楊園緣,王芷若,陳 功,陳慧慧

0 引言

葡萄膜炎是一種累及虹膜、睫狀體、脈絡膜及其周圍組織的炎癥,是世界范圍內主要致盲原因之一。根據(jù)病因可分為感染性葡萄膜炎和非感染性葡萄膜炎(non-infectious uveitis, NIU),后者中相當一部分被認為是自身免疫性或免疫因素介導的[1]。目前主流觀點認為NIU是CD4+T細胞亞群,尤其是效應性Th1細胞和Th17細胞與調節(jié)性T細胞(Treg)之間的比例失衡導致的[2]。各T細胞亞群通過白細胞介素、干擾素等細胞因子構建復雜的免疫調節(jié)網絡來介導炎癥反應。然而,B細胞作為適應性免疫應答的核心參與者之一,具有多種強大的免疫學功能,如分泌抗體和細胞因子、抗原提呈等[3]。盡管如此,它在NIU中的參與水平及方式卻較少被討論。近年來,B細胞耗竭療法(B-cell depletion therapy, BCDT)在自身免疫性疾病的治療中備受關注[4]。B細胞抑制劑利妥昔單抗(rituximab, RTX)在部分難治性NIU中也顯示出良好的療效[5-6],間接表明B細胞在NIU的發(fā)生和發(fā)展中極為重要。本文將對B細胞在NIU中的參與展開論述。

1 B細胞免疫學知識回顧

1.1B細胞發(fā)育和免疫耐受的建立B細胞起源于骨髓的造血干細胞,在發(fā)育過程中細胞表面表達隨機組裝B細胞受體(B cell receptor,BCR)并誘導免疫耐受,即當受到自身抗原刺激時不被激活;反之,若免疫耐受失調則會促使自身免疫病的發(fā)生[7-8]。最終,B細胞可分化為漿細胞或記憶細胞發(fā)揮體液免疫功能。

1.2B細胞功能B細胞與T細胞共同參與適應性免疫應答,具有多種免疫學功能[3],包括:(1)產生抗體:機體受到外界抗原刺激后,B細胞可分化漿細胞和記憶細胞,進而產生抗體與靶細胞抗原結合引起免疫反應;(2)分泌細胞因子:B細胞可以分泌各種白細胞介素、腫瘤壞死因子、干擾素等,向各種免疫細胞傳遞信號,構成復雜的免疫調節(jié)網絡;(3)抗原提呈:通過BCR,B細胞可識別并攝取外源抗原,經過MHC Ⅱ分子處理后提呈給T細胞;(4)構成三級淋巴結構。

1.3調節(jié)性B細胞B細胞可以根據(jù)細胞因子環(huán)境被劃分為不同的功能亞群,其中調節(jié)性B細胞(Breg)與效應性B細胞起拮抗作用,主要分泌IL-10、IL-35、TGF-β等抑炎因子,有助于維持免疫耐受平衡[9-10]。

2 B細胞與EAU模型

2.1EAU模型為了更深入地理解自身免疫性葡萄膜炎的細胞和分子機制,我們通常使用實驗動物模型來重現(xiàn)其臨床表征。實驗性自身免疫性葡萄膜炎(experimental autoimmune uveitis, EAU)模型種類豐富,其動物及誘導抗原的選擇具有多樣性。視網膜可溶性抗原(S-Ag)、光感受器間維生素A類結合蛋白(IRBP)、視紫紅質、恢復蛋白等都可用于誘發(fā)EAU[11]。誘導方法主要包括主動免疫和過繼性免疫[12]。通過在幼稚小鼠體內輸注自身反應性Th17細胞,亦可誘發(fā)EAU。

2.2B細胞參與EAU模型目前,大多數(shù)EAU模型的機制研究圍繞T細胞展開,產生IFN-γ的Th1細胞和產生IL-17的Th17細胞起關鍵致病作用,而Treg細胞則有助于疾病緩解[13-14]。雖然B細胞在葡萄膜炎中的參與程度及作用不如T細胞明確,但越來越多的證據(jù)表明,B細胞并不僅僅是一個旁觀者,它在NIU中扮演著重要的角色。免疫組化結果顯示,B細胞和漿細胞在EAU中存在浸潤且在晚期逐漸占據(jù)主導地位[15]。這可能與血-眼屏障在終末期被破壞有關。有研究表明,在幼年特發(fā)性關節(jié)炎相關性葡萄膜炎(juvenile idiopathic arthritis-associated uveitis, JIAU)患兒的外周血中,Breg細胞比例明顯降低,這可能成為判斷疾病嚴重程度的潛在指標[16]。機體免疫調節(jié)呈現(xiàn)網絡特性,需協(xié)調各類免疫細胞及細胞因子,并不是由單一細胞類型負責。僅僅強調T細胞在NIU中發(fā)揮作用的理論體系存在許多漏洞。有研究發(fā)現(xiàn),IFN-γ缺陷小鼠反而發(fā)展成更嚴重的EAU[15]。另一方面,蘇金單抗,一種IL-17A拮抗劑,并未顯示出比安慰劑明顯更好的療效[17]。因此,我們有理由認為NIU機制研究中存在的空缺由免疫功能強大的B細胞填補。此外,眼睛是大腦的延伸,神經組織和眼組織起源于同一胚胎細胞,因而有研究者主張中樞神經系統(tǒng)自身免疫病和自身免疫性葡萄膜炎的發(fā)病機制存在互通點。在多發(fā)性硬化(multiple sclerosis, MS)患者體內,B細胞可通過多種途徑參與MS發(fā)病,包括引發(fā)外周免疫耐受異常、增強向中樞神經系統(tǒng)遷移、介導異?？贵w產生、參與抗原呈遞過程以及促炎和抑炎因子分泌失衡等[18-19]。B細胞在MS及其動物模型的作用方式也可以成為我們推測葡萄膜炎發(fā)病機制的一個參考點。下文將對現(xiàn)有相關研究進行歸納與闡述。

2.2.1產生抗體B細胞可分化為產生抗體的漿細胞,進而與靶細胞抗原結合形成免疫復合物發(fā)揮生物效應,比如補體依賴性細胞毒性(CDC),抗體依賴性細胞吞噬作用(ADCP)或抗體依賴性細胞毒性(ADCC)。外周血中漿細胞比例呈現(xiàn)遞增-遞減趨勢,消耗漿細胞可以改善EAU[20]。另外,T細胞聯(lián)合血清比單獨的T細胞轉移更容易引發(fā)EAU,并且會持續(xù)加重病情,這表明抗體促使疾病發(fā)展[21]。由于抗體分子量較大,難以穿越血眼屏障進入眼內,因此B細胞在晚期屏障受損后才發(fā)揮明顯的致病作用。利用生物熒光技術監(jiān)測眼內免疫細胞的動態(tài)變化,發(fā)現(xiàn)B細胞直到EAU誘導28 d后才明顯增加[22]。眼部浸潤的B細胞數(shù)量增加可能與疾病持續(xù)時間的延長及病情的加重有關。有趣的是,在EAU誘導前后7 d給予B細胞耗竭劑可以得到完全不同的結果,表明早期B細胞具有保護作用,隨后才轉變?yōu)橹虏∽饔谩＿@也進一步說明B細胞在NIU發(fā)病機制中的復雜性。

2.2.2抗原提呈B細胞還可作為抗原提呈細胞影響T細胞的活動進而間接發(fā)揮作用。RTX消耗CD20+B細胞,但不包括分泌抗體的漿細胞。研究顯示,在某些NIU患者中,RTX取得不錯療效[5,23-24],這意味著B細胞在葡萄膜炎的致病過程中發(fā)揮除了分泌抗體之外的其他重要功能。目前關于B細胞在NIU中如何具體的發(fā)揮并調節(jié)間接功能的研究仍然不足。只有少量的文獻顯示葡萄膜炎中B細胞與T細胞的聯(lián)系。B細胞表面必須表達MHC分子才能發(fā)揮抗原呈遞作用。在EAE B-MHC Ⅱ-/-小鼠中,自身抗原誘導的疾病被消除,效應T細胞克隆擴張及應答顯著減少,分化為記憶性T細胞的過程也受到影響[25]。此外,缺乏STAT3的B細胞通過促進致病性Th17細胞擴增和抑制Breg、Treg細胞分化而加重葡萄膜炎[26]。

2.2.3分泌細胞因子效應B細胞可產生促炎細胞因子,如IL-6、IFN-γ和GM-CSF;調節(jié)性B細胞產生抑炎因子,如IL-10、IL-35和TGF-β,負調控免疫應答[27]。自身反應性B細胞過度表達促炎細胞因子IL-6會加速實驗性自身免疫性腦脊髓炎模型的發(fā)展[28]。類似地,在敲除EAU小鼠的IL-6基因后,其眼部炎性反應明顯減輕[29]。玻璃體腔內注射抗IL-6抗體也可減輕EAU癥狀[27]。同時,有研究表明葡萄膜炎患者的眼內液和外周血中的IL-6表達均顯著升高[30-31]。IL-6可調節(jié)Treg/Th17平衡[32],還可誘導濾泡輔助T細胞(T follicular helper,Tfh)細胞分化[33]。B細胞協(xié)同T細胞、單核細胞、樹突狀細胞等大量分泌IL-6,共建炎性微環(huán)境,級聯(lián)放大免疫反應,最終促成疾病的發(fā)生。其他的重要促炎細胞因子,比如IFN-γ和GM-CSF也有類似的作用[34-35]。另一方面,Breg細胞通過分泌IL-35、IL-10這樣的抑炎細胞因子,抑制致病性Th1/Th17途徑,促進Treg細胞和Breg細胞自身擴增,進而對葡萄膜炎乃至中樞神經系統(tǒng)自身免疫病起保護作用[36]。CD83+B細胞通過分泌可溶性CD83在EAU中發(fā)揮調節(jié)作用[37]。這啟示我們,相比于泛性消耗B細胞,選擇性消耗效應B細胞并同時保留調節(jié)B細胞可能是更有效的治療方案。

2.2.4形成異位淋巴結構異位淋巴結構(ectopic lymphoid structure, ELS)是在非淋巴組織中發(fā)展的有組織性的免疫細胞聚集體[38]。在嚙齒類動物和馬的虹膜、睫狀體和視網膜也曾描述過ELS樣結構,并提示其與葡萄膜炎的慢性或復發(fā)性病程有關[39-40]。這些ELS樣結構可能代表抗原特異性B細胞增殖、突變和成熟的場所,也是自身抗體的產生部位。

3 B細胞與人類NIU

人類NIU的種類極為復雜,目前已超過60種,并且還在持續(xù)增加。EAU模型與現(xiàn)實世界中的實質存在差距,沒有任何一種動物模型能夠完整地代表人類NIU譜系:(1)實驗模型的抗原是單一固定的,而人類實體具有多樣性和未知性。(2)還存在著基于眼部解剖特征、組織組成和成分功能的差異,例如,人類的脈絡膜較鼠類更厚[41],并且脈絡膜血流量豐富,被認為與自身免疫性炎癥相關聯(lián)[42]。(3)人類葡萄膜炎的發(fā)病常常呈現(xiàn)復發(fā)-緩解的特點,難以完全控制。因此,EAU模型的局限性提示人類葡萄膜炎具有更為復雜的內在發(fā)病機制,而B細胞的參與在其中起著重要的作用。

3.1B細胞參與人類NIU的證據(jù)NIU患者的脈絡膜、虹膜、睫狀體存在B細胞和(或)漿細胞浸潤,雖然大多數(shù)以T細胞為主,但在某些情況下占據(jù)主導[43-44]。眼部結構組織標本通常在疾病終末期獲取,具有慢性、反復發(fā)作的病程特點。值得我們考慮的是,B細胞浸潤是否隨著慢性病程的延續(xù)而增加,還是后者吸引來更多的B細胞?又或者兩者是相互加強的循環(huán)?免疫組化的結果代表的是病程不同階段還是繼發(fā)性病理改變,這很難界定。外周血中B細胞總量正常,但其亞群發(fā)生顯著改變,表現(xiàn)為幼稚B細胞減少,活化和記憶B細胞亞群水平的增加[45]。這反映了B細胞功能的變化。也有其他研究報道外周血B細胞總量降低,主要是CD27+記憶B細胞水平降低[46-48]。這種偏差可能解釋為B細胞向炎癥部位遷移,與疾病活動性和治療效果有關。此外,與B細胞反應相關的濾泡T輔助細胞亞群也發(fā)生改變[49]。NIU患者血清酶聯(lián)免疫吸附試驗顯示炎性細胞因子,如TNF-α、IL-6及B細胞相關因子(包括BAFF、APRIL、BCMA、BlyS)的水平增加[50-52];血清中免疫球蛋白及組織特異性抗原抗體滴度增加,JIAU患者虹膜B細胞相關蛋白MZB1也增加[53]。在眼內液,包括房水和玻璃體液中,也觀察到B細胞相關炎性因子的上調[50,54]。近年來高通量基因測序分析在眼病中的應用越發(fā)廣泛。從微觀轉錄組學角度來看,葡萄膜及外周血的RNA轉錄組數(shù)據(jù)分析顯示一系列涉及B細胞激活及分化相關的特異性差異基因上調、抑制BCR信號轉導的基因下調以及B細胞相關信號通路富集[50,55]。此外,有研究采用單細胞測序技術(scRNA-seq)和流式細胞技術構建EAU和伏格特-小柳-原田綜合征(Vogt-Koyanagi-Harada Syndrome,VKH)患者B細胞亞群免疫分型及豐度圖譜[20],隨后還發(fā)現(xiàn)自然殺傷樣B細胞可能參與葡萄膜炎致病過程[56]。以上結果顯示了B細胞免疫應答的激活在NIU發(fā)病機制中的可能作用。

3.2B細胞在人類NIU中發(fā)揮功能的途徑總的來說,B細胞在葡萄膜炎中發(fā)揮功能的途徑尚不明確,但我們可以從下面幾個方面考慮:(1)直接的抗體依賴途徑。外周免疫耐受失調,血-眼屏障被破壞,外周效應B細胞遷移并浸潤在炎癥部位,漿細胞分泌抗原特異性抗體進而介導免疫損傷。有個案報道患有抗體形成缺陷病的JIAU患者關節(jié)炎和葡萄膜炎癥狀都完全緩解了[57]。(2)B細胞還可充當抗原提呈細胞與T細胞互作,或者其他免疫細胞的互動,但在葡萄膜炎中尚缺乏直接研究證據(jù)。RTX在幾種葡萄膜炎的成功應用證明了B細胞的間接作用。(3)正如上文所述,炎性細胞因子如IL-6和IFN-γ可由B細胞分泌,并且疾病組的濃度明顯升高,這表明B細胞可以通過分泌多種細胞因子發(fā)揮作用。(4)少數(shù)人類眼組織標本具有ELS特征,并伴隨著與B細胞功能相關的免疫基因的上調[58]。眼部特征性免疫細胞浸潤,組織結構重塑和改變,形成組織內高度免疫監(jiān)視,可能與葡萄膜炎中的B細胞免疫調節(jié)療法有臨床相關性,并影響葡萄膜炎的預后。

4 B細胞耗竭療法在NIU中的應用

在歷史上,NIU的治療一直依賴于皮質類固醇藥物。然而,激素的使用,尤其是長期或大劑量的使用,會導致全身和眼部的不良反應,如眼壓升高、青光眼和白內障[59]。NIU的治療重點是抑制過度的自身免疫反應,同時減輕藥物毒副作用,減少眼組織損傷,最大程度地保護視功能。因此,基于疾病機制的方法最有可能在未來葡萄膜炎治療方面取得突破,其中就包括了BCDT。它最初是用于消除癌性B細胞,現(xiàn)在可用于治療自身免疫性疾病,包括NIU[4]。

4.1利妥昔單抗RTX是一種抗CD20人/鼠嵌合的單克隆抗體,可誘導耗竭CD20+B細胞[60]。對于那些對傳統(tǒng)皮質類固醇和免疫抑制劑治療無效的嚴重JIAU患者,經過RTX治療后,大多數(shù)葡萄膜炎和關節(jié)炎的活動性趨于靜止[61]。對于聯(lián)合免疫抑制治療無效的難治性VKH患者,RTX可減少激素用量并加強對炎癥的控制[5,62]。一項關于多發(fā)性硬化相關性葡萄膜炎的回顧性研究顯示,接受抗CD20制劑治療后,患眼的玻璃體混濁、視網膜血管炎、黃斑水腫和視力都有顯著改善,同時每年葡萄膜炎或多發(fā)性硬化復發(fā)的次數(shù)也有所減少,疾病活動也趨于靜止[63]。然而,目前研究的樣本量都較小,RTX尚未廣泛應用于NIU的治療中,其有效性與安全性仍需進一步的循證醫(yī)學證據(jù)。

4.2其他B細胞抑制劑其他針對B細胞表面抗原和BAFF/APRIL的治療藥物,如奧妥珠單抗、貝利木單抗、泰它西普等,尚未被應用于葡萄膜炎的治療。

5 總結與展望

本綜述通過系統(tǒng)整理,全面評價了近年來B細胞在NIU研究領域的最新進展。我們認識到T細胞不再是NIU發(fā)病機制中的唯一主角。B細胞在EAU模型和臨床患者中的參與已有充分證據(jù)支持。B細胞在病程中以抗體依賴或獨立于抗體分泌的多種方式同樣發(fā)揮至關重要的作用。然而,目前的研究尚不能完全解釋以下科學問題:(1)B細胞誘導眼內組織特異性損傷的具體分子機制;(2)B細胞與T細胞、樹突狀細胞、小膠質細胞等其他免疫細胞互作模式;(3)不同病程階段,如晚期、復發(fā)期等,B細胞及其亞群在組織內定位分布及功能的變化;(4)NIU種類繁雜,內部具有異質性,那么B細胞在不同類別NIU中的參與是否存在差異。為了更好地理解NIU的病理機制,研究者可從上述現(xiàn)存的問題出發(fā),開展更進一步的研究。

RTX為難治性、反復性NIU患者提供了新的治療選擇,并且聯(lián)合其他免疫抑制劑可能減少治療周期和劑量。然而,其安全性和有效性仍有待更多大規(guī)模臨床研究支持。各種靶向CD20、CD19和BAFF/APRIL通路的BCDT現(xiàn)在被用于治療系統(tǒng)性紅斑狼瘡、多發(fā)性硬化癥等自身免疫性疾病[64-65]。研究者可對比針對不同B細胞相關分子或特異性B細胞亞群的治療效果,為NIU的個體化治療提供支撐。除了抑制高度特異性和敏感性的致病性B細胞外,還應促進免疫調節(jié)性B細胞發(fā)揮功能?？偠灾?我們可以嘗試開發(fā)可靠的工具來監(jiān)測B細胞及其在NIU的免疫活動反應,以尋找更安全有效的靶向B細胞的生物制劑,最終優(yōu)化臨床決策。