摘 要：本研究以花生蛋白為原料，與FeCl2·4H2O反應(yīng)制備花生肽亞鐵螯合物，主要考察指標(biāo)為亞鐵離子螯合率，輔助考察指標(biāo)為花生肽亞鐵螯合物得率，在單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上采用Box-Behnken響應(yīng)面分析，考察pH值、溫度、時(shí)間、肽鐵質(zhì)量比對(duì)螯合率的影響，從而得到花生肽亞鐵離子螯合物的最佳制備工藝。結(jié)果表明，當(dāng)pH值為7.0、螯合溫度為35 ℃、螯合時(shí)間為30 min、肽鐵質(zhì)量比為4∶1時(shí)，螯合率最高，為65.09%。

關(guān)鍵詞：花生肽；亞鐵離子；螯合物；螯合率

Study on the Preparation Process of Peanut Peptide Ferrous Ion Chelate

CI Aote， WANG Biao， HE Wei

（Department of Pharmacy， Anqing Medical and Pharmaceutical College， Anqing 246052， China）

Abstract： In this study， peanut peptide ferrous chelates were prepared by reacting peanut protein with FeCl2·4H2O， the main index was the ferrous ion chelating rate， and the auxiliary index was the yield of peanut peptide ferrous chelates. On the basis of the one-way experiments， Box-Behnken response surface analysis was used to investigate the effects of pH， temperature， time， and peptide-iron mass ratio on the chelating rate so as to screen the optimal process for the preparation of peanut peptide ferrous chelates. The optimal process for the preparation of ferrous ion chelates was selected. The results showed that when the pH value was 7.0， the chelating temperature was 35 ℃， the chelating time was 30 min， and the mass ratio of peptide to iron was 4∶1， the chelating rate was the highest， which was 65.09%.

Keywords： peanut peptide; ferrous ions; chelate; chelation rate

鐵是構(gòu)成人體組織和維持身體健康的必需微量元素，除了構(gòu)成血紅素參與氧氣運(yùn)輸外，鐵還是參與細(xì)胞代謝大部分酶的組成成分，還有助于維持正常的造血功能及增強(qiáng)免疫功能[1-2]。缺鐵性貧血作為營養(yǎng)缺乏癥之一，在我國較為常見，主要是由于鐵在人體中需要經(jīng)過轉(zhuǎn)運(yùn)載體跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)入腸上皮細(xì)胞后才可以進(jìn)行吸收[3]。傳統(tǒng)無機(jī)補(bǔ)鐵劑有刺激胃腸道或缺乏轉(zhuǎn)運(yùn)載體導(dǎo)致吸收較為緩慢的缺點(diǎn)，從而限制了其應(yīng)用[4]。多肽本身可以作為鐵離子吸收的載體進(jìn)行跨膜運(yùn)輸，且消耗能量低、吸收快。因此亞鐵離子-肽螯合物有望成為新型補(bǔ)鐵劑，該補(bǔ)充劑具有溶解度好、吸收利用率高、無毒副作用等優(yōu)點(diǎn)，其可在胃腸道中緩慢釋放，有利于在體內(nèi)的吸收利用[5]。目前有研究者利用復(fù)合蛋白酶將小米糠蛋白酶解后制備小米糠多肽亞鐵螯合物，體外模擬胃腸道消化結(jié)果表明，多肽-亞鐵螯合物比FeSO4、乳酸亞鐵的穩(wěn)定性更高[6]。樓鈺航[7]利用延邊黃牛骨為原料制備了清蛋白多肽螯合鐵和球蛋白多肽螯合鐵?？娂谚8]將魷魚蛋白肽螯合鐵進(jìn)行微膠囊化，研究表明亞鐵螯合肽微膠囊化后能夠展示出較好的受控釋放性能。

我國擁有豐富的花生資源，花生粕作為花生油的副產(chǎn)物常常被丟棄，從而造成資源浪費(fèi)[9]。由于花生粕含有大量的優(yōu)質(zhì)蛋白質(zhì)，以花生粕蛋白為原料制備金屬離子螯合肽可以大大提高礦物質(zhì)在人體內(nèi)的吸收利用率。本研究采用堿性蛋白酶制備花生肽，與FeCl2·4H2O反應(yīng)制備花生肽亞鐵螯合物。通過單因素實(shí)驗(yàn)和響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)，篩選出制備花生肽亞鐵螯合物的最優(yōu)工藝條件，為新型補(bǔ)鐵原料的研發(fā)、生產(chǎn)和利用提供一定的參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)儀器

SHIMADZU電子分析天平，日本島津儀器有限公司；LG-10C冷凍干燥機(jī)，四環(huán)福瑞科儀科技發(fā)展有限公司；JK-500B型超聲波清洗器，南北科儀（北京）科技有限公司；UV-2600紫外可見分光光度計(jì)，日本島津儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑

堿性蛋白酶、氯化亞鐵（AR級(jí)）、鄰菲羅啉（AR級(jí)）、無水乙酸鈉（AR級(jí)）、硫酸亞鐵銨（AR級(jí)），上海源葉生物科技有限公司；氫氧化鈉（AR級(jí)）、鹽酸羥胺（AR級(jí)）、無水乙醇（AR級(jí)），西隴科學(xué)股份有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 花生肽的制備

花生肽的制備流程為花生粕蛋白溶液→預(yù)處理（90 ℃，10 min水?。附猓ㄕ{(diào)節(jié)pH值，加入蛋白酶）→終止反應(yīng)（100 ℃水浴10 min）→離心（取上清液，冷凍干燥）→花生肽。

1.3.2 花生肽亞鐵螯合物的制備

（1）根據(jù)熊喆等[10]的方法制備花生肽亞鐵螯合物。稱取一定量的花生肽凍干粉于錐形瓶中，加入去離子水控制料液比，再加入一定量抗壞血酸混勻，調(diào)節(jié)pH值，根據(jù)不同質(zhì)量比加入氯化亞鐵，在設(shè)定的溫度下水浴加熱一定時(shí)間，然后加入6倍體積的無水乙醇，在室溫下靜置，離心，舍棄上清液，用無水乙醇洗滌沉淀后再次離心，多次洗滌，收集沉淀，凍干，用研缽研磨凍干產(chǎn)物得到粉末，于-20 ℃冷凍保存。

（2）花生肽亞鐵螯合物制備工藝單因素實(shí)驗(yàn)。分別以pH值、溫度、時(shí)間和肽鐵質(zhì)量比為考察因素，設(shè)計(jì)單因素實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)條件見表1。

（3）花生肽亞鐵螯合物制備工藝響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)。在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，將花生肽亞鐵螯合反應(yīng)的螯合率作為響應(yīng)值，利用minitab軟件設(shè)計(jì)中的Box-Benhnken設(shè)計(jì)響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)，因素水平見表2，確定最佳工藝條件。

1.3.3 亞鐵離子含量測定

（1）標(biāo)準(zhǔn)曲線測定。采用鄰菲啰啉比色法[11]。準(zhǔn)確稱取一定量硫酸亞鐵銨，配制成濃度為10 μg·mL-1的鐵離子標(biāo)準(zhǔn)溶液。分別取不同體積的的鐵離子標(biāo)準(zhǔn)液于50 mL容量瓶中，依次加入2 mL 5%的抗壞血酸溶液和5 mL濃度為0.1%的鄰菲啰啉，定容至刻度線，配制成濃度分別為0 μg·mL-1、0.4 μg·mL-1、0.8 μg·mL-1、1.2 μg·mL-1、1.6 μg·mL-1、2.0 μg·mL-1的系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。將系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液于37℃下恒溫放置10 min，測定510 nm處的吸光度。

（2）樣品測定。準(zhǔn)確稱取一定量肽鐵螯合物→加水溶解→定容至100 mL→吸取樣品溶液→測定樣品中鐵含量→3次試驗(yàn)→取平均值[12]。螯合率按公式（1）計(jì)算，螯合物得率按公式（2）計(jì)算。

式中：m1為螯合物中鐵的量，mg；m2為加入反應(yīng)體系中鐵的總量，mg。

式中：W1為螯合物的總質(zhì)量，mg；W2為花生肽和鐵鹽的總質(zhì)量，mg。

2 結(jié)果與分析

2.1 亞鐵離子含量測定結(jié)果

以亞鐵離子濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線（圖1），得到線性方程y=0.157 4x+0.014 5，R2=0.991 7。結(jié)果表明，該標(biāo)準(zhǔn)曲線線性關(guān)系良好，可以依據(jù)吸光度計(jì)算亞鐵離子含量。

2.2 花生肽亞鐵螯合物制備工藝單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 反應(yīng)pH值對(duì)螯合效果的影響

如圖2所示，隨著pH值上升，花生肽亞鐵螯合物的螯合率先升高再降低，在pH值為7時(shí)螯合率最高，為58.83%，此時(shí)螯合物得率為50.62%。研究發(fā)現(xiàn)，pH值較小時(shí)溶液呈酸性，供電子基團(tuán)H+會(huì)與Fe2+爭奪電子基團(tuán)；而pH值較高時(shí)，過多的OH?易與Fe2+產(chǎn)生沉淀，影響螯合效果[13-14]。因此，中性環(huán)境中螯合率最高。當(dāng)多肽pH值接近等電點(diǎn)時(shí)，其螯合效果受供電子基團(tuán)和吸電子基團(tuán)干擾較小，此時(shí)多肽可以充分與金屬離子通過配位鍵形成螯合物。這與汪婧瑜等[15]制備烏鱧短肽螯合鐵的研究結(jié)果一致。

2.2.2 反應(yīng)溫度對(duì)螯合效果的影響

溫度升高不僅可以提高反應(yīng)速率，也會(huì)影響螯合效果。如圖3所示，隨著溫度的升高，螯合率先上升再降低，在35 ℃達(dá)到最大，為62.49%，此時(shí)螯合物得率為49.29%。肽在水中的溶解度會(huì)隨著溫度的升高而增大，螯合反應(yīng)速率隨著Fe2+與多肽的側(cè)鏈接觸點(diǎn)增多而提高，從而提高花生肽亞鐵離子螯合物的螯合率[16]。但溫度繼續(xù)升高，會(huì)使多肽之間發(fā)生副反應(yīng)，氨基酸或小肽發(fā)生羰氨反應(yīng)等現(xiàn)象，副反應(yīng)產(chǎn)物會(huì)與Fe2+形成競爭關(guān)系，且螯合物在高溫條件下穩(wěn)定性較差，極易分解，影響螯合效果，導(dǎo)致螯合率和螯合物得率下降[17-18]。

2.2.3 反應(yīng)時(shí)間對(duì)螯合效果的影響

如圖4所示，15～30 min螯合率逐漸上升達(dá)到62.51%，隨后螯合率稍有下降。在一定條件下，螯合時(shí)間越短，螯合反應(yīng)越不充分，有大量游離鐵和花生肽未參與反應(yīng)；當(dāng)螯合時(shí)間超過一定時(shí)長時(shí)，螯合反應(yīng)會(huì)隨著螯合時(shí)間的延長持續(xù)發(fā)生解離作用，且可能產(chǎn)生一定量的副產(chǎn)物，導(dǎo)致螯合率降低，螯合效果差[19-20]。研究表明，螯合反應(yīng)達(dá)到一定程度時(shí)，反應(yīng)時(shí)間對(duì)螯合物的影響較低[21]。

2.2.4 多肽與亞鐵鹽質(zhì)量比對(duì)螯合效果的影響

花生肽亞鐵螯合物的制備是以氯化亞鐵和花生肽為底物進(jìn)行螯合反應(yīng)，因此螯合效果也會(huì)受到反應(yīng)底物相對(duì)含量的影響。如圖5所示，實(shí)驗(yàn)選用了5組不同的多肽與亞鐵鹽質(zhì)量比進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，隨著多肽與亞鐵鹽質(zhì)量比的增加，螯合率先上升后降低，在3∶1時(shí)螯合率最高為60.61%，此時(shí)螯合物得率為50.97%，隨后逐漸平穩(wěn)。主要原因是反應(yīng)底物濃度較低時(shí)，過量的Fe2+無法全部參與反應(yīng)，隨著花生肽含量的增加，螯合率和螯合物得率逐漸增高，當(dāng)達(dá)到一定比例后，略有降低，主要是由于亞鐵離子數(shù)量有限，部分多肽未參與反應(yīng)[22-24]。

2.3 花生肽亞鐵螯合物制備工藝響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.3.1 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

根據(jù)上述單因素實(shí)驗(yàn)研究的結(jié)果，利用Minitab軟件中的Box-Behnken設(shè)計(jì)pH值、溫度、時(shí)間和肽鐵質(zhì)量比4因素3水平響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)，探究螯合效果受到不同影響因素的交互影響，所得結(jié)果如表3所示。利用Minitab軟件對(duì)表3的試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行擬合分析，得到螯合率（Y）的二次響應(yīng)面回歸模型為

Y=-544.7+154.25A+2.461B+0.355C+7.65D-11.011A2-0.047 84B2-0.017 10C2+0.081 5AB+0.060 7AC-0.905AD+0.009 12BC

2.3.2 響應(yīng)面結(jié)果分析

由回歸方程方差分析表（表4）可知，此響應(yīng)面的模型P值＜0.000 1極顯著，模型成立；失擬項(xiàng)中P值＞0.05，不顯著，模型未失擬；模型的回歸系數(shù)R2為0.929 1，調(diào)整后R2為0.965 7，說明該回歸方程有96.57%的可能性可以解釋各因素與螯合率的變化情況。其中A、C、D和二次項(xiàng)A2、B2、C2對(duì)螯合率的影響極為顯著（P＜0.01），二次項(xiàng)BC對(duì)螯合率影響顯著（P＜0.05）。pH值、螯合時(shí)間和肽鐵質(zhì)量比對(duì)螯合率有極顯著影響，比較F值可知，pH值對(duì)螯合實(shí)驗(yàn)的影響最大，肽鐵質(zhì)量比和螯合時(shí)間次之，螯合溫度影響最小。

通過響應(yīng)面3D圖的坡度可以判斷不同因素對(duì)螯合率影響的顯著性；不同因素之間交互作用的強(qiáng)弱可以通過等值線的形狀進(jìn)行判斷，交互作用越強(qiáng)，等值線越接近橢圓[25-26]。由圖6可以看出溫度和時(shí)間對(duì)螯合率交互作用強(qiáng)，與表4中BC的P值＜0.05的結(jié)果一致。

2.3.3 最佳工藝參數(shù)的確定及驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

通過軟件分析得到以亞鐵螯合率為考察指標(biāo)的最佳螯合條件為pH值7.05，溫度34.70 ℃，時(shí)間32.14 min，肽鐵質(zhì)量比4∶1，此時(shí)的亞鐵螯合率預(yù)測值為65.92%，結(jié)合實(shí)際操作，將螯合條件調(diào)整為pH值7.00，溫度35 ℃，時(shí)間30 min，肽鐵質(zhì)量比4∶1，在此條件下進(jìn)行3次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，最終螯合率平均值為65.09%，與預(yù)測值接近，說明此螯合條件下回歸方程可靠。

3 結(jié)論

本研究以花生肽為底物與亞鐵離子進(jìn)行螯合，考察pH值、螯合溫度、螯合時(shí)間和肽鐵質(zhì)量比對(duì)螯合效果的影響，在單因素基礎(chǔ)上設(shè)計(jì)4因素3水平響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)，確定花生肽亞鐵離子螯合肽的最佳制備工藝為pH值7.00，溫度35 ℃，時(shí)間30 min，肽鐵質(zhì)量比4∶1，在此條件下得到最優(yōu)螯合率為65.09%，與預(yù)測值接近，說明該模型能夠很好地反映螯合真實(shí)情況。本研究可為亞鐵離子螯合肽的產(chǎn)品開發(fā)提供一定的理論參考。

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基金項(xiàng)目：安徽省高校自然科學(xué)基金項(xiàng)目（KJ2020A0890）。

作者簡介：慈傲特（1992—），女，安徽樅陽人，碩士，講師。研究方向：食品營養(yǎng)與健康。