祁媛媛 閆春曉 金翠華 袁琳慧 李 勝 張立軍

眼底血管性疾病,如濕性老年性黃斑變性(nAMD)[1]、糖尿病黃斑水腫(DME)[2]、視網(wǎng)膜靜脈阻塞(RVO)[3],是中老年人常見的眼底病變,多因合并黃斑水腫導(dǎo)致患者視力下降。玻璃體內(nèi)注射抗VEGF藥物是目前針對(duì)黃斑水腫的一線治療方法。有研究發(fā)現(xiàn),玻璃體內(nèi)注射抗VEGF會(huì)在房水中檢測出VEGF及抗VEGF藥物[4],而VEGF及其受體同樣可以在角膜內(nèi)皮細(xì)胞中表達(dá)[5]。Dratviman-Storobinsky等[6]研究發(fā)現(xiàn),玻璃體內(nèi)注射貝伐單抗1 d 后,患者角膜基質(zhì)層會(huì)出現(xiàn)免疫標(biāo)志物,故多次注射抗VEGF藥物可能會(huì)對(duì)患者角膜內(nèi)皮及角膜神經(jīng)帶來影響。目前,人們已開始關(guān)注抗VEGF藥物對(duì)角膜的影響。Merz等[7]通過體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),雷珠單抗和貝伐單抗對(duì)角膜內(nèi)皮細(xì)胞無毒性;但Urban等[8]研究發(fā)現(xiàn),雷珠單抗和阿柏西普會(huì)使nAMD患者角膜內(nèi)皮細(xì)胞密度明顯減少。Polat等[9]研究發(fā)現(xiàn),多次玻璃體內(nèi)注射抗VEGF藥物會(huì)對(duì)患者角膜基底膜下神經(jīng)纖維叢產(chǎn)生影響,但也有學(xué)者提出不同意見[10]。以上報(bào)道大多為回顧性研究,多為單一藥物對(duì)某一特定疾病治療后的臨床觀察,且所得結(jié)論不盡相同。本次我們研究多次玻璃體內(nèi)注射雷珠單抗或阿柏西普對(duì)nAMD、RVO、DME患者角膜組織形態(tài)的影響。

1 資料與方法

1.1 一般資料

前瞻性臨床研究。選取2021年6月至2022年6月在我院眼內(nèi)科注射中心接受治療的患者共64例(64眼)作為研究對(duì)象;其中,男33例,女31例;年齡(57.0±8.1)歲;nAMD患者19例,DME 患者20例,RVO患者25例。阿柏西普(40 g·L-1)治療29例,雷珠單抗(10 g·L-1)治療35例。所有入組病例均選取單眼注射,采取3+PRN的隨訪治療方法。本研究遵循《赫爾辛基宣言》的原則,并獲得醫(yī)院倫理審查委員會(huì)的批準(zhǔn)(批號(hào):2022-001-001),所有患者及其家屬對(duì)本研究均知情同意并簽署知情同意書。

1.2 納入和排除標(biāo)準(zhǔn)

納入標(biāo)準(zhǔn):(1)臨床確診為nAMD、DME、RVO,且需要抗VEGF治療者;(2)既往未接受過任何眼內(nèi)注射治療;(3)無配戴角膜接觸鏡史;(4)無影響角膜內(nèi)皮功能的各種眼部疾病;(5)角膜內(nèi)皮細(xì)胞計(jì)數(shù)不少于1 000個(gè)·mm-2;(6)無內(nèi)眼及眼表等眼部手術(shù)史;(7)抗VEGF注射前3個(gè)月內(nèi)無眼部激光治療史。排除標(biāo)準(zhǔn):(1)有任何角膜或眼表疾病者;(2)同時(shí)合并其他視網(wǎng)膜或視神經(jīng)疾病者;(3)除人工淚液外,有長期眼部用藥史;(4)有免疫系統(tǒng)疾病。

1.3 檢查內(nèi)容

檢查包括最佳矯正視力、眼壓、裂隙燈、眼底鏡、眼底照相。使用SD-OCT(德國Heidelberg公司)確認(rèn)患者是否發(fā)生黃斑水腫,使用共聚焦顯微鏡(德國Heidelberg公司)行角膜神經(jīng)檢查,對(duì)整個(gè)角膜的不同位置進(jìn)行拍攝,最終選擇角膜上皮下中央?yún)^(qū)6 mm范圍內(nèi)的上皮基底膜下神經(jīng)叢圖像,采用ImageJ軟件進(jìn)行分析。使用角膜內(nèi)皮顯微鏡(日本TOPCON公司)進(jìn)行角膜厚度及角膜內(nèi)皮細(xì)胞檢查,檢查區(qū)域均為角膜中央?yún)^(qū),取質(zhì)量最清晰圖像記錄數(shù)據(jù)。以上每項(xiàng)檢查由同一名經(jīng)驗(yàn)豐富的專業(yè)人員進(jìn)行操作,并記錄術(shù)前基線及每次注射后1個(gè)月時(shí)各指標(biāo)的變化。采用ImageJ 軟件獲取神經(jīng)纖維長度(每平方毫米神經(jīng)纖維的總長度)和神經(jīng)纖維密度(每平方毫米范圍內(nèi)神經(jīng)纖維的數(shù)量)。

1.4 治療方法

充分清洗結(jié)膜囊后,使用5 g·L-1鹽酸丙美卡因滴眼液(南京瑞年百思特制藥公司)麻醉,消毒、鋪巾,聚維酮碘浸泡結(jié)膜囊90 s,30G針頭于角膜緣后3.5-4.0 mm處將藥物注射至玻璃體內(nèi)。所有患者術(shù)后使用5 g·L-1鹽酸左氧氟沙星滴眼液滴眼(日本參天制藥株式會(huì)社),每天4次,連續(xù)滴眼7 d。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 23.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,Shapiro-Wilk法進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)。正態(tài)分布資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,多組間比較采用方差分析,重復(fù)測量資料采用重復(fù)測量方差分析,多重比較采用LSD法。非正態(tài)分布資料采用中位數(shù)(25%和75%四分位數(shù))表示,多組間比較采用Kruskal-Wallis非參數(shù)檢驗(yàn)。檢驗(yàn)水準(zhǔn):α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 不同疾病患者多次注射前后術(shù)眼角膜各指標(biāo)變化

2.1.1 術(shù)前不同疾病患者術(shù)眼角膜各指標(biāo)情況

術(shù)前,DME組患者內(nèi)皮細(xì)胞密度低于nAMD組和RVO組,DME組患者內(nèi)皮細(xì)胞平均面積高于nAMD組和RVO組,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P<0.05),三種不同疾病患者其余指標(biāo)差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P>0.05)(表1)。

表1 術(shù)前不同疾病患者術(shù)眼角膜各指標(biāo)情況

2.1.2 注射3次后不同疾病患者術(shù)眼角膜各指標(biāo)情況

注射3次后,DME組患者內(nèi)皮細(xì)胞密度低于nAMD組和RVO組,內(nèi)皮細(xì)胞平均面積高于nAMD組和RVO組,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P<0.05);DME組患者神經(jīng)纖維長度短于nAMD組和RVO組,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P<0.05);三種不同疾病患者其余指標(biāo)差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P>0.05)(表2)。

表2 注射3次后不同疾病患者術(shù)眼角膜各指標(biāo)情況

2.2 同種藥物、同種疾病多次注射后術(shù)眼角膜各指標(biāo)變化

2.2.1 多次注射阿柏西普后nAMD組患者術(shù)眼角膜各指標(biāo)變化情況

自從第2次注射阿柏西普后,nAMD組患者內(nèi)皮細(xì)胞密度均較術(shù)前減少,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P<0.05)。每次注射后六角形細(xì)胞比例均較術(shù)前減少,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P<0.05)。其余指標(biāo)注射后與術(shù)前相比,差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P>0.05)(表3)。

表3 多次注射阿柏西普后nAMD組患者術(shù)眼角膜各指標(biāo)變化情況

2.2.2 多次注射雷珠單抗后RVO組患者術(shù)眼角膜各指標(biāo)變化情況

自從第2次注射雷珠單抗后,RVO組患者內(nèi)皮細(xì)胞密度均較術(shù)前減少,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P<0.05)。其余指標(biāo)注射后與術(shù)前相比,差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P>0.05)(表4)。

表4 多次注射雷珠單抗后RVO組患者術(shù)眼角膜各指標(biāo)變化

2.3 并發(fā)癥

所有患者均完成術(shù)后3～6個(gè)月的隨訪,在此期間均未發(fā)生系統(tǒng)性或眼部不良事件。

3 討論

近年來,玻璃體內(nèi)注射抗VEGF藥物成為治療黃斑水腫的一線方法[11],雖然該方法操作簡單易行,但仍可出現(xiàn)葡萄膜炎、玻璃體積血等眼部并發(fā)癥[12]或全身性副作用[13],而多次玻璃體內(nèi)注射抗VEGF藥物是否會(huì)對(duì)角膜產(chǎn)生影響,需要在臨床工作中觀察驗(yàn)證。

Merz等[7]將角膜植片放在不同濃度的貝伐單抗或雷珠單抗培養(yǎng)液中進(jìn)行培養(yǎng),發(fā)現(xiàn)兩者對(duì)角膜內(nèi)皮細(xì)胞均無毒性。Gharbiya等[14]研究發(fā)現(xiàn),兔眼前房內(nèi)注射雷珠單抗和阿柏西普可通過改變p75NTR-proNGF通路誘導(dǎo)兔角膜內(nèi)皮細(xì)胞凋亡;與雷珠單抗相比,阿柏西普誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡更明顯,但此項(xiàng)研究為兔眼前房內(nèi)注射,而非玻璃體內(nèi)注射。林杜生等[15]研究發(fā)現(xiàn),阿柏西普短期注射對(duì)角膜內(nèi)皮細(xì)胞形態(tài)和中央角膜厚度無明顯影響,但也有學(xué)者得出不同結(jié)論[16-17]。

我們比較了不同疾病多次玻璃體內(nèi)注射抗VEGF藥物前后角膜內(nèi)皮指標(biāo)的差別。術(shù)前,DME組患者內(nèi)皮細(xì)胞密度低于nAMD組和RVO組,DME組患者內(nèi)皮細(xì)胞平均面積高于nAMD組和RVO組,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P<0.05)。注射3次后,DME組患者內(nèi)皮細(xì)胞密度仍低于nAMD組和RVO組,內(nèi)皮細(xì)胞平均面積高于nAMD組和RVO組,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P<0.05);DME組患者神經(jīng)纖維長度短于nAMD組和RVO組,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P<0.05)。我們分析,當(dāng)角膜內(nèi)皮細(xì)胞密度減少,部分內(nèi)皮細(xì)胞缺失時(shí),臨近細(xì)胞以擴(kuò)張方式填補(bǔ)周圍組織,導(dǎo)致細(xì)胞體積大小不一,部分細(xì)胞體積增大。另有研究發(fā)現(xiàn),糖尿病患者可因多種機(jī)制發(fā)生角膜內(nèi)皮損傷,其角膜內(nèi)皮細(xì)胞更易受內(nèi)、外環(huán)境的影響[18],這與本研究結(jié)果一致。

在實(shí)際的臨床診療中,RVO患者接受雷珠單抗治療的數(shù)量較多,nAMD患者采用阿柏西普治療的數(shù)量較多。故本研究中,將兩種疾病的患者單獨(dú)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。自從第2次注射阿柏西普后,nAMD組患者內(nèi)皮細(xì)胞密度均較術(shù)前減少,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P<0.05)。每次注射后六角形細(xì)胞比例均較術(shù)前減少,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P<0.05)。自從第2次注射雷珠單抗后,RVO組患者內(nèi)皮細(xì)胞密度均較術(shù)前減少,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P<0.05)。以上結(jié)果說明,阿柏西普相比雷珠單抗而言,對(duì)角膜內(nèi)皮細(xì)胞的影響可能更大,這與Urban等[8]的研究結(jié)果相似。研究發(fā)現(xiàn),阿柏西普在玻璃體內(nèi)的活性比雷珠單抗更長[19],所以我們推測其潛在的對(duì)眼底的有利影響和對(duì)角膜的不利影響都更強(qiáng)。

VEGF家族已被發(fā)現(xiàn)在血管和神經(jīng)的發(fā)育、神經(jīng)營養(yǎng)和神經(jīng)保護(hù)中起著重要作用[20]。Marfurt等[21]報(bào)道VEGF-A165b對(duì)糖尿病大鼠表皮感覺神經(jīng)元具有保護(hù)和抗損傷作用。Dong等[22]研究發(fā)現(xiàn),結(jié)膜下注射貝伐單抗會(huì)明顯引起鼠角膜神經(jīng)衰退、感覺變遲鈍、上皮修復(fù)延遲。Polat等[9]研究發(fā)現(xiàn),多次玻璃體內(nèi)注射抗VEGF對(duì)角膜基底膜下神經(jīng)纖維叢有影響,也會(huì)使角膜敏感度降低。這些研究結(jié)果支持了VEGF對(duì)角膜神經(jīng)細(xì)胞的有利影響以及抗VEGF對(duì)眼神經(jīng)組織的潛在危害這一結(jié)論。

我們比較了三種不同疾病患者的角膜神經(jīng)情況。基線時(shí),三組患者神經(jīng)纖維長度差異不明顯,經(jīng)過多次注射后,DME組患者的神經(jīng)纖維長度短于nAMD組和RVO組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。據(jù)報(bào)道[23],糖尿病患者相比其他疾病患者,更容易表現(xiàn)出角膜神經(jīng)纖維的漸進(jìn)性喪失和角膜敏感性下降。因此,多次注射抗VEGF藥物更容易引起糖尿病患者的角膜神經(jīng)改變。有研究報(bào)道[24],在糖尿病伴或不伴視網(wǎng)膜病變發(fā)展4年的患者中,神經(jīng)纖維長度變化相對(duì)于神經(jīng)纖維密度更為敏感,是糖尿病視網(wǎng)膜病變惡化的預(yù)測因素之一。在本研究中,多次注射抗VEGF藥物對(duì)眼底血管性疾病患者的角膜神經(jīng)纖維長度有一定影響,而對(duì)角膜神經(jīng)纖維密度無明顯影響。

本研究隨訪時(shí)間較短,每種疾病的樣本量相對(duì)較小,對(duì)于多次眼內(nèi)注射抗VEGF藥物是否對(duì)角膜產(chǎn)生影響這一問題,仍需要擴(kuò)大樣本量、延長隨訪時(shí)間以進(jìn)一步觀察。

4 結(jié)論

本研究發(fā)現(xiàn),多次玻璃體內(nèi)注射抗VEGF藥物會(huì)一定程度降低角膜內(nèi)皮六角形細(xì)胞比例及內(nèi)皮細(xì)胞密度,注射藥物后DME組的神經(jīng)纖維長度顯著短于nAMD組和RVO組。因此,臨床上多次玻璃體內(nèi)注射抗VEGF藥物會(huì)對(duì)不同疾病眼底血管性疾病患者角膜內(nèi)皮及角膜神經(jīng)產(chǎn)生一定影響,多次反復(fù)玻璃體內(nèi)注射抗VEGF藥物后需要關(guān)注患者角膜的安全性。