǎn)生VEGF-C,刺激淋巴管生成。此外,在小鼠眼表瘢痕模型中,抑制TNF-α可顯著減少角膜新生淋巴管的生成[28]。

IL-8以非依賴于VEGF的形式直接促進LECs的增殖、遷移和小管形成,誘導(dǎo)角膜淋巴管生成[29]。最近,Han等[30]的研究結(jié)果首次表明IL-33通過ST2/TRAF6介導(dǎo)的Akt/eNOS/NO信號通路促進炎癥誘導(dǎo)的淋巴管生成,為治療炎癥和淋巴管生成相關(guān)疾病提供了更多的可能。

P物質(zhì)存在于角膜神經(jīng)叢、淚液、角膜上皮細胞和角膜基質(zhì)細胞中。作為神經(jīng)系統(tǒng)與免疫系統(tǒng)間通信的關(guān)鍵分子,P物質(zhì)通過神經(jīng)激肽-1受體發(fā)揮其炎癥和免疫活性。P物質(zhì)/神經(jīng)激肽-1受體系統(tǒng)能夠調(diào)控VEGFR-3的表達,直接促進角膜病理性淋巴管生成[31]。

1.2 免疫細胞

1.2.1 巨噬細胞

巨噬細胞是一類具有吞噬、抗原遞呈以及分泌炎癥細胞因子能力的免疫細胞,存在于虹膜、睫狀體、結(jié)膜和角膜等眼部組織中,并在調(diào)節(jié)角膜血管和淋巴管生成的過程中發(fā)揮重要作用。巨噬細胞調(diào)節(jié)淋巴管生成主要通過以下幾種機制[32-34]:(1)通過分泌VEGF-A、VEGF-C和VEGF-D等旁分泌因子促進淋巴管生成;(2)巨噬細胞表達的VEGFR-1和VEGFR-3介導(dǎo)炎癥細胞的趨化作用,維持炎癥反應(yīng)和淋巴管生成;(3)巨噬細胞可能在發(fā)芽的淋巴管尖端作為橋梁細胞發(fā)揮作用,以非依賴血管生長因子的方式引導(dǎo)末端細胞與其他發(fā)芽淋巴管的尖端細胞吻合;(4)巨噬細胞通過轉(zhuǎn)分化為內(nèi)皮細胞,在結(jié)構(gòu)上參與構(gòu)成并直接促進新生淋巴管的形成。

最近,IL-10激活的巨噬細胞在炎性角膜淋巴管生成中的重要作用已被證實[34]。IL-10在健康角膜中不表達,而在被炎癥浸潤的巨噬細胞中高表達,并通過巨噬細胞調(diào)控角膜淋巴管的生成和角膜炎癥的消退。實驗證明,IL-10刺激巨噬細胞可發(fā)揮抗炎作用并且誘導(dǎo)其VEGF-C表達上調(diào),從而誘導(dǎo)角膜淋巴管的生成和局部炎癥反應(yīng)的終止[35]。

1.2.2 肥大細胞

肥大細胞也被稱為前哨免疫細胞,被激活后可釋放多種細胞因子、酶和血管活性胺等,誘導(dǎo)更多的免疫細胞對病原體或組織損傷做出反應(yīng)[36]。肥大細胞在皮膚和眼表等與外部環(huán)境交界的血管化組織中表達最為豐富。眼表肥大細胞僅存在于角膜緣區(qū)域,在炎癥損傷后向中央角膜浸潤[37]。Cho等[38]先前證明肥大細胞通過分泌高水平的VEGF-A調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮細胞功能,促進角膜血管生成。最近,該團隊進一步探究了肥大細胞與LECs的相互作用。體外實驗表明,肥大細胞高表達VEGF-D并直接促進LECs成管和增殖。此外,通過清除小鼠的肥大細胞以及局部應(yīng)用色甘酸鈉抑制肥大細胞功能,可阻斷角膜組織損傷后病理性淋巴管的生成[39]。這些發(fā)現(xiàn)為眼表肥大細胞作為調(diào)節(jié)病理性淋巴管生成的潛在治療靶點提供了新的方向。

2 角膜新生淋巴管相關(guān)眼表疾病的治療

角膜新生淋巴管與各種臨床疾病密切相關(guān),包括同種異體移植排斥反應(yīng)、干眼癥和角膜炎癥等,深入了解眼部淋巴管生成機制并以此開展針對性治療對預(yù)防疾病發(fā)生及改善預(yù)后具有重大意義。

2.1 角膜移植排斥反應(yīng)

由于角膜無淋巴管及血管,角膜異體移植的排斥率低于其他組織[40],而淋巴管的出現(xiàn)有利于抗原遞呈至區(qū)域淋巴結(jié)并加速致敏。研究發(fā)現(xiàn),將供體角膜移植到含有血管但不含淋巴管的角膜比移植到二者皆存在的角膜成功率更高,說明淋巴管的存在提示移植失敗處于高風(fēng)險狀態(tài),在移植前選擇性抑制淋巴管生成是提高移植成功率的可行治療策略[41]。

近年來,抗VEGF治療已被證明在抑制角膜移植排斥反應(yīng)中具有一定作用。局部或結(jié)膜下使用貝伐珠單抗中和VEGF-A可顯著降低角膜混濁度,提高移植物存活率?？扇苄訴EGFR-3通過阻斷VEGF-C/VEGFR-3信號轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制淋巴管生成,減少移植排斥反應(yīng)[42]。此外,鬼臼素已被證明是淋巴管內(nèi)皮的特異性標志物[43],Maruyama等[44]研究發(fā)現(xiàn),使用鬼臼素抗體能抑制淋巴管生成,具有提高移植物存活率的作用。細針透熱是目前臨床治療成熟病理性角膜血管的一種方法。近期Le等[45]證明細針透熱聯(lián)合抗炎治療能夠促使角膜淋巴管消退,顯著提高角膜移植術(shù)后移植物的存活率。Hou等[46]使用角膜縫線小鼠模型研究發(fā)現(xiàn),使用核黃素和紫外線進行的角膜膠原交聯(lián)術(shù)可以通過誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細胞和LECs凋亡使已成熟的角膜血管和淋巴管消退,提高高風(fēng)險小鼠角膜移植術(shù)的成功率。

2.2 干眼癥

干眼癥是一類多因素眼表疾病的統(tǒng)稱,其病理過程復(fù)雜。各種眼表上皮病變、免疫性炎癥、性激素水平降低以及外界環(huán)境等因素均可能導(dǎo)致淚膜穩(wěn)定性下降,引起眼部不適及眼表組織損害[47]。目前,干眼癥已被證實與免疫系統(tǒng)的激活密切相關(guān),由于干眼癥患者角膜淋巴管生成并不伴隨血管生成,因而新生淋巴管在介導(dǎo)區(qū)域淋巴結(jié)的免疫應(yīng)答激活和免疫細胞遷移中發(fā)揮核心作用,成為干眼癥發(fā)病機制的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。Ji等[48]使用干眼癥小鼠模型證實,抑制淋巴管生成可減輕炎癥反應(yīng)并保護角膜神經(jīng),提示靶向淋巴管生成可作為干眼癥的潛在治療策略。目前,已有幾項臨床研究評估了抗淋巴管生成療法在干眼癥治療中的應(yīng)用,Kasetsuwan等[49]在一項前瞻性隨機雙盲試驗中評估了貝伐珠單抗滴眼液在干眼癥患者中的有效性和安全性,結(jié)果顯示接受貝伐珠單抗滴眼液治療的患者在淚膜穩(wěn)定性、角膜染色評分和臨床癥狀方面均表現(xiàn)出顯著改善。

2.3 單純皰疹病毒性角膜炎

單純皰疹病毒是一種DNA病毒,由單純皰疹病毒引起的角膜感染稱為單純皰疹病毒性角膜炎。單純皰疹病毒分為兩種血清型,其中眼部感染的多為單純皰疹病毒-1型,感染后誘發(fā)的新生淋巴管在感染消退后持續(xù)存在,打破角膜的“免疫赦免”狀態(tài)[50]。該病易反復(fù)發(fā)作,最終因角膜混濁而導(dǎo)致失明[51]。胰島素受體底物-1被認為與單純皰疹病毒感染的淋巴管生成有關(guān),GS-101是一種抑制胰島素受體底物-1的反義寡核苷酸,可抑制角膜淋巴管生成[52]。與其他炎性淋巴管生成機制不同,單純皰疹病毒-1誘發(fā)的淋巴管生成不依賴于巨噬細胞募集或VEGF-C/D的表達,而是嚴格依賴于VEGF-A/VEGFR-2信號轉(zhuǎn)導(dǎo)[53]。因此,基于此病理機制,使用VEGF-A抑制劑或利用可溶性VEGFR-2阻斷信號轉(zhuǎn)導(dǎo)是單純皰疹病毒性角膜炎的潛在治療策略,有望在疾病的早期階段選擇性抑制角膜淋巴管的生成[54]。

3 結(jié)束語

隨著研究的逐步深入,越來越多的調(diào)節(jié)因子被證實具有調(diào)控角膜淋巴管生成的作用,然而對于眼表疾病中淋巴管調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的認識仍處于初步探索階段,調(diào)節(jié)因子如何調(diào)控角膜淋巴管生成及其因子之間的相互作用仍有待進一步明確。同時,針對角膜病理性淋巴管治療策略的安全性及有效性研究尚不充分。本文綜述了當(dāng)前角膜淋巴管生成的內(nèi)源性調(diào)控因素的研究進展,并結(jié)合新生淋巴管相關(guān)眼表疾病的治療策略進行探討,以期為角膜新生淋巴管的未來研究提供可靠的理論依據(jù)和研究方向。