陶純立 馮春艷

肝損傷（liver injury, LI）是一種由于酒精刺激、病毒性肝炎、藥物性肝炎、化學(xué)污染等導(dǎo)致肝臟細胞凋亡、壞死和纖維化損傷的疾病[1]。LI是多種肝病的起始階段，隨著病情進展嚴重者則會發(fā)生肝臟纖維化、肝硬化、肝衰竭等[2-3]。因此，阻止LI的發(fā)生和發(fā)展具有重要意義。

中藥具有多成分、多靶點、多途徑的特點，在疾病的治療中具有獨特優(yōu)勢。柴胡-白芍作為中醫(yī)疏肝氣常用藥對，在臨床中常用于治療肝臟損傷性疾病[4]。柴胡為傘形科植物柴胡BupleurumchinenseDC.或狹葉柴胡BupleurumscorzonerifoliumWilld.的干燥根，具有和解表里，疏肝升陽之功效[5]。白芍本品為毛茛科植物芍藥PaeonialactifloraPall.的干燥根，具有養(yǎng)血柔肝之功效[6]。有研究報道，柴胡-白芍配伍后可減輕肝臟炎癥反應(yīng)，提高細胞色素CYP2E1酶活性，減輕氧化應(yīng)激反應(yīng)，發(fā)揮治療LI作用[7-9]。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)可用于創(chuàng)建基于靶分子、生物學(xué)功能和生物活性化合物的復(fù)雜作用網(wǎng)絡(luò)，系統(tǒng)地反映中醫(yī)藥多成分、多靶點、多途徑的疾病干預(yù)機制[10]。本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對接技術(shù)，篩選出柴胡-白芍藥對的活性成分，以及治療LI的作用靶點和信號通路，以探究柴胡-白芍藥對抗LI的作用機制，為柴胡-白芍藥對治療LI的進一步研究，以及中醫(yī)藥治療LI提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 柴胡-白芍藥對活性成分及靶點篩選

運用中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫與分析平臺（TCMSP，https://old.tcmsp-e.com/tcmsp.php）以口服生物利用度（oral bioavailability, OB）≥0.30且類藥性（drug-likeness, DL）≥0.18為條件篩選得到柴胡-白芍藥對的活性成分化合物及對應(yīng)靶點，運用Pubchem平臺（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）獲取靶點Canonical SMILES號，通過SwissTargetPrediction（http://swisstargetprediction.ch/）及TargetNet數(shù)據(jù)庫（http://targetnet.scbdd.com/）預(yù)測并獲取有效靶點。

1.2 疾病靶點篩選

運用GeneCards（https://www.genecards.org/）及OMIM數(shù)據(jù)庫（https://www.omim.org/）以“l(fā)iver injury”為關(guān)鍵詞，篩選獲取LI疾病基因靶點，以相關(guān)性分數(shù)＞4為標準，去除重復(fù)基因，整理導(dǎo)入Excle表。運用Venn 2.1平臺，將柴胡-白芍藥對靶點與LI疾病基因靶點進行分析取交集，得到韋恩圖，即柴胡-白芍藥對治療LI的潛在靶點。

1.3 蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用（protein-protein interaction, PPI）網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

將柴胡-白芍藥對抗LI的潛在靶點導(dǎo)入String數(shù)據(jù)庫（https://cn.string-db.org/），靶點網(wǎng)絡(luò)以PPI閾值0.9為標準，隱藏游離靶點，獲取PPI網(wǎng)絡(luò)，下載PPI可視化圖和潛在靶點.TSV文件。將潛在靶點.TSV文件使用Cytoscape 3.9軟件打開，進行Network analyze分析，根據(jù)Degree值，繪制可視化PPI圖。

1.4 “藥物-活性成分-靶點”網(wǎng)絡(luò)

將柴胡-白芍藥對治療LI的活性成分和潛在靶點進行整理，運用Excel建立“藥物-活性成分-靶點”表，導(dǎo)入Cytoscape 3.9軟件構(gòu)建關(guān)系網(wǎng)絡(luò)，并進行可視化處理。

1.5 基因本體（gene ontology, GO）功能及京都基因與基因組百科全書（kyoto encyclopedia of genes and genomes, KEGG）通路富集分析

運用DAVID數(shù)據(jù)庫將柴胡-白芍藥對治療LI的作用靶點進行GO功能及KEGG富集分析，獲取數(shù)據(jù)，選擇GO功能分析前10的結(jié)果和KEGG富集分析前20的結(jié)果，運用微生信數(shù)據(jù)可視化平臺（https://www.bioinformatics.com.cn/）進行可視化處理。

1.6 分子對接

將活性成分和潛在靶點進行分子對接，使用PDB數(shù)據(jù)庫（https://www1.rcsb.org/）獲取受體蛋白的結(jié)構(gòu)文件。使用PyMOL 2.3.0軟件對下載的受體蛋白進行刪除水分子和原配體等操作。使用PubChem數(shù)據(jù)庫（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）下載Inositol小分子結(jié)構(gòu)文件并使用Chem3D軟件對配體分子進行計算，得到能量最小化的配體分子最優(yōu)結(jié)構(gòu)。使用Auto Dock Vina v.1.2.0軟件將靶點蛋白和小分子進行分子模擬對接，得到對接結(jié)合能以及對接結(jié)果文件。結(jié)合能越高，結(jié)合構(gòu)象越穩(wěn)定，受體與配體之間結(jié)合的可能性越大。

2 結(jié)果

2.1 柴胡-白芍藥對活性成分及靶點

共篩選得到柴胡-白芍藥對的活性成分27個，包含1個共有活性成分，為山柰酚（Kaempferol），見圖1。通過SwissTargetPrediction及TargetNet數(shù)據(jù)庫預(yù)測并獲取有效靶點，去除重復(fù)后，得到480個藥物靶基因。

圖1 柴胡-白芍藥對的活性成分

2.2 柴胡-白芍藥對治療LI的作用靶點

通過GeneCards及OMIM數(shù)據(jù)庫獲取LI疾病基因靶點，得到疾病靶點2 692個。將2 692個疾病靶點與柴胡-白芍藥對480個藥物靶點在Venn 2.1中生成韋恩圖，映射出216個共有靶點，即柴胡-白芍藥對治療LI的作用靶點。見圖2。

圖2 柴胡-白芍藥對抗LI的潛在靶點韋恩圖

2.3 PPI網(wǎng)絡(luò)

將柴胡-白芍藥對治療LI的潛在靶點導(dǎo)入String數(shù)據(jù)庫，獲得PPI網(wǎng)絡(luò)，包括239條邊，216個節(jié)點。將String數(shù)據(jù)庫下載的潛在靶點.TSV文件使用Cytoscape 3.9軟件打開，進行Network analyze分析，根據(jù)Degree值，選取排名前30的靶點繪制可視化PPI圖，其中靶點Degree值越大，則節(jié)點越大，顏色越深。排名前5的靶點分別為蛋白激酶B1（AKT1）、腫瘤壞死因子（TNF）、白細胞介素6（IL6）、血管內(nèi)皮生長因子A（VEGFA）、表皮生長因子受體（EGFR）。見圖3。

圖3 PPI網(wǎng)絡(luò)

2.4 “藥物-活性成分-靶點”網(wǎng)絡(luò)

將柴胡-白芍藥對、活性成分、交集靶點建立“藥物-活性成分-靶點”Excel表，導(dǎo)入Cytoscape 3.9軟件構(gòu)建關(guān)系網(wǎng)絡(luò)，獲得“藥物-活性成分-靶點”網(wǎng)絡(luò)。其中紅色V字形代表藥物，紫色圓形代表活性成分，綠色方形代表靶點。見圖4。

圖4 “藥物-活性成分-靶點”網(wǎng)絡(luò)

2.5 GO功能分析

DAVID數(shù)據(jù)庫將柴胡-白芍藥對治療LI的作用靶點進行GO功能分析，富集結(jié)果按照P值排序，將前10條結(jié)果在微生信數(shù)據(jù)可視化平臺進行可視化。其中，生物過程（biological process, BP），包括對細菌來源的反應(yīng)、對脂多糖的反應(yīng)、藥物反應(yīng)、節(jié)律反應(yīng)、肽基酪氨酸修飾等。細胞組分（cellular components, CC），包括細胞膜、膜筏、膜微區(qū)、質(zhì)膜、質(zhì)膜凹腔等。分子功能（molecular function, MF），包括核受體活性、配體活化轉(zhuǎn)錄因子活性、蛋白酪氨酸激酶活性、血紅素結(jié)合、藥物結(jié)合等。見圖5。

圖5 GO功能分析

2.6 KEGG富集分析

分析柴胡-白芍藥對治療LI的KEGG富集分析，結(jié)果按照P值排序，將前20條結(jié)果在微生信數(shù)據(jù)可視化平臺進行可視化。通過分析氣泡圖結(jié)果并結(jié)合LI相關(guān)通路可知，柴胡-白芍藥對治療LI的信號通路主要有PI3K/AKT信號通路、MAPK信號通路等，見圖6。

圖6 KEGG富集分析

2.7 分子對接

根據(jù)PPI分析結(jié)果，運用Auto Dock Vina v.1.2.0軟件將度值排名前5的核心作用靶點AKT1、TNF、IL6、VEGFA、EGFR與柴胡-白芍藥對的7個核心活性成分進行分子對接，獲得蛋白結(jié)合能熱圖。結(jié)果顯示，柴胡-白芍藥對中活性成分與關(guān)鍵靶點均對接穩(wěn)定，其中β-谷甾醇與TNF結(jié)合能力最強，結(jié)合能為-11.4 kcal/mol；山柰酚與TNF結(jié)合能力較強，結(jié)合能為-10.2 kcal/mol，見圖7。將結(jié)合能最強的以上兩個結(jié)果用PyMOL和Discovery Studio 2019進行可視化作圖。見圖8～9。

圖7 活性成分與核心靶點的對接結(jié)合能

圖8 山柰酚與TNF對接

圖9 β-谷甾醇與TNF對接

3 討論

肝臟作為重要的代謝和解毒器官，尤其是受到炎癥、酒精、病毒、藥物、化學(xué)污染等刺激，肝臟對有害化學(xué)物質(zhì)解毒的能力將超負荷，易導(dǎo)致肝臟細胞及功能損傷[11]。研究發(fā)現(xiàn)，LI作為急重癥肝病的前驅(qū)階段，是臨床上危重病癥的第五大常見誘因，因此，及時阻止LI的發(fā)生與發(fā)展具有重要意義[12]。LI在中醫(yī)認為其病位在肝，多因肝氣郁結(jié)、肝絡(luò)失養(yǎng)所致。葉天士《臨證指南》提到“七情之郁居多，并大都是悒郁傷肝”，《素問·六元正紀大論》提到“郁之甚者，治之奈何？木郁達之……然調(diào)其氣”，在治療上多用疏肝理氣，解郁和絡(luò)之法。故臨床常用柴胡、白芍等疏肝類中藥治療。

本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探討柴胡-白芍藥對治療LI的作用靶點及信號通路，研究其潛在機制，篩選得到柴胡-白芍藥對活性成分27個，包括山柰酚、β-谷甾醇、異鼠李素、槲皮素等；PPI分析得到柴胡-白芍藥對治療LI的核心靶點216個，其中排名前5的靶點分為AKT1、TNF、IL6、VEGFA、EGFR。其中Akt是治療LI的高頻分子，AKT1作為Akt的同源基因，與LI關(guān)系密切[13]。研究發(fā)現(xiàn)，調(diào)節(jié)Akt蛋白能夠改善肝細胞損傷[14]。TNF、IL6作為炎癥因子，在LI的發(fā)生和發(fā)展中發(fā)揮重要作用，當(dāng)肝臟受到炎癥因子刺激，可導(dǎo)致肝細胞受損，招募肝臟中NK等巨噬細胞來分泌炎癥因子，以起到調(diào)節(jié)免疫功能作用。而炎癥因子過量分泌會加重LI，從而產(chǎn)生一系列聯(lián)級反應(yīng)[15-16]。大量研究表明，抑制TNF、IL6能夠有效改善LI情況[17-18]。VEGFA、EGFR與細胞的增殖、血管生成、炎癥及細胞凋亡的抑制有關(guān)[19-20]，研究表明，調(diào)節(jié)VEGFA、EGFR能夠有效改善肝臟纖維化損傷[21-23]。

GO功能分析結(jié)果顯示，BP涉及對細菌來源的反應(yīng)、對脂多糖的反應(yīng)、藥物反應(yīng)、節(jié)律反應(yīng)、肽基酪氨酸修飾等，CC涉及細胞膜、膜筏、膜微區(qū)、質(zhì)膜、質(zhì)膜凹腔等，MF涉及核受體活性、配體活化轉(zhuǎn)錄因子活性、蛋白酪氨酸激酶活性、血紅素結(jié)合、藥物結(jié)合等。KEGG富集分析結(jié)果顯示，柴胡-白芍藥對治療LI主要涉及PI3K/AKT信號通路、MAPK信號通路等。其中，磷脂酰肌醇激酶PI3K激活，通過質(zhì)膜的第二信與細胞內(nèi)含有PH結(jié)構(gòu)域的Akt結(jié)合，發(fā)揮改變細胞膜構(gòu)象作用[24]。MAPK信號通路是信號從細胞表面?zhèn)鲗?dǎo)到細胞核內(nèi)部的重要傳遞通路，調(diào)節(jié)著細胞的生長、分化、對環(huán)境的應(yīng)激適應(yīng)、炎癥反應(yīng)等多種重要的細胞生理/病理過程[25]。研究表明，通過下調(diào)PI3K/AKT信號通路與MAPK信號通路，能夠減輕肝臟炎癥反應(yīng)，起到防治LI的作用[26-28]。

運用分子對接技術(shù)，將柴胡-白芍藥對活性成分與治療LI的核心靶點AKT1、TNF、IL6、VEGFA、EGFR進行對接，發(fā)現(xiàn)分子對接結(jié)合構(gòu)象穩(wěn)定。其中山柰酚、β-谷甾醇與TNF結(jié)合能力最強，結(jié)合能分別為-11.4 kcal/mol、-10.2 kcal/mol。研究發(fā)現(xiàn)，山柰酚能用于多種LI類疾病的防治，通過調(diào)節(jié)PI3K/AKT信號通路，下調(diào)炎癥因子TNF、白細胞介素的表達水平來防治LI[29-30]。β-谷甾醇能夠通過下調(diào)炎癥因子TNF的表達，改善肝功能水平來減輕肝纖維化損傷[31-33]。以上提示山柰酚、β-谷甾醇等成分與AKT1、TNF、IL6、VEGFA、EGFR核心靶點，可能為柴胡-白芍藥對治療LI的關(guān)鍵成分和靶點。

綜上所述，本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)、分子對接技術(shù)證明了柴胡-白芍藥對能夠通過多通路、多靶點治療LI，其機制可能通過作用于AKT1、TNF、IL6、VEGFA、EGFR等核心靶點，調(diào)控PI3K/AKT、MAPK等信號通路有關(guān)。柴胡-白芍藥對治療LI的機制復(fù)雜，本研究缺少一定的體內(nèi)外實驗驗證以進一步確定網(wǎng)絡(luò)藥理分析結(jié)果的準確性。后期將運用體內(nèi)外實驗來進一步探究柴胡-白芍治療LI的機制，以期為中醫(yī)藥臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)和新的方向。