王飛飛 陳伯艷 李瓊

摘要? 目的：探究茯苓酸通過調節(jié)核因子E2相關因子2（Nrf2）/溶質載體家族7成員11（SLC7A11）/谷胱甘肽過氧化物酶4（GPX4）信號通路抑制氧糖剝奪/復氧（OGD/R）誘導的心肌細胞鐵死亡的機制。方法：體外培養(yǎng)大鼠心肌細胞H9c2，誘導建立細胞OGD/R模型后以0、1.0、2.5、5.0、10.0、20.0 μmol/L茯苓酸處理24 h，通過細胞計數試劑盒-8（CCK-8）法檢測各處理組細胞活力后篩選出合適的茯苓酸作用濃度。將H9c2細胞隨機分為對照組、模型組、茯苓酸組、ML385組（Nrf2抑制劑組）、茯苓酸＋ML385組，除對照組外其余各組建立細胞OGD/R模型后以茯苓酸、ML385分組處理，采用CCK-8法與流式細胞實驗分別檢測各組H9c2細胞活力、凋亡率；采用試劑盒檢測各組H9c2細胞培養(yǎng)基上清中乳酸脫氫酶（LDH）、促炎因子［前列腺素E2（PGE2）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）］、抗炎因子白細胞介素（IL）-10水平及細胞抗氧化因子［過氧化氫酶（CAT）、谷胱甘肽（GSH）］、鐵死亡相關指標［鐵含量、丙二醛（MDA）］水平；采用免疫印跡實驗檢測各組H9c2細胞凋亡及Nrf2/SLC7A11/GPX4信號通路相關蛋白表達。結果：與對照組比較，模型組細胞凋亡率、LDH釋放量、細胞培養(yǎng)基上清中PGE2及TNF-α水平、細胞鐵含量、MDA水平及Bax、Caspase-3蛋白表達均升高（P＜0.05），細胞活力、細胞培養(yǎng)基上清中IL-10水平、細胞CAT及GSH水平、Bcl-2及Nrf2、SLC7A11、GPX4蛋白表達降低（P＜0.05）。與模型組比較，茯苓酸組細胞凋亡率、LDH釋放量、細胞培養(yǎng)基上清中PGE2及TNF-α水平、細胞鐵含量、MDA水平及Bax、Caspase-3蛋白表達均降低（P＜0.05），細胞活力、細胞培養(yǎng)基上清中IL-10水平、細胞CAT及GSH水平、Bcl-2及Nrf2、SLC7A11、GPX4蛋白表達升高（P＜0.05）；ML385組細胞凋亡率、LDH釋放量、細胞培養(yǎng)基上清中PGE2及TNF-α水平、細胞鐵含量、MDA水平及Bax、Caspase-3蛋白表達均升高（P＜0.05），細胞活力、細胞培養(yǎng)基上清中IL-10水平、細胞CAT及GSH水平、Bcl-2及Nrf2、SLC7A11、GPX4蛋白表達降低（P＜0.05）。與茯苓酸組比較，茯苓酸＋ML385組細胞凋亡率、LDH釋放量、細胞培養(yǎng)基上清中PGE2及TNF-α水平、細胞鐵含量、MDA水平及Bax、Caspase-3蛋白表達均升高（P＜0.05），細胞活力、細胞培養(yǎng)基上清中IL-10水平、細胞CAT及GSH水平、Bcl-2及Nrf2、SLC7A11、GPX4蛋白表達降低（P＜0.05）。結論：茯苓酸可通過激活Nrf2/SLC7A11/GPX4信號而抑制OGD/R誘導的心肌細胞炎癥、脂質過氧化與鐵死亡，增強其抗氧化活性及細胞活力，最終減輕其細胞凋亡損傷。

關鍵詞? 氧糖剝奪/復氧；心肌細胞；茯苓酸；核因子E2相關因子2/溶質載體家族7成員11/谷胱甘肽過氧化物酶4；鐵死亡；實驗研究

doi：10.12102/j.issn.1672-1349.2024.02.011

Tumulosic Acid Inhibits Oxygen-glucose Deprivation/Reoxygenation-induced Cardiomyocyte Ferroptosis by Regulating Nrf2/SLC7A11/GPX4 Signaling Pathway

WANG Feifei， CHEN Boyan， LI Qiong

Xi′an Gaoxin Hospital， Xi′an 710000， Shaanxi， China

Corresponding Author? LI Qiong， E-mail： 554739296@qq.com

Abstract? Objective：To explore the mechanism of tumulosic acid inhibiting oxygen-glucose deprivation/reoxygenation（OGD/R）-induced cardiomyocyte ferroptosis.Methods：Rat cardiomyocytes H9c2 were cultured in vitro and treated with 0，1.0，2.5，5.0，10.0，20.0 μmol/L tumulosic acid for 24 h immediately after? the establishment of the cell OGD/R model.The cell viability of each treatment group was detected by CCK-8 method，and the appropriate concentration of tumulosic acid was screened out.H9C2 cells were randomly divided into control group，model group， tumulosic acid group，ML385 group［nuclear factor erythroid-2-related factor 2（Nrf2） inhibitor group］，and tumulosic acid＋ML385 group，except for the control group，the rest of the groups were treated with tumulosic acid and ML385 immediately after the establishment of the cell OGD/R model.The viability and apoptosis rate of H9c2 cells in each group were detected by CCK-8 method and flow cytometry respectively.The kits were applied to detect the levels of lactate dehydrogenase（LDH），pro-inflammatory factors［prostaglandin E2（PGE2），and tumor necrosis factor-α（TNF-α）］，anti-inflammatory factor interleukin（IL）-10 levels，cellular antioxidant factors［catalase（CAT） and glutathione（GSH）］，ferroptosis-related indicators［iron content and malondialdehyde（MDA）］ in the supernatant of H9c2 cell culture medium in each group.The apoptosis of H9c2 cells in each group and the expression of Nrf2/solute carrier family 7 member 11（SLC7A11）/glutathione peroxidase 4（GPX4） signal-related proteins were detected by Western Blotting.Results：Compared with control group，the apoptosis rate，LDH release，PGE2 and TNF-α levels in cell culture supernatant，cellular iron content，MDA level，and Bax and Caspase-3 protein expression? increased in model group（P＜0.05），the cell viability，IL-10 level in cell culture supernatant，cellular CAT and GSH levels，Bcl-2 and Nrf2，SLC7A11，GPX4 protein expression? decreased（P＜0.05）.Compared with model group，the apoptosis rate，LDH release（PGE2） and TNF-α levels in cell culture supernatant，cellular iron content，MDA level，and Bax and Caspase-3 protein expression? decreased in tumulosic acid group（P＜0.05），the cell viability，IL-10 level in cell culture supernatant，cellular CAT and GSH levels，Bcl-2 and Nrf2，SLC7A11，GPX4 protein expression? increased（P＜0.05）;the apoptosis rate，LDH release，PGE2，and TNF-α levels in cell culture supernatant，cellular iron content，MDA level，and Bax and Caspase-3 protein expression? increased in ML385 group（P＜0.05），the cell viability，IL-10 level in cell culture supernatant，cellular CAT and GSH levels，Bcl-2 and Nrf2，SLC7A11，GPX4 protein expression decreased（P＜0.05）.Compared with tumulosic acid group，the apoptosis rate，LDH release，PGE2，and TNF-α levels in cell culture supernatant，cellular iron content，MDA level，and Bax and Caspase-3 protein expression? increased in tumulosic acid＋ML385 group（P＜0.05），the cell viability，IL-10 level in cell culture supernatant，cellular CAT and GSH levels，Bcl-2 and Nrf2，SLC7A11，GPX4 protein expression? decreased（P＜0.05）.Conclusion：Tumulosic acid can inhibit OGD/R-induced myocardial cell inflammation，lipid peroxidation，and ferroptosis by activating Nrf2/SLC7A11/GPX4 signaling，enhance antioxidant activity and cell viability，and ultimately alleviate apoptosis injury.

Keywords? oxygen glucose deprivation/reoxygenation; cardiomyocytes; tumulosic acid; nuclear factor erythroid-2-related factor 2/solute carrier family 7 member 11/glutathione peroxidase 4; ferroptosis; experimental study

作者單位? 西安高新醫(yī)院（西安? 710000）

通訊作者? 李瓊，E-mail：554739296@qq.com

引用信息? 王飛飛，陳伯艷，李瓊.茯苓酸通過調節(jié)Nrf2/SLC7A11/GPX4信號通路抑制氧糖剝奪/復氧誘導的心肌細胞鐵死亡［J］.中西醫(yī)結合心腦血管病雜志，2024，22（2）：267-273.

心肌梗死造成的心肌缺血、缺氧是引發(fā)心源性猝死的重要原因之一，通過再灌注恢復供血是主要的治療策略，可有效降低病人死亡率，但在此過程中心肌細胞會因為缺血再灌注損傷發(fā)生凋亡，進一步加重心肌結構損傷和功能障礙，導致病人預后不佳［1-2］。心肌缺血再灌注期間由于血氧的突然再補給可引發(fā)活性氧（reactive oxygen species，ROS）生成過多和鐵離子的積累，破壞氧化還原平衡，造成脂質過氧化和谷胱甘肽（glutathione，GSH）耗竭，引發(fā)鐵死亡，導致心肌細胞損傷凋亡，通過抑制鐵死亡可預防心肌缺血再灌注損傷，是一種有效的心臟保護策略［3-4］。研究發(fā)現，鐵死亡與缺血再灌注引發(fā)的各種組織細胞損傷密切相關，核因子E2相關因子2（nuclear factor erythroid-2 related factor 2，Nrf2）/溶質載體家族7成員11（solute carrier family 7 member 11，SLC7A11）/谷胱甘肽過氧化物酶4（glutathione peroxidase 4，GPX4）信號通路參與介導其過程，激活該信號通路可增強抗氧化能力，抑制氧糖剝奪/復氧（oxygen-glucose deprivation/reoxygenation，OGD/R）誘導的神經元脂質過氧化和鐵死亡，保護神經元免受腦缺血再灌注損傷［5］，上調Nrf2及其下游GPX4的表達，可降低心肌細胞內ROS、炎性因子和鐵水平，提高抗氧化活性，防止炎癥和鐵死亡，進而挽救心肌免受缺血再灌注損傷［6-7］，因此，激活Nrf2/SLC7A11/GPX4可能是減輕OGD/R誘導的心肌細胞鐵死亡的有效方法。茯苓酸是一種存在于茯苓、靈芝等中草藥中的天然羊毛甾烷型三萜化合物，具有抗氧化、抗纖維化及抗炎特性，可通過抑制心肌纖維化減輕阿霉素誘導的心臟收縮力缺陷和心力衰竭［8］，還可增強鐵死亡相關蛋白Nrf2、血紅素加氧酶1（HO-1）、SLC7A11、GPX4的表達，降低炎性因子及脂質過氧化產物生成，通過抑制腎臟鐵死亡減輕缺血再灌注誘導的小鼠急性腎損傷［9］，因而預測茯苓酸可能通過下調Nrf2/SLC7A11/GPX4信號通路抑制OGD/R誘導的心肌細胞鐵死亡。本實驗體外培養(yǎng)大鼠心肌細胞H9c2，誘導建立細胞OGD/R模型后以茯苓酸干預處理，對上述預測做驗證。

1? 材料與方法

1.1? 主要試劑及儀器

大鼠心肌細胞H9c2（貨號：SNL-029）購自武漢尚恩生物技術有限公司；DMEM無糖培養(yǎng)基（貨號：11966025）、DMEM低糖培養(yǎng)基（貨號：10567022）購自賽默飛世爾科技（中國）有限公司；D-無水葡萄糖（純度≥99.8%，貨號：G8150）、茯苓酸（純度：HPLC≥98%，貨號：IP0010）、ML385（純度≥98%，貨號：IM1020）、鐵含量檢測試劑盒（貨號：BC4355）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）含量檢測試劑盒（貨號：BC0025）、乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH）活性檢測試劑盒（貨號：BC0685）、大鼠白細胞介素（interleukin，IL）-10酶聯免疫吸附實驗（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）試劑盒（貨號：SEKH-0028）、大鼠前列腺素E2（prostaglandin E2，PGE2）ELISA試劑盒（貨號：SEKR-0053）均購自北京索萊寶科技有限公司；細胞計數試劑盒（CCK-8）試劑盒（貨號：E606335）、大鼠腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）ELISA試劑盒（貨號：D731168）、異硫氰酸熒光素（FITC）/碘化丙啶（PI）雙染法膜聯蛋白Ⅴ（Annexin Ⅴ）凋亡檢測試劑盒（貨號：E606336）均購自生工生物工程（上海）股份有限公司；過氧化氫酶（catalase，CAT）測定試劑盒（貨號：A007-1-1）、GSH測定試劑盒（貨號：A006-2-1）均購自南京建成生物工程研究所有限公司；兔源抗大鼠anti-SLC7A11一抗（貨號：ab175186）、小鼠抗大鼠anti-β-actin一抗（貨號：ab8226）、兔源抗大鼠anti-Nrf2抗體（貨號：ab92946）、兔源抗大鼠anti-GPX4一抗（貨號：ab125066）、辣根過氧化物酶（HRP）偶聯山羊抗兔二抗（貨號：ab6721）、HRP偶聯兔抗小鼠二抗（貨號：ab97046）均購自美國Abcam公司。

酶標分析儀（型號：AMR-100）購自上海聚慕醫(yī)療器械有限公司；流式細胞分選儀（型號：FACSMelody）購自美國BD公司；垂直電泳槽（型號：KEEBIO-VE180）、電泳儀電源（型號：KEEBIO-600N）、轉移電泳槽（型號：KEEBIO-VE186）均購自上海金鵬分析儀器有限公司。

1.2? 方法

1.2.1? 茯苓酸作用濃度篩選

購買的凍存大鼠心肌細胞H9c2置于40 ℃水浴中快速解凍，離心后以磷酸鹽緩沖液（PBS）洗滌，然后加入含10%胎牛血清的DMEM低糖培養(yǎng)基重懸H9c2細胞，接種在25 mm2培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)至約80%細胞融合，傳代并以1×104個/孔的密度接種在96孔板培養(yǎng)24 h，然后誘導建立細胞OGD/R模型：將培養(yǎng)基更換為DMEM無糖培養(yǎng)基后將H9c2細胞置于低氧培養(yǎng)箱（37 ℃、94%N2、5%CO2、1%O2）中培養(yǎng)24 h進行氧糖剝奪處理，然后將培養(yǎng)基更換為含糖DMEM培養(yǎng)基并放入正常培養(yǎng)箱（37 ℃、5%CO2、95%O2）中培養(yǎng)6 h行復氧處理［10］，細胞建模后立即以0、1.0、2.5、5.0、10.0、20.0 μmol/L茯苓酸處理24 h（以0 μmol/L茯苓酸處理細胞作為對照組）［11］，每孔加入20? μL CCK-8試劑孵育1 h，參照CCK-8試劑盒說明指導測出各處理組細胞吸光度，計算其細胞活力，細胞活力＝藥物處理組吸光值/對照組吸光值×100%。

1.2.2? 分組處理H9c2細胞后收集標本

取H9c2細胞傳代并以2.5×105個/孔的密度接種在小培養(yǎng)皿中培養(yǎng)24 h，隨機分為對照組、模型組、茯苓酸組、ML385（Nrf2抑制劑）組、茯苓酸＋ML385組，除對照組外，其余各組細胞按照1.2.1中方法建立OGD/R模型，然后馬上進行藥物處理：茯苓酸組以10.0 μmol/L茯苓酸處理，ML385組以2.0 μmol/L ML385處理［12］，茯苓酸＋ML385組以10.0 μmol/L茯苓酸和2.0 μmol/L ML385聯合處理，對照組正常培養(yǎng)且不進行任何處理，各組均于處理24 h后收集其細胞沉淀及培養(yǎng)基，細胞沉淀存于液氮中備用，培養(yǎng)基于離心后存于－80 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3? CCK-8法與流式細胞實驗分別檢測各組H9c2細胞活力、凋亡率

取H9c2細胞傳代并以1×104個/孔的密度接種在96孔板中培養(yǎng)24 h，遵照1.2.2中方法進行分組處理24 h后通過CCK-8法測定各組細胞活力，具體步驟參照1.2.1。

取H9c2細胞傳代并以2.5×105個/孔的密度接種在小培養(yǎng)皿中培養(yǎng)24 h，遵照1.2.2中方法進行分組處理24 h，以胰酶消化后收集各組細胞，采用預冷PBS洗滌、重懸后計數，每組取出5×105個細胞進行FITC/PI雙染法后采用流式細胞儀測定各組細胞凋亡率，具體步驟按照Annexin Ⅴ凋亡檢測試劑盒說明書操作。

1.2.4? 采用試劑盒檢測各組H9c2細胞培養(yǎng)基上清中LDH、PGE2、TNF-α、IL-10水平及細胞CAT、GSH與MDA水平、鐵含量

取1.2.2中收集的各組細胞培養(yǎng)基上清，置于4 ℃冰箱中緩慢解凍后，采用試劑盒檢測其中LDH、PGE2、TNF-α、IL-10水平，具體操作步驟按照各自制造商試劑盒說明書進行。取1.2.2中收集的各組細胞分別加入適量RIPA裂解液混勻，裂解2 h后離心提取其中總蛋白，采用二喹啉甲酸（BCA）蛋白檢測試劑盒測出其濃度，各組分別取300 mL細胞樣品液（剩余樣品液存于－80 ℃進行蛋白表達檢測），采用試劑盒檢測其中CAT、GSH與MDA水平、鐵含量，具體操作步驟按照各自制造商試劑盒說明書進行。

1.2.5? 免疫印跡法檢測各組H9c2細胞凋亡及Nrf2/SLC7A11/GPX4信號通路相關蛋白表達

取1.2.4中剩余細胞樣品液置于冰水浴中緩慢凍融后，根據蛋白濃度測定結果每組取出15 mg總蛋白，煮沸變性后上樣跑電泳、濕轉，將膠中分離后的蛋白移到硝酸纖維素膜上，37.5 ℃下以3%牛血清白蛋白溶液孵育蛋白2 h后將B淋巴細胞瘤-2（Bcl-2）、Bcl-2相關X蛋白（Bax）、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3（Caspase-3）、Nrf2、β-actin、SLC7A11及GPX4剪下，分別孵育兔源抗大鼠anti-Bcl-2、anti-Bax、anti-Caspase-3、anti-Nrf2、anti-β-actin、anti-SLC7A11及anti-GPX4一抗，洗滌后根據一抗宿主物種分別孵育HRP偶聯山羊抗兔二抗、HRP偶聯兔抗小鼠二抗，洗滌后采用化學發(fā)光試劑顯色偶聯二抗的HRP，采集各蛋白條帶圖像后，運用Image J軟件定量其灰度值，以內參β-actin為標準量化各蛋白相對表達水平。

1.3? 統計學處理

運用SPSS 26.0軟件進行統計學分析。定量資料用均數±標準差（x±s）表示，兩組間差異比較采用t檢驗，多組間差異比較行單因素方差分析，組間進一步兩兩差異比較進行SNK-q檢驗。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2? 結? 果

2.1? 茯苓酸對OGD/R誘導的H9c2細胞活力的影響

不同濃度的茯苓酸均可提升OGD/R誘導的H9c2細胞活力，且劑量越高，其提升作用越強，在濃度為10.0 μmol/L時對細胞活力的提升作用進入平臺期，因而后續(xù)實驗選擇10.0 μmol/L的茯苓酸進行。

2.2? 茯苓酸對OGD/R誘導的H9c2細胞凋亡損傷的影響

與對照組比較，模型組細胞凋亡率、LDH釋放量均升高（P＜0.05），細胞活力降低（P＜0.05）。與模型組比較，茯苓酸組細胞凋亡率、LDH釋放量均降低（P＜0.05），細胞活力升高（P＜0.05）；ML385組細胞凋亡率、LDH釋放量均升高（P＜0.05），細胞活力降低（P＜0.05）。與茯苓酸組比較，茯苓酸＋ML385組細胞凋亡率、LDH釋放量均升高（P＜0.05），細胞活力降低（P＜0.05）。詳見圖1、表1。

2.3? 茯苓酸對OGD/R誘導的H9c2細胞促炎因子與抗炎因子釋放的影響

與對照組比較，模型組細胞培養(yǎng)基上清中PGE2、TNF-α水平均升高（P＜0.05），IL-10水平降低（P＜0.05）。與模型組比較，茯苓酸組細胞培養(yǎng)基上清中PGE2、TNF-α水平均降低（P＜0.05），IL-10水平升高（P＜0.05）；ML385組細胞培養(yǎng)基上清中PGE2、TNF-α水平均升高（P＜0.05），IL-10水平降低（P＜0.05）。與茯苓酸組比較，茯苓酸＋ML385組細胞培養(yǎng)基上清中PGE2、TNF-α水平均升高（P＜0.05），IL-10水平降低（P＜0.05）。詳見表2。

2.4? 茯苓酸對OGD/R誘導的H9c2細胞抗氧化因子及鐵死亡相關指標水平的影響

與對照組比較，模型組細胞CAT、GSH水平均降低（P＜0.05），MDA水平、鐵含量均升高（P＜0.05）。與模型組比較，茯苓酸組細胞CAT、GSH水平均升高（P＜0.05），MDA水平、鐵含量均降低（P＜0.05）；ML385組細胞CAT、GSH水平均降低（P＜0.05），MDA水平、鐵含量均升高（P＜0.05）。與茯苓酸組比較，茯苓酸＋ML385組細胞CAT、GSH水平均降低（P＜0.05），MDA水平、鐵含量均升高（P＜0.05）。詳見表3。

2.5? 茯苓酸對OGD/R誘導的H9c2細胞凋亡相關蛋白表達的影響

與對照組比較，模型組細胞Bcl-2蛋白表達降低（P＜0.05），Bax、Caspase-3蛋白表達均升高（P＜0.05）。與模型組比較，茯苓酸組細胞Bcl-2蛋白表達升高（P＜0.05），Bax、Caspase-3蛋白表達均降低（P＜0.05）；ML385組細胞Bcl-2蛋白表達降低（P＜0.05），Bax、Caspase-3蛋白表達均升高（P＜0.05）。與茯苓酸組比較，茯苓酸＋ML385組細胞Bcl-2蛋白表達降低（P＜0.05），Bax、Caspase-3蛋白表達均升高（P＜0.05）。詳見圖2、表4。

2.6? 茯苓酸對OGD/R誘導的H9c2細胞Nrf2/SLC7A11/GPX4信號通路相關蛋白表達的影響

與對照組比較，模型組細胞Nrf2、SLC7A11、GPX4蛋白表達均降低（P＜0.05）。與模型組比較，茯苓酸組細胞Nrf2、SLC7A11、GPX4蛋白表達均升高（P＜0.05）；ML385組細胞Nrf2、SLC7A11、GPX4蛋白表達均降低（P＜0.05）。與茯苓酸組比較，茯苓酸＋ML385組細胞Nrf2、SLC7A11、GPX4蛋白表達均降低（P＜0.05）。詳見圖3、表5。

3? 討? 論

臨床研究發(fā)現，心肌梗死治療過程中，心肌組織會因血流再灌注發(fā)生氧化應激、炎性浸潤及心肌細胞死亡等缺血再灌注損傷癥狀，是影響病人預后的關鍵，因此對其進行防治對于提升心肌梗死病人治療效果有重大臨床意義［13-14］。本實驗對體外培養(yǎng)的大鼠心肌細胞H9c2進行OGD/R處理，誘導建立體外心肌缺血再灌注損傷細胞模型，結果顯示，OGD/R誘導細胞促炎因子PGE2、TNF-α水平升高，抗炎因子IL-10及抗氧化因子CAT、GSH水平降低，引發(fā)細胞炎癥與過氧化損傷，造成LDH釋放量提升及細胞活力降低，最終誘發(fā)細胞凋亡，揭示OGD/R細胞模型構建成功。

鐵死亡是引發(fā)腦、心肌等組織器官缺血再灌注損傷的主要因素之一，可引發(fā)缺血再灌注后細胞內脂質過氧化水平升高和鐵蓄積，最終導致細胞損傷死亡，通過抑制鐵死亡可減輕OGD/R誘導的海馬神經元細胞損傷，保護心肌免于缺血再灌注損傷［15-16］。茯苓酸是一種有明顯抗炎及抗氧化特性的天然三萜類化合物，廣泛分布于靈芝、茯苓等名貴中草藥中，可通過抑制鐵死亡保護腎臟組織，避免缺血再灌注引發(fā)的急性病理損傷［9］，還可通過減輕氧化應激抑制氧化型低密度脂蛋白誘導的內皮細胞損傷［17］，緩解血管緊張素Ⅱ誘導的心肌細胞肥大和凋亡［11］，因而推測茯苓酸可能對OGD/R誘導的心肌細胞鐵死亡具有抑制作用。本實驗以0、1.0、2.5、5.0、10.0、20.0 μmol/L茯苓酸處理OGD/R誘導的大鼠心肌細胞H9c2，均可提升其細胞活力，且劑量越高，其提升作用越強，以10.0 μmol/L的茯苓酸處理OGD/R誘導的H9c2細胞，可降低細胞凋亡率、LDH釋放量、細胞培養(yǎng)基上清中PGE2及TNF-α水平、細胞鐵含量、MDA水平及Bax、Caspase-3蛋白表達，升高細胞活力、細胞培養(yǎng)基上清中IL-10水平、細胞CAT及GSH水平、Bcl-2蛋白表達，表明茯苓酸可減少促炎因子和ROS產生，提高抗炎和抗氧化因子水平，緩解脂質過氧化和細胞內鐵沉積，抑制鐵死亡，最終減輕OGD/R誘導的心肌細胞凋亡損傷，并提升其活力，發(fā)揮細胞保護作用，且劑量越高，功效越強。

研究顯示，Nrf2信號可通過調控SLC7A11和GPX4表達而介導細胞鐵蓄積、ROS產生和氧化損傷過程，激活Nrf2信號可上調SLC7A11、GPX4表達，緩解ROS產生和鐵沉積，減輕鐵死亡引發(fā)的細胞損傷，對OGD/R誘導的肺上皮細胞發(fā)揮保護作用，并可減輕缺血再灌注引起的大鼠心肌組織炎癥和脂質過氧化，抑制鐵死亡，從而減輕心肌損傷［18-20］。劉鳳等［17］研究顯示茯苓酸可通過激活Nrf2/HO-1信號通路改善氧化型低密度脂蛋白導致的人臍靜脈內皮細胞損傷，因而推測激活Nrf2/SLC7A11/GPX4信號通路可能是茯苓酸抑制OGD/R誘導的心肌細胞鐵死亡的作用機制。本研究結果顯示，以Nrf2抑制劑ML385處理OGD/R誘導的H9c2細胞，可下調SLC7A11、GPX4蛋白表達，促進ROS及促炎因子表達，減少抗炎及抗氧化因子生成，加重OGD/R誘導的心肌細胞炎癥與過氧化損傷，增強鐵死亡，最終進一步促進細胞損傷凋亡，而茯苓酸可上調OGD/R誘導的H9c2細胞Nrf2、SLC7A11、GPX4蛋白表達，表明Nrf2/SLC7A11/GPX4參與介導OGD/R誘導的心肌細胞鐵死亡及茯苓酸對其可能有抑制作用。以茯苓酸和ML385聯合處理OGD/R誘導的H9c2細胞，相比茯苓酸單獨處理，可升高細胞凋亡率、LDH釋放量、細胞培養(yǎng)基上清中PGE2及TNF-α水平、細胞鐵含量、MDA水平及Bax、Caspase-3蛋白表達，降低細胞活力、細胞培養(yǎng)基上清中IL-10水平、細胞CAT及GSH水平、Bcl-2及Nrf2、SLC7A11、GPX4蛋白表達，表明ML385可減弱茯苓酸對炎癥和脂質過氧化的減輕作用，拮抗其對OGD/R誘導的心肌細胞鐵死亡和凋亡損傷的抑制作用，最終逆轉茯苓酸對心肌細胞的保護作用，揭示茯苓酸抑制OGD/R誘導的心肌細胞鐵死亡是通過激活Nrf2信號實現的。

總之，本實驗證實了茯苓酸可增強Nrf2/SLC7A11/GPX4通路蛋白表達，減少ROS和促炎因子產生，提高抗氧化因子和抑炎因子水平，緩解OGD/R誘導的心肌細胞脂質過氧化和鐵沉積，抑制鐵死亡，減輕OGD/R導致的心肌細胞凋亡損傷，促進Nrf2/SLC7A11/GPX4信號途徑傳導可能是其分子機制之一，本研究為茯苓酸用于心肌缺血再灌注損傷的臨床防治提供了新的理論依據，有利于心肌梗死治療方法的改進。

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（收稿日期：2022-08-11）

（本文編輯王麗）