關(guān)鍵詞：油茶；薄殼山核桃；間作；土壤；真菌；多樣性

中圖分類號：S759.3 文獻標志碼：A 文章編號：1673-923X（2024）01-0028-09

油茶Camellia oleifera 是山茶科Theaceae 常綠小喬木或灌木[1]，是我國重要的木本油料物種。全國油茶種植面積約453 萬hm²，廣泛分布于我國長江流域及以南的湖南、廣西、江西、湖北等?。▍^(qū)、市）。按照國家發(fā)展部署，到2025 年，全國油茶種植面積力爭超過600 萬hm²，成為增強國內(nèi)食用油品種的重要支撐。油茶幼林期長，生態(tài)和經(jīng)濟效益不理想。林地間作是經(jīng)濟林高效經(jīng)營的重要措施之一[1]。間作不僅影響林地土壤養(yǎng)分[2]、溫度[3]、光照[4]、微生物數(shù)量和酶活性[5-6] 等，一定程度上還影響林地小區(qū)域氣候[7]。當前油茶林地間作作物主要有花生、紅薯、大豆、山稻等1年生經(jīng)濟作物、茶葉以及林下中藥材等[5，8-11]。有報道表明，間作草本植物對油茶林地土壤養(yǎng)分和微生物多樣性有顯著提升效果[9，12-13]。但關(guān)于間作喬木樹種（如薄殼山核桃）對油茶林地土壤養(yǎng)分和微生物影響的報道甚少。

薄殼山核桃Carya illinoinensis 是胡桃科Juglandaceae 高大落葉喬木，原產(chǎn)北美洲東南部[14]，目前在我國江西、湖南、湖北、安徽、浙江、江蘇和河南[15] 等14 個省份引種栽培，與油茶發(fā)展空間上有較多的重合區(qū)域。利用有限的林地空間發(fā)展油茶和薄殼山核桃間作，是提高油茶林地單位面積效益的重要途徑之一。但生產(chǎn)中對油茶林間作薄殼山核桃是否對油茶林土壤構(gòu)成影響爭議較多。

真菌是土壤微生物環(huán)境的重要成分，是土壤微生物多樣性的關(guān)鍵指標之一[16]。土壤菌群結(jié)構(gòu)可通過高通量測序技術(shù)得到較為全面、精準的表達[17-18]。本研究采用Illumina MiSeq 高通量測序技術(shù)，研究油茶與薄殼山核桃間作對土壤理化性質(zhì)、土壤酶活性及微生物菌群結(jié)構(gòu)以及他們之間的相關(guān)性，探討油茶與薄殼山核桃間作的可行性，為制定科學合理的營林措施提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗地概況

九峰試驗林場位于武漢市東郊（114°28′52″ ～114°31′53″E，30°30′1″ ～ 30°30′59″N）， 海拔50 ～ 240 m，屬亞熱帶濕潤季風氣候區(qū)，冬夏季季風交替明顯，年均降水量1 200 ～ 1 400 mm，無霜期235 d， 年日照時數(shù)1 600 h， 年均溫度16.7 ℃，土壤以紅壤為主，母巖多為石英砂巖、砂頁巖，土層平均厚度為80 cm。

1.2 試驗設(shè)計與樣品采集

油茶林于2012 年春營建，株行距3 m×4 m，面積約12 000 m²。2013 年補植，2014 年春在面積約3 000 m² 的油茶林行內(nèi)按照株行距6 m×8 m 定植1 年生薄殼山核桃嫁接苗，即油茶+ 薄殼山核桃間作模式（Cam ＆ Car），剩余油茶林即油茶單作模式（Cam）。同年，在同一坡面利用同一批薄殼山核桃嫁接苗營建純薄殼山核桃林，面積約6 000 m²，株行距6 m×8 m，即薄殼山核桃單作模式（Car）。每年秋季3 種模式均在行間撒施1 000 kg商品有機肥后進行旋耕，旋耕深度為10 ～ 15 cm。2021 年8 月分別在3 種模式中，采用“S”形設(shè)置9 個采樣點。去除每個采樣點地表雜草，采用環(huán)刀法測定土壤物理性質(zhì)，并挖取剖面0 ～ 30 cm土壤，混勻后取2 kg，分為2 份，1 份陰干粉碎，用于土壤理化性質(zhì)的檢測，1 份立即置于干冰中并帶回實驗室，用于真菌群落多樣性和土壤酶活性的檢測。

1.3 測定與分析

1.3.1 土壤理化指標的測定

采用環(huán)刀法測定土壤含水量（SWC）、土壤容重（SBD）、土壤總孔隙度（SP）。有效硫（AS）和交換性鈣（Eca）含量參照鮑士旦[19] 的方法測定。土壤pH 值和水解氮（HN）、有效磷（AP）、有效鉀（AK）、有機質(zhì)（OC）含量參照BAI 等[20]的方法測定。

1.3.2 土壤酶活性的測定

土壤脲酶活性使用尿素作為底物進行測量[20]。土壤酸性磷酸酶參照Dick 等[21] 的方法測定。土壤過氧化物酶采用分光光度法測定[22]。土壤蔗糖酶活性參照Chen 等[23] 的方法測定。

1.3.3 土壤DNA 提取與真菌ITS 基因擴增

稱取0.5 g 土壤樣品，使用試劑盒（TIANampSoil DNA Kit）提取土壤總DNA，采用凝膠電泳法（1%）測定DNA 的完整性。采用引物ITS1-F（5'-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3'） 和ITS2-R （5'-GCT GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3'）對土壤真菌ITSITS1 區(qū)進行PCR 擴增。擴增體系：DNA 2 μL，5×PrimeSTAR GXL 緩沖液10 μL，2.5 mmol/L 的dNTP 4.0 μL，5 μmol/L 的PrimerF 1.0 μL，5 μmol/L 的Primer R 1.0 μL，5 U/μL的Polymerase 1.0 μL，BSA 1.0 μL，DNA 模板10 ng， 超純水（ddH2O） 至30 μL。模板為50 ngDNA。擴增后PCR 產(chǎn)物通過2% 的瓊脂糖電泳檢測。純化PCR 產(chǎn)物使用Axy Prep DNA 凝膠回收試劑盒（Gel Extraction Kit），構(gòu)建Miseq 文庫，利用Illumina Miseq 平臺并采用250 bp 模式進行上機測序[18，22]。

1.3.4 生物信息學統(tǒng)計分析與數(shù)據(jù)處理

使用Cutadapt 去除擴增引物，F(xiàn)astp 進行質(zhì)控，利用QIIME2 軟件中DADA2 方法對數(shù)據(jù)質(zhì)控得到的Clean Data 進一步去噪、拼接、過濾嵌合體，得到的特征序列用于后續(xù)分析。對OTUs 進行分類學分析，采用RDP classifier 貝葉斯算法，置信度閾值為0.7； 采用Unite 8.0/itself_fungi（UniteRelease 8.0）的真菌數(shù)據(jù)庫對物種進行分類和對比鑒定[23]；采用Mothur 軟件進行Alpha 多樣性指數(shù)分析，分別用艾斯（ACE）指數(shù)、香農(nóng)（Shannon）指數(shù)和辛普森（Simpson）指數(shù)表示物種的多樣度、豐富度和均勻度[24-25]。基于Bray-Curtis 距離進行Beta 多樣性計算和PCoA 分析，樣本間距離矩陣通過Fast UniFrac 分析獲得；采用Pearson 法進行環(huán)境因子Heatmap 關(guān)聯(lián)分析。生物信息學作圖在圖云平臺（www.cloudtutu.com）進行。

使用Excel 和SAS 8.1 軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計和方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 土壤理化性質(zhì)的影響

從表1 可以看出，3 種模式土壤SWC、SBD、SP 沒有顯著性差異，說明間作模式未改變土壤物理性質(zhì)。Car 單作模式下土壤pH 值6.44，顯著高于Cam 單作模式5.82 和Cam ＆ Car 間作模式5.78（P ＜ 0.05），且Cam ＆ Car 間作模式略低于Cam 單作模式，說明油茶與薄殼山核桃間作會一定程度提高土壤pH 值。3 種模式下HN、AK、AP、OC 含量均存在顯著性差異（P ＜ 0.05），其中Cam 單作模式土壤HN、AP、OC 含量顯著高于Cam amp; Car 間作模式，繼而顯著高于Car 單作模式，而Cam amp; Car 間作模式土壤AK、AS、ECa 含量顯著低于Cam 單作模式和Car 單作模式（P ＜ 0.05），說明油茶和薄殼山核桃間作增大了林地AK、AS、ECa 養(yǎng)分消耗。

2.2 間作對土壤酶活性的影響

不同模式下土壤酶活性見圖1。從圖1 中可以看出，除脲酶外，Cam amp; Car 間作模式和Cam 單作模式中土壤蔗糖酶、酸性磷酸酶、過氧化物酶活性均顯著高于Car 單作模式（P ＜ 0.05），且Cam amp; Car 間作模式中蔗糖酶活性和酸性磷酸酶活性分別為75.33 和2 188.47 U/g，略高于Cam 單作模式，說明油茶與薄殼山核桃間作一定程度上提升了林地土壤酶活性。

2.3 真菌組成與群落特征分析

由圖2 可以看出，3 種模式測序共獲得1 084 個OTUs，不同模式OTUs 總數(shù)排序為Car ＞ Cam amp;Car ＞ Cam，數(shù)量分別為431、378、275 個。3 種模式共有OTUs 數(shù)量為111 個，特有OTUs 數(shù)量中，Car 單作模式208 個，Cam amp; Car 間作模式152 個，Cam 單作模式125 個。

對OTUs 的代表序列進行分類分析（相似水平為97%）， 共鑒定出8 門11 綱56 目131 科201 屬257 種真菌。從圖3 外圓左上半圓可以看出，3 種模式真菌群落在綱水平上按照相對豐度大小依次是酵母綱Saccharomycetes、糞殼菌綱Sordariomycetes、傘菌綱Agaricomycetes、散囊菌綱Eurotiomycetes、座囊菌綱Dothideomycetes、錘舌菌綱Leotiomycetes、盤菌綱Pezizomycetes。其中酵母綱、糞殼菌綱、傘菌綱是3 種模式的共有優(yōu)勢菌綱。圖3 內(nèi)圓左上半圓表示某菌綱在3 個處理中的相對豐度，可以看出酵母綱在3 種模式中的相對豐度排序為Car ＞ Cam amp; Car ＞ Cam，糞殼菌綱和傘菌綱在3 種模式中的相對豐度排序均為Cam amp; Car ＞ Cam ＞ Car。

從圖4 可以看出，屬分類水平上主要包括Wickerhamomyces、Saccharomyces、Hyphopichia、Desmazierella、Cladosporium 等，且均在Cam amp; Car間作模式中相對豐度較高。其中Wickerhamomyces相對豐度最高，為各處理中的優(yōu)勢菌屬。從圖5 可以看出，種分類水平上主要包括Wickerhamomycesanomalus、Thozetella lithocarpi、Hyphopichiaburtonii、Rhexodenticula acaciae、Desmazierellaacicola、Aspergillus flavus、Pichia cephalocereana、Issatchenkia orientalis， 其中Wickerhamomyces anomalus 相對豐度最高，為各處理中的優(yōu)勢菌種，但它在3 種模式間無顯著性差異。

2.4 Alpha 多樣性分析

對3 種模式土壤真菌的Alpha 多樣性指數(shù)進行ANOVA 分析，結(jié)果見表2。對于ACE 指數(shù)，3種模式間存在顯著差異，其中Car 單作模式最高，其次是Cam amp; Car 間作模式，Cam 單作模式最低，說明Car 單作模式土壤中真菌多度較高，真菌數(shù)量更多。對于Shannon 指數(shù)和Simpson 指數(shù)，Cam amp;Car 間作模式Shannon 指數(shù)略高，Simpson 指數(shù)介于兩種模式之間，但3 種模式間沒有顯著性差異，說明各模式中真菌物種組成的多樣性和均勻度略有不同，但差異不顯著。

2.5 Beta 多樣性分析

基于Bray-Curtis 距離對土壤真菌群落組成進行主坐標PcoA（Principal co-ordinates analysis）分析。從圖6 可以看出，主成分1 的解釋率為47.23%。在主成分1 負方向上，包含Car 單作模式、Cam amp;Car 間作模式的全部和Cam 單作模式少部；在主成分1 正方向上，包含Car 單作模式大部。主成分2的解釋率為23.96%，在主成分2 負方向上，包含Cam 單作模式大部和Car 單作模式少部；在主成分2 正方向上，包含Cam amp; Car 間作模式全部、Car單作模式大部和Cam 單作模式少部。兩主成分累計解釋率為71.19%。在兩個主成分組成的四個象限中，Car 單作模式分布在四個象限，Cam 單作模式處于第一、三象限，Cam amp; Car 間作模式分布第一象限，其與Car 單作模式和Cam 單作模式均有交集，其中與Cam 單作模式交集較多，說明其與Cam 單作模式下土壤真菌的多樣性和組成更加相似。

2.6 優(yōu)勢菌屬與環(huán)境因子的關(guān)聯(lián)分析

土壤因子之間、優(yōu)勢菌屬與土壤因子之間，以及優(yōu)勢菌屬與土壤因子之間的相關(guān)性，通過Pearson 相關(guān)系數(shù)制成Heatmap 圖（圖7）。從圖7 中可以看出，ECa 含量、AK 含量、AS 含量之間存在顯著性正相關(guān)（P ＜ 0.05），屬水平主要真菌多樣性多存在顯著正相關(guān)關(guān)系（P ＜ 0.05）。屬水平主要真菌與土壤環(huán)境存在相關(guān)關(guān)系，其中與ECa 含量、AK 含量、AS 含量間存在顯著性負相關(guān)（P ＜ 0.05））。

3 討論

間作能提高作物產(chǎn)量，而且能充分利用地上光源和地下水分、養(yǎng)分資源[26]，但因作物類型存在不一致性[27]，農(nóng)作物- 農(nóng)作物[28]、果樹- 農(nóng)作物[29] 間作模式中多存在養(yǎng)分競爭關(guān)系，而果樹-草[30] 間作模式則提高了土壤養(yǎng)分含量，改善了果實品質(zhì)。本研究中，油茶與薄殼山核桃間作9 年后土壤中水解氮、有效磷、有機質(zhì)含量顯著高于Car 單作模式，低于Cam 單作模式，而土壤中有效鉀、有效硫、交換性鈣含量顯著低于Cam 單作模式和Car 單作模式，說明油茶和薄殼山核桃間作存在一定程度的養(yǎng)分競爭關(guān)系。這與前人在橡膠林間作木薯的結(jié)果[7] 一致。

眾多研究表明，間作普遍提高了土壤酶活性和微生物多樣性[31-32]。本研究中除脲酶外，間作模式土壤酶活性顯著高于薄殼山核桃單作模式（P ＜ 0.05），略高于油茶單作模式，但沒有顯著性差異，與前人研究不完全一致。有研究認為，微生物多樣性與酶活性密切相關(guān)[33]，本研究Heatmap 分析表明，微生物多樣性與土壤中交換性鈣、有效鉀、有效硫含量顯著相關(guān)（P ＜ 0.05），而與酶活性沒有顯著相關(guān)關(guān)系，這與前人研究不完全一致。土壤微生物活性和酶活性與土壤供水能力有顯著的關(guān)系[34]，本研究中油茶栽培密度為2 m×3 m，薄殼山核桃栽培密度為6 m×8 m，較高的栽植密度使得土壤能夠保持較高的水分含量，這可能是油茶單作和間作模式土壤微生物多樣性相似、酶活性較高的原因。

值得一提的是，間作是個復雜的系統(tǒng)，作物之間的競爭關(guān)系可能隨著時空的變化而發(fā)生變化[35-36]。隨著樹齡的增加，林地枯落物增多，林地理化性質(zhì)也可能發(fā)生變化[24]，油茶和薄殼山核桃間作效益還有待于跟蹤研究。另外，油茶和薄殼山核桃間作模式下地上光能的競爭也是值得研究的問題。

4 結(jié)論

1）油茶和薄殼山核桃間作9 年后，未改變土壤物理性質(zhì)，但改變了土壤化學性質(zhì)，顯著增大了林地土壤有效鉀、有效硫、交換性鈣的消耗，提升了土壤蔗糖酶、酸性磷酸酶、過氧化物酶活性。

2）油茶和薄殼山核桃間作9 年后，提升了土壤真菌優(yōu)勢菌綱中真菌糞殼菌綱和傘菌綱的相對豐度，群落多樣性與油茶純林模式更為接近，但對真菌多樣性和均勻度影響不顯著。真菌群落主要菌屬多樣性與土壤中ECa 含量、AK 含量、AS含量存在顯著性正相關(guān)關(guān)系。

綜上，油茶與薄殼山核桃間作9 年后，增大了土壤養(yǎng)分消耗，提升了薄殼山核桃根系土壤酶活性和微生物多樣性，但差異不顯著。因此，建議油茶和薄殼山核桃間作時，加大肥力管理，特別是鈣、鉀和硫的投入。

[本文編校：謝榮秀]