[摘要]"目的"探討消脂合劑調(diào)節(jié)磷脂酰肌醇3激酶（phosphoinositide"3-kinase，PI3K）/蛋白激酶B（protein"kinase"B，Akt）/哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白（mammalian"target"of"rapamycin，mTOR）信號(hào)通路對(duì)肥胖小鼠糖脂代謝的影響。方法"將造模成功的肥胖小鼠50只隨機(jī)分為5組，即模型組（蒸餾水）、低劑量組（3.5ml/kg消脂合劑）、中劑量組（7ml/kg消脂合劑）、高劑量組（14ml/kg消脂合劑）、陽(yáng)性藥組（30mg/kg吡格列），每組各10只；未經(jīng)高脂造模的小鼠10只納入正常組（蒸餾水），干預(yù)6周。觀察各組小鼠干預(yù)后的Lee’s指數(shù)、體質(zhì)量、腹圍、糖脂代謝水平[空腹血糖（fasting"blood"glucose，F(xiàn)BG）、空腹胰島素（fasting"insulin，F(xiàn)INS）、三酰甘油（triglyceride，TG）、總膽固醇（total"cholesterol，TC）、游離脂肪酸（free"fatty"acids，F(xiàn)FA）]、肝臟組織病理學(xué)，檢測(cè)各組織中過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體（peroxisome"proliferator-activated"receptor，PPARγ）、mTOR、PI3K、Akt蛋白及mRNA表達(dá)。結(jié)果"與模型組比較，消脂合劑呈劑量依賴性降低小鼠的Lee’s指數(shù)、體質(zhì)量、腹圍、FBG、FINS、TC、TG、FFA（Plt;0.05）；陽(yáng)性藥組具有相同作用（Plt;0.05）。肝臟組織病理結(jié)果顯示，與模型組比較，各給藥組小鼠肝細(xì)胞脂肪變性和空泡化明顯減少。與模型組比較，消脂合劑呈劑量依賴性升高PPARγ、mTOR、PI3K、Akt的蛋白和mRNA表達(dá)水平（Plt;0.05），陽(yáng)性藥組具有相同作用（Plt;0.05）。消脂合劑各劑量組之間以高劑量組療效最佳，低劑量組最差（Plt;0.05）。結(jié)論"消脂合劑可調(diào)節(jié)肥胖小鼠的糖脂代謝，呈劑量遞增效果，其機(jī)制可能與調(diào)節(jié)PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路上調(diào)PPARγ水平有關(guān)。

[關(guān)鍵詞]"肥胖；消脂合劑；PPARγ；PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路

[中圖分類(lèi)號(hào)]"R589""""""[文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼]"A""""""[DOI]"10.3969/j.issn.1673-9701.2024.07.017

Xiaozhi"mixture"regulates"PI3K/Akt/mTOR"signaling"pathway"on"glucose"and"lipid"metabolism"in"obese"mice

CHEN"Lujia，"LIU"Hongfei，"DENG"Yanhua，"ZHOU"Jianyang

Department"of"Zhiweibing，Ningbo"Hospital"of"TCM"Affiliated"to"Zhejiang"Chinese"Medical"University，"Ningbo"315010，"Zhejiang，"China

[Abstract]"Objective"To"investigate"the"effects"of"Xiaozhi"mixture"on"glucose"and"lipid"metabolism"in"obese"mice"by"regulating"phosphoinositide"3-kinase"（PI3K）/"protein"kinase"B"（Akt）/"mammalian"target"of"rapamycin"（mTOR）"signaling"pathway."Methods"Fifty"obese"mice"with"successful"modeling"were"randomly"divided"into"five"groups："model"group"（distilled"water），"low-dose"group"（3.5ml/kg"Xiaozhi"mixture），"medium-dose"group"（7ml/kg"Xiaozhi"mixture），"high-dose"group"（14ml/kg"Xiaozhi"mixture）"and"positive"drug"group"（30mg/kg"pioglitazone），"with"10"mice"in"each"group."Ten"mice"without"high"fat"modeling"were"included"in"normal"group"（distilled"water）."All"groups"were"intervened"for"6"weeks."Lee’s"index，"body"weight，"abdominal"circumference，"glucose"and"lipid"metabolism"level"[fasting"blood"glucose"（FBG），"fasting"insulin"（FINS），"triglyceride"（TG），"total"cholesterol，"（TC），"free"fatty"acids"（FFA）]，"liver"histopathology"of"each"group"of"mice"after"intervention"were"observed，"and"mRNA"and"protein"expression"of"peroxisome"proliferator-activated"receptor"（PPARγ），"mTOR，"PI3K，"Akt"in"each"tissue"were"detected."Results"Compared"with"model"group，"Xiaozhi"mixture"decreased"Lee’s"index，"body"weight，"abdominal"circumference，"FBG，"FINS，"TC，"TG"and"FFA"in"a"dose-dependent"manner"（Plt;0.05），"and"positive"drug"group"had"the"same"effects"（Plt;0.05）."The"histopathological"results"of"liver"showed"that"compared"with"the"model"group，"the"steatosis"and"vacuolation"of"hepatocytes"in"each"administration"group"were"significantly"reduced."Compared"with"model"group，"Xiaozhi"mixture"increased"the"protein"and"mRNA"expression"levels"of"PPARγ，"mTOR，"PI3K"and"Akt"in"a"dose-dependent"manner"（Plt;0.05），"and"positive"drug"group"had"the"same"effect"（Plt;0.05）."Among"the"dose"groups"of"Xiaozhi"mixture，"high-dose"group"had"the"best"effect，"and"low-dose"group"had"the"least"effect"（Plt;0.05）."Conclusion"Xiaozhi"mixture"can"regulate"glucose"and"lipid"metabolism"in"obese"mice"in"a"dose-increasing"manner，"and"the"mechanism"may"be"related"to"regulating"PI3K/Akt/mTOR"signaling"pathway"to"up-regulate"PPARγ"levels.

[Key"words]"Obesity;"Xiaozhi"mixture;"PPARγ;"PI3K/Akt/mTOR"signaling"pathway

研究表明，肥胖與代謝性疾病的發(fā)生密切相關(guān)，尤其是腹型肥胖，可導(dǎo)致高血壓、糖尿病、高脂血癥、動(dòng)脈硬化、嚴(yán)重心血管事件的發(fā)生及惡化。肥胖癥的發(fā)生由機(jī)體能量代謝失衡所引起，過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體（peroxisome"proliferator-activated"receptor，PPARγ）是脂肪生成和脂肪組織發(fā)育過(guò)程中的一個(gè)關(guān)鍵調(diào)控因子，在糖脂代謝、胰島素敏感性、動(dòng)脈粥樣硬化、炎癥反應(yīng)和免疫反應(yīng)等多種生物學(xué)過(guò)程中發(fā)揮重要作用[1]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，消脂合劑可改善患者的體質(zhì)量及糖脂代謝指標(biāo)，并通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)其對(duì)胰島素敏感性等有較好的干預(yù)效果。為深入探討消脂合劑干預(yù)肥胖癥糖脂代謝的作用機(jī)制，本研究以PPARγ為切入點(diǎn)，通過(guò)闡明其與磷脂酰肌醇3激酶（phosphoinositide"3-kinase，PI3K）/蛋白激酶B（protein"kinase"B，Akt）/哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白（mammalian"target"of"rapamycin，mTOR）信號(hào)通路的關(guān)系，為消脂合劑更好地應(yīng)用于臨床治療肥胖癥提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1""材料與方法

1.1""實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)雄性C57BL/6J小鼠80只，體質(zhì)量（20±2）g，由杭州醫(yī)學(xué)院提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（浙）2019-0002。小鼠飼養(yǎng)于浙江省中醫(yī)藥研究院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，溫度（22±2）℃，濕度50%～60%，12h晝夜節(jié)律飼養(yǎng)，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào)：SYXK（浙）2019-0010。

1.2nbsp;"藥物與試劑

消脂合劑組方：生黃芪30g、葛根30g、蒼術(shù)20g、絞股藍(lán)20g、薏苡仁30g、茯苓20g、紅景天20g、紅曲10g、荷葉10g。將消脂合劑全方藥材粉碎成粗粉，8倍水煎煮2次，每次1h，合并濾液，調(diào)整pH值至中性，濃縮定容至1L，制成生藥濃度4g/ml的濃縮液，–20℃保存?zhèn)溆?，由寧波市中醫(yī)院提供。鹽酸吡格列片，國(guó)藥準(zhǔn)字H20050500，杭州中美華東制藥有限公司生產(chǎn)。

1.3""動(dòng)物分組及模型制備

1.3.1""模型制備""常規(guī)飼料適應(yīng)性喂養(yǎng)2周后分組，小鼠隨機(jī)分為正常組（10只）和造模組（70只）。造模組小鼠予45%高脂飼料喂養(yǎng)（35%碳水化合物，20%蛋白質(zhì)和45%脂肪），持續(xù)12周。12周后，篩選出50只作為成模小鼠（體質(zhì)量gt;正常組平均體質(zhì)量+2SD，且Lee’s指數(shù)顯著高于正常組定義為肥胖小鼠）。

1.3.2""分組和給藥""將造模成功的肥胖小鼠50只隨機(jī)分為5組，即模型組、低劑量組（3.5ml/kg消脂合劑）、中劑量組（7ml/kg消脂合劑）、高劑量組（14ml/kg消脂合劑）、陽(yáng)性藥組（30mg/ml吡格列酮），每組10只，3個(gè)藥物組小鼠分別給予相應(yīng)劑量的消脂合劑灌胃，陽(yáng)性藥組小鼠予10ml吡格列水溶液灌胃。模型組和正常組小鼠予蒸餾水10ml/kg灌胃。6組小鼠每日早8：00給藥1次，連續(xù)給藥6周，每周稱重。正常組以普通飼料喂養(yǎng)，其他組仍以高脂飼料喂養(yǎng)。

1.4""檢測(cè)指標(biāo)

1.4.1""實(shí)驗(yàn)動(dòng)物行為及體征觀察""觀察實(shí)驗(yàn)小鼠的活動(dòng)、進(jìn)食、精神狀態(tài)，稱量造模后各組小鼠的體質(zhì)量及給藥6周后體質(zhì)量、腹圍，并計(jì)算給藥6周后Lee’s指數(shù)[Lee’s指數(shù)=（末次體質(zhì)量×1000）×1/3體長(zhǎng)]、飼料消耗量。

1.4.2""各組小鼠糖脂代謝水平""給藥6周后各組小鼠均斷頭采血測(cè)定空腹血糖（fasting"blood"glucose，F(xiàn)BG）、空腹胰島素（fasting"insulin，F(xiàn)INS）、三酰甘油（triglyceride，TG）、總膽固醇（total"cholesterol，TC）、游離脂肪酸（free"fatty"acids，F(xiàn)FA）水平。

1.4.3""蘇木精-伊紅染色觀察肝臟組織變化""10%中性福爾馬林溶液固定的脂肪組織，石蠟包埋，4μm連續(xù)切片，常規(guī)蘇木精-伊紅染色（hematoxylin"and"eosin"staining，HE染色），中性樹(shù)膠封片，顯微鏡下觀察肝臟組織的形態(tài)學(xué)改變。

1.4.4""反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)檢測(cè)各組織中相關(guān)mRNA表達(dá)""處死小鼠后，取皮下脂肪、內(nèi)臟脂肪、肝臟等組織，Trizol法提取總RNA，按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)和實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)檢測(cè)PPARγ、mTOR、PI3K、Akt的mRNA表達(dá)。

1.4.5""蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)相關(guān)蛋白表達(dá)""取各組上述脂肪組織制備蛋白樣品，用BCA法測(cè)定蛋白濃度，蛋白質(zhì)印跡技術(shù)檢測(cè)PPARγ、mTOR、PI3K、Akt蛋白表達(dá)。

1.5""統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS"22.0統(tǒng)計(jì)軟件處理數(shù)據(jù)。符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，非正態(tài)分布的計(jì)量資料行對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)換后表示為均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）再進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，兩組間計(jì)量資料比較采用t檢驗(yàn)，多組間比較采用方差分析。Plt;0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2""結(jié)果

2.1""實(shí)驗(yàn)動(dòng)物行為及體征觀察

各組小鼠的精神狀態(tài)良好，且皮毛光澤度好，造模組小鼠的體質(zhì)量增加較快。造模12周后，造模組小鼠的平均體質(zhì)量超過(guò)正常組平均體質(zhì)量的20%，且Lee’s指數(shù)顯著高于正常組（Plt;0.01），造模組小鼠的腹圍顯著大于正常組（Plt;0.01），提示肥胖小鼠造模成功。造模組小鼠的飼料消耗量顯著高于正常組（Plt;0.01），見(jiàn)表1。

治療開(kāi)始后，每周測(cè)量小鼠體質(zhì)量，給藥6周后，測(cè)量小鼠體長(zhǎng)、腹圍，并計(jì)算Lee’s指數(shù)。給藥1周至給藥結(jié)束后，模型組和低、中、高劑量組及陽(yáng)性藥組小鼠的體質(zhì)量均顯著高于正常組（Plt;0.01），見(jiàn)表2。給藥結(jié)束后，與正常組比較，模型組和低、中、高劑量組及陽(yáng)性藥組小鼠的Lee’s指數(shù)、體質(zhì)量、腹圍顯著升高（Plt;0.05）；與模型組比較，消脂合劑呈劑量依賴性降低小鼠Lee’s指數(shù)、體質(zhì)量、腹圍（Plt;0.05），陽(yáng)性藥組具有相同作用；與陽(yáng)性藥組比較，僅消脂合劑高劑量組小鼠的體質(zhì)量降低（Plt;0.05）。消脂合劑各劑量組之間以高劑量組療效最佳，低劑量組最差（Plt;0.05），見(jiàn)表3。

2.2""糖脂代謝水平檢測(cè)

給藥結(jié)束后，與正常組比較，模型組和低、中、高劑量組及陽(yáng)性藥組小鼠的FBG、FINS、TC、FFA均顯著升高（Plt;0.05），除模型組外，其余各組小鼠的TG無(wú)明顯差異（Pgt;0.05）；與模型組比較，消脂合劑呈劑量依賴性降低FBG、FINS、TC、TG、FFA（Plt;0.05），陽(yáng)性藥組具有相同降低作用（Plt;0.05）；與陽(yáng)性藥組比較，僅高劑量組小鼠的TC、TG無(wú)明顯差異（Pgt;0.05），余各組小鼠的FBG、FINS、TC、TG、FFA均顯著升高（Plt;0.05）。消脂合劑各劑量組之間以高劑量組療效最佳，低劑量組最差（Plt;0.05），見(jiàn)表4。

2.3""HE染色觀察肝臟組織的病理改變

HE染色結(jié)果顯示，正常組小鼠的肝臟組織結(jié)構(gòu)清晰，肝小葉結(jié)構(gòu)正常；模型組小鼠的肝臟組織可見(jiàn)大量肝細(xì)胞發(fā)生脂肪變性，且有大小不一的空泡化細(xì)胞；與模型組比較，各給藥組小鼠的肝細(xì)胞脂肪變性和空泡化明顯減少，見(jiàn)圖1。

2.4""各組小鼠肝臟組織中PPARγ、PI3K、Akt、mTOR的mRNA表達(dá)比較

與正常組比較，模型組和低、中、高劑量組小鼠的PPARγ、PI3K、Akt、mTOR的mRNA表達(dá)水平均顯著升高（Plt;0.05）；與模型組比較，消脂合劑呈劑量依賴性升高PPARγ、mTOR、PI3K、Akt的mRNA表達(dá)水平（Plt;0.05），陽(yáng)性藥組具有相同作用（Plt;0.05）；與陽(yáng)性藥組比較，除高劑量組小鼠的PPARγ"mRNA表達(dá)水平無(wú)明顯變化（Pgt;0.05），高劑量組小鼠的mTOR"mRNA水平表達(dá)顯著升高（Plt;0.05）外，其余各組小鼠的PPARγ、mTOR、PI3K、Akt的mRNA表達(dá)水平均顯著降低（Plt;0.05）。消脂合劑各劑量組以高劑量組療效最佳，低劑量組最差（Plt;0.05），見(jiàn)圖2。

2.5""各組小鼠肝臟組織中PPARγ、mTOR、PI3K、Akt蛋白表達(dá)比較

與正常組比較，模型組和低、中、高劑量組小鼠的PPARγ、PI3K、Akt、mTOR蛋白表達(dá)顯著升高（Plt;0.05）；與模型組比較，消脂合劑呈劑量依賴性上調(diào)PPARγ、mTOR、PI3K、Akt蛋白表達(dá)（Plt;0.05），陽(yáng)性藥組具有相同作用（Plt;0.05）；與陽(yáng)性藥組比較，除高劑量組PPARγ蛋白表達(dá)無(wú)明顯差異（Pgt;0.05）外，其余各組的PPARγ、PI3K、Akt、mTOR蛋白表達(dá)顯著降低（Plt;0.05）。消脂合劑各劑量組之間以高劑量組療效最佳，低劑量組最差（Plt;0.05），見(jiàn)圖3。

3""討論

中醫(yī)學(xué)對(duì)肥胖癥認(rèn)識(shí)已久，古籍對(duì)本病的記載有“肥人”“肥貴人”“肥白人”“膏人”“肉人”“肥胖”“肥滿”等，最早可追溯到《素問(wèn)·通評(píng)虛實(shí)論》“肥貴人，則責(zé)梁之疾也”?！鹅`樞·順逆肥瘦》亦提及其病因，“肥人……其為人也，貪于取與”，說(shuō)明不正確的飲食習(xí)慣，尤其對(duì)含脂肪、糖類(lèi)多的肥甘厚味攝取無(wú)度，脾的運(yùn)化受到影響，水谷精微不化精血而成膏脂痰濁，蓄積體內(nèi)，終成肥胖。又如《望診遵經(jīng)》中提及“富貴者，身體柔脆，肌膚肥白，緣處深閨廣廈之間，此居養(yǎng)不齊，作息無(wú)度者易致脂肥停積而成肥人”，說(shuō)明過(guò)逸少動(dòng)，久臥久坐，導(dǎo)致氣機(jī)壅滯，血脈不暢，脾氣運(yùn)化無(wú)力轉(zhuǎn)輸失調(diào)，若胃實(shí)脾虛者則能食而不消化，若脾虛濕滯者則濕邪滯留、痰濕內(nèi)生，兩者均可致食滯不運(yùn)而生肥胖?，F(xiàn)代中醫(yī)體質(zhì)學(xué)說(shuō)研究表明，痰濕質(zhì)、氣虛質(zhì)是超重和肥胖的主要體質(zhì)影響因素，且痰濕質(zhì)的危險(xiǎn)度高于氣虛質(zhì)[2]。

根據(jù)《素問(wèn)·經(jīng)脈別論》“食氣入胃，濁氣歸心，淫精于脈。脈氣流經(jīng)，經(jīng)氣歸于肺，肺朝百脈，輸精于皮毛……飲入于胃，游溢精氣，上輸于脾，脾氣散精，上歸于肺，通調(diào)水道，下輸膀胱，水精四布，五經(jīng)并行”的人體代謝機(jī)制，總結(jié)出代謝疾病的主要發(fā)病機(jī)制：脾氣不升為本，痰濁內(nèi)生為標(biāo)。認(rèn)為飲食過(guò)甚則傷脾，脾氣虛不能健運(yùn)散精，谷氣（血糖、血脂等精微物質(zhì)）留于血脈之中，化生痰濁，進(jìn)而聚集于體內(nèi)而成肥胖。故脾（氣）虛不運(yùn)、痰濁內(nèi)生是此類(lèi)疾病發(fā)生的重要原因，即所謂“氣澀以遲”是“肥貴人則高粱之疾”的病機(jī)所在。

本研究發(fā)現(xiàn)，用藥后消脂合劑高劑量組小鼠的體質(zhì)量、腹圍、Lee’s指數(shù)與模型組比較均顯著下降，低劑量組和中劑量組則效果不明顯，且效果在第5周開(kāi)始顯現(xiàn)，提示消脂合劑效果可能與用藥時(shí)間呈正相關(guān)。對(duì)糖脂代謝的作用方面，消脂合劑呈劑量依賴性降低FBG、FINS、TC、TG、FFA，其中高劑量組對(duì)脂類(lèi)（TC、TG）的影響與陽(yáng)性藥組無(wú)明顯差異。經(jīng)治療后，消脂合劑高劑量組對(duì)PPARγ的激活作用更明顯，同樣陽(yáng)性藥組也表現(xiàn)出類(lèi)似的作用。在PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路mRNA、蛋白的表達(dá)上，消脂合劑呈劑量依賴性上調(diào)PI3K、Akt、mTOR的蛋白和mRNA表達(dá)。前期研究已初步明確消脂合劑的基礎(chǔ)療效和作用機(jī)制[3-9]?，F(xiàn)代藥理研究證明，消脂合劑中的主要有效成分黃芪多糖[10]、葛根素[11]、蒼術(shù)多糖[12]均有明顯的降糖作用，進(jìn)一步機(jī)制研究亦表明黃芪、葛根配伍調(diào)控血糖、血脂的作用優(yōu)于單一用藥，推測(cè)與其促進(jìn)PPARγ"mRNA表達(dá)，調(diào)控AMP活化蛋白激酶信號(hào)通路有關(guān)[13-14]。絞股藍(lán)皂苷[15-17]、薏苡仁多糖[18]、紅景天可通過(guò)調(diào)節(jié)糖脂代謝，控制胰島素敏感性；其中絞股藍(lán)皂苷可上調(diào)PPARγ表達(dá)，是一種良好的PPARγ調(diào)節(jié)劑[19]；紅景天提取物可提高胰島素抵抗大鼠肝臟細(xì)胞PPAR-γ"mRNA表達(dá)[20]。茯苓多糖可通過(guò)激活PPARγ表達(dá)而抑制p38促分裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated"protein"kinase，MAPK）磷酸化的方式作用于p38"MAPK/PPARγ信號(hào)通路[21]。紅曲通過(guò)增加主動(dòng)脈PPARγ蛋白表達(dá)降低高脂血癥大鼠血脂水平[22]。臨床發(fā)現(xiàn)，與單味中藥比較，中藥復(fù)方君臣佐使配伍，兼顧主次，效果更好。

綜上所述，消脂合劑可調(diào)節(jié)肥胖小鼠的糖脂代謝，呈劑量遞增效果，其機(jī)制可能與調(diào)節(jié)PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路上調(diào)PPARγ水平有關(guān)。后續(xù)將進(jìn)一步明確其作用的最優(yōu)劑量，并對(duì)組方進(jìn)行持續(xù)優(yōu)化，以期為肥胖癥的治療提供數(shù)據(jù)支持。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突。

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