關(guān)鍵詞：華中櫻；葉綠體基因組；SSR；InDel

中圖分類(lèi)號(hào)：S718.43 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：1673-923X（2024）01-0175-10

華中櫻Prunus conradinae屬于薔薇科Rosaceae李屬Prunus 櫻亞屬Subg. Cerasus，是原產(chǎn)于我國(guó)中部和南部的野生櫻花，生長(zhǎng)于海拔500 ～ 2 600 m的溝邊林中[1]。華中櫻為高大喬木，樹(shù)形寬卵狀，樹(shù)皮灰褐色，花先葉開(kāi)放，花色粉紅或白色，傘形花序，萼筒形狀似鐘形，花期通常是3 月上中旬，花量巨大，具有很高的園林觀賞價(jià)值[2]，華中櫻野生資源豐富，遺傳多樣性較高，具有較大的開(kāi)發(fā)利用潛力[3-4]。

葉綠體作為綠色植物生命活動(dòng)的代謝中心，是光合作用和生物合成的關(guān)鍵場(chǎng)所，主要存在于綠色植物的各種器官中，在植物細(xì)胞內(nèi)遺傳物質(zhì)獨(dú)立且具有半自主性[5]。葉綠體基因組具有保守的四分體結(jié)構(gòu)，由大單拷貝區(qū)（Large single copy，LSC）、2 個(gè)反向重復(fù)區(qū)（Inverted repeat，IR）和小單拷貝區(qū)（Small single copy，SSC）組成[6]。葉綠體基因組具有規(guī)模小、拷貝數(shù)多、結(jié)構(gòu)穩(wěn)定、序列高度保守、遺傳重組率低和普遍母系遺傳等特點(diǎn)[7]，已被廣泛地應(yīng)用于DNA 條形碼開(kāi)發(fā)、物種鑒定、物種演化和系統(tǒng)發(fā)育等方面的研究[8]。

目前，華中櫻相關(guān)研究主要涉及無(wú)性繁殖技術(shù)、引種馴化及群落構(gòu)成等方面[9-10]，分子生物學(xué)等方面鮮有研究，且華中櫻葉綠體基因組序列特征尚未見(jiàn)報(bào)道，一定程度上制約了華中櫻葉綠體分子標(biāo)記的開(kāi)發(fā)與應(yīng)用。本研究以華中櫻總DNA為材料，在高通量測(cè)序的基礎(chǔ)上，分離、組裝葉綠體基因組，并對(duì)其序列結(jié)構(gòu)、基因組成、簡(jiǎn)單重復(fù)序列（Simple sequence repeat，SSR）、單核苷酸多態(tài)性（Single nucleotide polymorphisms，SNP） 和插入/ 缺失變異（Insertion/deletion，InDel）及密碼子偏好性進(jìn)行分析，挖掘、開(kāi)發(fā)葉綠體基因組分子標(biāo)記，為開(kāi)展譜系地理學(xué)、群體遺傳學(xué)和種間雜種鑒定等研究提供參考。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

采集健康的華中櫻嫩片，液氮速凍后置于-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 總DNA 提取

應(yīng)用植物DNA提取試劑盒（TIANGEN，北京）提取總DNA，具體方法參照說(shuō)明書(shū)，采用1% 瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA 的質(zhì)量，滿(mǎn)足高通量測(cè)序要求的DNA 送南京集思慧遠(yuǎn)生物科技有限公司進(jìn)行測(cè)序。其余稀釋到50 ng/μL，分裝凍存待用。

1.2.2 文庫(kù)構(gòu)建及測(cè)序

檢測(cè)基因組DNA 合格后，用超聲波將DNA片段化，然后進(jìn)行片段純化、末端修復(fù)、3′ 端加A、連接測(cè)序接頭，再利用瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行片段大小的選擇，進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，形成測(cè)序文庫(kù)，建好的文庫(kù)需進(jìn)行文庫(kù)質(zhì)檢[11]。質(zhì)檢合格的文庫(kù)用Illumina NovaSeq 平臺(tái)進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序讀長(zhǎng)為PE150。

1.2.3 葉綠體基因組組裝及注釋

原始序列采用fastp 軟件過(guò)濾， 去除reads中的測(cè)序接頭以及引物序列，過(guò)濾掉平均質(zhì)量值小于Q5 和N 個(gè)數(shù)大于5 的reads， 對(duì)獲得的clean reads 進(jìn)行組裝[12]。應(yīng)用SPAdes 3.10.1 軟件組裝葉綠體基因組[13]，K-mer 分別設(shè)置為55、87、121， 以櫻桃Prunus pseudocerasus 葉綠體基因組序列（GenBank 登錄號(hào)為KX255667.1）作為參考序列進(jìn)行組裝序列的對(duì)比和校正。應(yīng)用prodigal v2.6.3 軟件（https：//www.github.com/hyattpd/Prodigal）注釋葉綠體的基因編碼區(qū)（Codingsequence，CDS）， 分別應(yīng)用hmmer v3.1b2（http：//www.hmmer.org/） 和aragorn v1.2.38 軟件（http：//130.235.244.92/ARAGORN/） 預(yù)測(cè)rRNA和tRNA。參照NCBI 上已經(jīng)公布的近緣物種序列，提取其葉綠體基因序列，應(yīng)用blast v2.6軟件（https：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）比對(duì)組裝的序列，得到初步的注釋結(jié)果，然后檢查有差別的基因，去除錯(cuò)誤的注釋及冗余的注釋?zhuān)_定多外顯子邊界，獲得最終的注釋結(jié)果。葉綠體基因組圖譜應(yīng)用OGDRAW（http：//chlorobox.mpimp-golm.mpg.de/OGDraw.html）軟件進(jìn)行繪制。

1.2.4 SSR 位點(diǎn)挖掘

應(yīng)用MISA v1.0（http：//pgrc.ipk-gatersleben.de/misa/misa.html）在線(xiàn)工具鑒定簡(jiǎn)單重復(fù)序列，參數(shù)設(shè)置為單核苷酸重復(fù)8 次及以上，二核苷酸重復(fù)5 次及以上，其他類(lèi)型重復(fù)3 次及以上。

1.2.5 SNP 與InDel 位點(diǎn)鑒定

從NCBI 數(shù)據(jù)庫(kù)下載26 個(gè)櫻亞屬物種的葉綠體基因組序列，應(yīng)用DNAMAN 軟件與華中櫻葉綠體基因組進(jìn)行多重比對(duì)，檢索華中櫻特有的SNP 和InDel 位點(diǎn)（表1）。

1.2.6 密碼子偏好性分析

應(yīng)用Codon W1.4.2（http：//codonw.sourceforge.net/）和EMBOSS（http：//emboss. toulouse. inra.fr/）的cusp 軟件分析華中櫻葉綠體基因組中基因的相對(duì)同義密碼子使用度（Relative synonymous codonusage，RSCU）。RSCU 為密碼子的實(shí)際使用頻率與該密碼子的理論使用頻率的比值，RSCU ＞ 1 表示該密碼子使用率較高，RSCU=1 表示該密碼子無(wú)偏好性，RSCU＜ 1 表示該密碼子使用率較低[14]。

2 結(jié)果與分析

2.1 華中櫻葉綠體基因組的基本特征

華中櫻葉綠體基因組為典型的環(huán)狀雙鏈四分體結(jié)構(gòu)，全長(zhǎng)158 019 bp，包括1 個(gè)小單拷貝片段（SSC，19 247 bp）、1 個(gè)大單拷貝片段（LSC，85 910 bp） 和1 對(duì)反向重復(fù)序列（IRa 和IRb，52 862 bp）（圖1）。華中櫻葉綠體基因組的總GC 含量為36.70%，IR 區(qū)的GC 含量為42.53%，高于LSC 區(qū)（34.60%）及SSC 區(qū)（30.06%）（表2）。華中櫻葉綠體基因組一共注釋到130 個(gè)基因，包括85 個(gè)蛋白編碼基因、37 個(gè)tRNA 基因和8 個(gè)rRNA 基因（表3）。按照功能可將這130 個(gè)葉綠體基因分為4 類(lèi)：psaA、psaB、psaC、psaI 和psaJ等45 個(gè)與光合作用相關(guān)的基因；rpl14、rpl16、rpl2、rpl20 和rpl22 等75 個(gè)與自我復(fù)制相關(guān)的基因；matK、clpP 和cemA 等5 個(gè)其他基因以及ycf1、ycf2、ycf3 和ycf4 等5 個(gè)功能尚未探明的基因。

2.2 葉綠體基因組簡(jiǎn)單重復(fù)序列分析

華中櫻基因組SSR 重復(fù)序列共240 個(gè)（表4），主要由A 或T 堿基組成，其中單核苷酸重復(fù)序列153 個(gè)，二核苷酸重復(fù)序列12 個(gè)，三核苷酸重復(fù)序列63 個(gè)，四核苷酸重復(fù)序列11 個(gè)，六核苷酸重復(fù)序列1 個(gè)。在不同類(lèi)型的重復(fù)基序中，A/T、ATA/TAT 出現(xiàn)的頻率最高，分別占重復(fù)基序總數(shù)的80.94% 和2.42%，其余重復(fù)基序發(fā)生頻率均較低，不超過(guò)2.04%，最低為0.16%。

2.3 SNP 與InDel 位點(diǎn)分析

通過(guò)華中櫻與其他26 種櫻亞屬植物葉綠體基因組的多重比對(duì)，鑒定了37 個(gè)華中櫻特有的核酸多態(tài)性位點(diǎn)，其中SNP 位點(diǎn)29 個(gè)，InDel 位點(diǎn)8 個(gè)（表5）。InDel 位點(diǎn)的插入與缺失片段大小范圍為4 ～ 21 bp，其中堿基插入位點(diǎn)占62.5%，堿基缺失位點(diǎn)占37.5%。29 個(gè)SNP 位點(diǎn)的堿基異變以A/T 為主，占總數(shù)的62.07%。

2.4 密碼子偏好性分析

華中櫻葉綠體基因組含有66 種密碼子（包含終止密碼子），編碼21 種氨基酸，編碼氨基酸的總密碼子數(shù)為26 490 個(gè)。在所有被編碼的氨基酸中，精氨酸Arg、絲氨酸Ser 和亮氨酸Leu 出現(xiàn)頻率最高。相對(duì)同義密碼子使用度（RSCU）分析表明，在所有被編碼的密碼子中，RSCU ＞ 1 的密碼子共有32 個(gè)（UGG、GCA、CCA 等）， 其中29 個(gè)密碼子以A/U 堿基結(jié)尾，以A 結(jié)尾的占44.83%，以U 結(jié)尾的占55.17%，具有A/U 偏好性。RSCU ＜ 1 的密碼子共有34 個(gè)（GUG、UUG、CUC 等），以G/C 結(jié)尾的共有31 個(gè)，以G 結(jié)尾的占48.39%，以C 結(jié)尾的占51.61%（表6）。

3 討論與結(jié)論

3.1 討論

華中櫻為中國(guó)特有的李屬櫻亞屬植物，分布范圍跨度廣，是一種觀賞價(jià)值較高、遺傳多樣性豐富的野生櫻花，具有較大的開(kāi)發(fā)利用潛力[3-4]。近年來(lái)，研究者們已從華中櫻野生資源中選育了一系列優(yōu)良單株或新品種[15-16]。目前，應(yīng)用分子標(biāo)記技術(shù)研究華中櫻遺傳多樣性的報(bào)道較少，僅見(jiàn)嚴(yán)佳文等[4] 基于核糖體基因轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（Internaltranscribed spacer，ITS）序列分析了湖南省華中櫻的群體遺傳結(jié)構(gòu)和多樣性，葉綠體基因序列在華中櫻遺傳多樣性研究方面的應(yīng)用還未見(jiàn)報(bào)道。

葉綠體基因組序列和基因結(jié)構(gòu)較為保守，大量葉綠體基因組數(shù)據(jù)被應(yīng)用在植物系統(tǒng)發(fā)育等研究領(lǐng)域[17]。本研究結(jié)果表明，華中櫻與其他櫻亞屬植物的葉綠體基因組相似，是典型的環(huán)狀四分體結(jié)構(gòu)，由1 個(gè)SSC 區(qū)、1 個(gè)LSC 區(qū)和一對(duì)反向重復(fù)序列IR 區(qū)（IRa 和IRb）組成，這與大多數(shù)被子植物的葉綠體基因組結(jié)構(gòu)相似[18]。通過(guò)比較華中櫻與其他26 個(gè)不同櫻亞屬植物葉綠體基因組序列發(fā)現(xiàn)，其大小在156 ～ 159 kb 之間，介于被子植物葉綠體120 ～ 180 kb 的范圍內(nèi)[19]，其基因組大小與七里香薔薇Rosa banksias var. noroalis（156 544 bp）、長(zhǎng)柄扁桃Amygdalus pedunculata（157 851 bp）和中國(guó)草莓Fragaria chinensis（155 627 bp）等薔薇科植物的葉綠體基因組大小相近，說(shuō)明屬間基因組大小具有一定的穩(wěn)定性[20-22]。華中櫻葉綠體基因組共注釋了130 個(gè)基因，所編碼的基因類(lèi)別、數(shù)量及排列順序等與其他被子植物差異不大，同時(shí)具有高度相似的GC 含量[23]。

SSR 標(biāo)記具有共顯性、多態(tài)性高、穩(wěn)定性好、操作簡(jiǎn)便等優(yōu)點(diǎn)，已被廣泛應(yīng)用于遺傳多樣性、親緣關(guān)系分析等研究領(lǐng)域[24]，可用于推斷物種間的遺傳距離、種群結(jié)構(gòu)和進(jìn)化關(guān)系等[25]。華中櫻葉綠體基因組序列的SSR 位點(diǎn)共有240 個(gè)，出現(xiàn)頻率最高的為單核苷酸重復(fù)，占總SSR 總數(shù)的82.92%，以A/T 重復(fù)基序數(shù)量最多，SSR 位點(diǎn)數(shù)量看似與其他高等植物差別較大，遠(yuǎn)多于藿香葉綠絨蒿（34 個(gè)）[26]、多齒紅山茶（52 個(gè)）[27] 和黃金寶樹(shù)（62 個(gè)）[28] 等物種，實(shí)則是因?yàn)椴煌锓N鑒定SSR 位點(diǎn)時(shí)，軟件設(shè)置參數(shù)不完全一致，如藿香葉綠絨蒿SSR 鑒定設(shè)置的單核苷酸到六核苷酸的重復(fù)次數(shù)分別為10、5、4、3、3 和3，多齒紅山茶設(shè)置的是10、6、5、5、5、5，黃金寶樹(shù)設(shè)置的是10、5、4、4、4，而本研究設(shè)置的參數(shù)是8、5、3、3、3、3。

葉綠體InDel 和SNP 標(biāo)記已成功應(yīng)用于物種鑒定、遺傳多樣性分析和品種真實(shí)性溯源等方面。王蕊等[29] 利用InDel 標(biāo)記對(duì)中國(guó)主要玉米品種的正反交子代進(jìn)行鑒定，僅需要一個(gè)標(biāo)記就可以分別鑒定其正反交后代，可作為核基因組檢測(cè)的補(bǔ)充，進(jìn)一步完善品種真實(shí)性及品系溯源信息。蘭青闊等[30] 對(duì)貝母屬15 種植物28 條葉綠體基因組序列進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)貝母屬葉綠體基因組DNA同源性可達(dá)97.22%，通過(guò)分析共發(fā)掘SNP 位點(diǎn)5 879 個(gè)，這些SNP 位點(diǎn)可應(yīng)用于精準(zhǔn)鑒定、精確定量，為川貝母中藥資源鑒定提供技術(shù)支撐。Fang 等[31] 通過(guò)比較黃麻Corchorus capsularis 和長(zhǎng)果黃麻C. olitorius 的葉綠體基因組序列，鑒定了1個(gè)黃麻種特異性InDel 標(biāo)記，可用于黃麻屬物種之間的系統(tǒng)發(fā)育研究。

密碼子偏好性是指選擇性地使用核苷酸三聯(lián)體在一個(gè)物種的蛋白質(zhì)編碼基因中編碼特定的氨基酸序列[32]，不同物種之間密碼子偏好會(huì)存在很大差異，在某些情況下，同一物種基因組的不同區(qū)域之間也會(huì)存在差異[33]。DNA 的堿基構(gòu)成對(duì)密碼子的使用偏性有重要影響，其中第三位堿基的變化不會(huì)改變氨基酸的性質(zhì)，是研究密碼子偏好性的重要依據(jù)[34]。本研究統(tǒng)計(jì)了華中櫻葉綠體基因組的密碼子，并通過(guò)計(jì)算相對(duì)同義密碼子使用度（RCSU）來(lái)評(píng)估其密碼子的使用偏好，在RSCU ＞ 1 的32 個(gè)密碼子中，有29 個(gè)以A/U 結(jié)尾，表明華中櫻葉綠體基因組偏好使用A/U 結(jié)尾的密碼子，與黃丹木姜子[35]、樟[36] 和毛籽紅山茶[37]等物種較為一致，可能與葉綠體基因組較低的GC含量有關(guān)，即密碼子偏好性可能受基因組GC 含量的影響。

本研究從華中櫻葉綠體基因組序列中挖掘了240 個(gè)SSR 位點(diǎn)、29 個(gè)華中櫻種特異性SNP 位點(diǎn)和8 個(gè)InDel 位點(diǎn)，可能在華中櫻群體遺傳多樣性、譜系地理學(xué)等研究領(lǐng)域具有一定的應(yīng)用潛力，但未開(kāi)展驗(yàn)證試驗(yàn)。下一步需要針對(duì)種質(zhì)資源基因分型、遺傳多樣性分析和雜交品種鑒定等具體研究?jī)?nèi)容進(jìn)行篩選和評(píng)估，為華中櫻種質(zhì)資源和遺傳育種研究提供可靠的分子標(biāo)記，為建立櫻亞屬植物分子標(biāo)記輔助育種體系提供參考。

3.2 結(jié)論

本研究組裝了華中櫻的葉綠體基因組序列，分析了基因組特征和密碼子偏好性，挖掘了一批SSR、SNP 和InDel 標(biāo)記，為華中櫻種質(zhì)資源的基因分型和遺傳多樣性研究提供了潛在的分子標(biāo)記。

[ 本文編校：謝榮秀]