王常斌，王秀秀，陳洪建，艾沖沖，萬(wàn)敏，盧文博

1. 山東省醫(yī)療器械和藥品包裝檢驗(yàn)研究院，山東 濟(jì)南 250101；2. 國(guó)家藥品監(jiān)督管理局生物材料器械安全性評(píng)價(jià)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 濟(jì)南 250101；3. 山東省醫(yī)療器械生物學(xué)評(píng)價(jià)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 濟(jì)南 250101

引言

生物可吸收膠原蛋白因其低免疫原性、修復(fù)特性和止血特性等優(yōu)異性能成為了理想的生物醫(yī)學(xué)材料，被廣泛應(yīng)用于醫(yī)用敷料、骨修復(fù)材料等領(lǐng)域[1]。研究表明，材料的孔徑和孔隙率的大小對(duì)細(xì)胞的結(jié)合、遷移和長(zhǎng)入以及組織的長(zhǎng)入和再生起著重要的作用[2]。目前，關(guān)于生物可吸收膠原蛋白材料的開發(fā)應(yīng)用方面的報(bào)道較多[3-4]。但該類材料在進(jìn)行微觀結(jié)構(gòu)表征時(shí)，如何獲得高清晰度、高分辨率的掃描電子顯微鏡（Scanning Electron Microscope，SEM）圖像，并利用SEM 圖像分析該類材料的微觀結(jié)構(gòu)，尤其是對(duì)其孔徑和孔隙率系統(tǒng)進(jìn)行分析研究的報(bào)道較少。近年來，該類材料的相關(guān)產(chǎn)品標(biāo)準(zhǔn)陸續(xù)發(fā)布[5-6]，均要求進(jìn)行孔結(jié)構(gòu)（如孔徑大小、孔徑分布、孔隙率等）的表征，而標(biāo)準(zhǔn)中并未提供表征方法。目前，固體材料的孔徑和孔隙的測(cè)試主要采用壓汞法[7]和氣體吸附法[8-9]，但該方法并不適用于膠原蛋白類的材料，因此亟需一種切實(shí)可行的試驗(yàn)統(tǒng)計(jì)方法，以準(zhǔn)確地評(píng)價(jià)膠原蛋白材料的孔徑和孔隙率。

Image J 軟件是一款基于Java 的公共圖像處理軟件[10]。該軟件可快速處理各種圖像，且其圖像數(shù)據(jù)處理簡(jiǎn)捷[11]，可定量計(jì)算煤矸圖像的混合度[12]，實(shí)現(xiàn)顯微圖像細(xì)胞計(jì)數(shù)[13]，并對(duì)煙絲纖維壓片圖像的色度比進(jìn)行定量分析[14]，表征鋰離子電池隔膜表面膜孔的孔隙率[15]，統(tǒng)計(jì)織物孔隙率[16]。利用Image J 軟件，可對(duì)拍攝的SEM 圖像進(jìn)行更全面的信息采集和分析，獲得材料孔徑大小、孔徑分布和孔隙率等信息，避免了單憑拍攝者經(jīng)驗(yàn)、采集信息量小、分析困難等問題[17]，提高了材料微觀結(jié)構(gòu)分析的準(zhǔn)確性，為科學(xué)評(píng)價(jià)材料提供技術(shù)支持。

本文旨在針對(duì)膠原蛋白材料微觀形貌表征，如何進(jìn)行樣品制備，以及如何利用場(chǎng)發(fā)射SEM 選擇合適的試驗(yàn)參數(shù)和加速電壓，并對(duì)獲得的SEM 圖像如何進(jìn)行孔隙率和孔徑分布的分析提出了相應(yīng)的檢測(cè)方法和解決方案。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

測(cè)試樣品為可吸收硬膜修補(bǔ)材料（Integra LifeSciences Corporation，美國(guó)），見圖1，長(zhǎng)度約5 cm，寬度約1 cm。

圖1 可吸收硬膜修補(bǔ)材料實(shí)物圖

1.2 主要儀器設(shè)備

場(chǎng)發(fā)射SEM：SU8010（HITACHI，日本）；離子濺射儀：KAS-2000F（BRIGHT，英國(guó)）；分析軟件：Image J（版本1.8.0）。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 樣品制備

使用鋒利的手術(shù)刀片或剪刀將樣品裁剪，裁剪過程中盡量保持樣品的形態(tài)結(jié)構(gòu)，避免樣品變形以影響形貌的觀察，裁剪后的表面應(yīng)光滑平整。將裁剪后的樣品橫截面用導(dǎo)電膠固定于樣品臺(tái)上，并用導(dǎo)電膠橋接樣品。

1.3.2 拍攝SEM圖像

將場(chǎng)發(fā)射SEM 工作距離設(shè)定為8 mm，選擇Lower探頭。因膠原蛋白材料不導(dǎo)電、荷電現(xiàn)象明顯，采用不同加速電壓、噴金等方式以獲得清晰無荷電的圖像。其中加速電壓選擇6 個(gè)，分別為0.5、1、2、5、10、15 kV。掃描速度為40 s。離子濺射條件為鉑靶，濺射電流為5 mA，濺射時(shí)間為90 s。離子濺射后選擇同樣的6 個(gè)加速電壓觀察樣品。

1.3.3 分析樣品的孔徑和孔隙率

利用Image J 軟件對(duì)獲得的SEM 圖像進(jìn)行分析，具體分析步驟如下：將獲得的SEM 圖像在Image J 軟件中打開，選中原圖進(jìn)行尺寸標(biāo)定，在尺寸設(shè)置中輸入實(shí)測(cè)的單位和尺寸，然后在原圖上選中不包括設(shè)備信息、標(biāo)尺的區(qū)域，點(diǎn)擊裁剪得到需要分析的圖像；在進(jìn)行表面孔隙率分析時(shí)，首先點(diǎn)擊工具欄中的分析選項(xiàng)，設(shè)置測(cè)量值，然后點(diǎn)擊工具欄中的圖像調(diào)整閾值，最后分析測(cè)量得到的樣品孔隙率結(jié)果；在進(jìn)行表面孔徑分析時(shí)，首先點(diǎn)擊工具欄中的分析選項(xiàng)，設(shè)置測(cè)量值，然后點(diǎn)擊工具欄中的圖像調(diào)整閾值，再點(diǎn)擊分析選項(xiàng)分析微粒設(shè)置，最后通過“費(fèi)雷特”分析得到樣品的孔徑結(jié)果。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

對(duì)Image J 軟件分析得到的孔徑和孔隙率進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)計(jì)算及分析，以離散系數(shù)Cv＜10%為測(cè)試數(shù)據(jù)的重復(fù)性較高，結(jié)果可信。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同加速電壓下SEM圖像分析

加速電壓是SEM 的一個(gè)重要參數(shù)，場(chǎng)發(fā)射SEM 的加速電壓可連續(xù)調(diào)節(jié)。電壓越高，入射電子束的能量越大，產(chǎn)生的二次電子越多，圖像襯度越好，分辨率越高。然而，入射電子束會(huì)導(dǎo)致樣品出現(xiàn)荷電現(xiàn)象，電子束能量越高越明顯，從而造成樣品燒蝕或扭曲變形[18]。因此，不耐電子束轟擊的材料難以得到很清晰的SEM 圖像，例如本研究的可吸收硬膜修補(bǔ)材料，在高電壓下容易變形扭曲。此外，電荷累積會(huì)在SEM 圖像上顯示為高亮區(qū)域，軟件難以通過亮度區(qū)域進(jìn)行精確統(tǒng)計(jì)，給精確分析帶來一定困難。

在不噴金的條件下，分別在0.5、1、2、5、10、15 kV電壓下拍攝的SEM 圖像如圖2 所示。加速電壓小于2 kV時(shí)，材料表面形貌保持較好，孔徑結(jié)構(gòu)沒有明顯變化。然而，電壓達(dá)到5 kV 時(shí)，孔徑結(jié)構(gòu)發(fā)生坍塌（圖2d 右上方區(qū)域），說明納米級(jí)有機(jī)化合物孔壁在電子束作用下結(jié)構(gòu)遭到破壞，軟化變形。繼續(xù)升高電壓到10 kV 和15 kV，初始樣品均一的孔徑結(jié)構(gòu)發(fā)生了明顯破碎（圖2e、2f標(biāo)示區(qū)域），這可能是有機(jī)結(jié)構(gòu)在高強(qiáng)度的電子束作用下發(fā)生了燒蝕所致。因此，生物樣品表面受到較高電壓的灼燒和電子束的轟擊時(shí)，樣品形貌出現(xiàn)扭曲變形，無法得到清晰的圖像，不利于準(zhǔn)確地進(jìn)行孔徑和孔結(jié)構(gòu)分析。在低于2 kV 時(shí)，SEM 圖像形貌較完整，但是清晰度和分辨率仍需改善。需要注意的是，圖2b、2d 左上區(qū)域亮度明顯強(qiáng)于其他區(qū)域，這很可能是產(chǎn)生了荷電效應(yīng)所致。

圖2 不噴金樣品在不同加速電壓下的SEM圖像

2.2 樣品噴金后結(jié)果分析

樣品噴金可以很好地解決電荷累積問題，有效提升材料耐受的電子束強(qiáng)度，顯著提升SEM 圖像的分辨率[16]。噴金條件下，分別在0.5、1、2、5、10、15 kV 電壓下拍攝的SEM 圖像如圖3 所示。通過噴金，樣品的荷電效應(yīng)明顯減少，表現(xiàn)出較好的耐熱和耐受電子束轟擊的能力，即使在15 kV 電壓時(shí)依然能得到較清晰的圖像，且材料表面結(jié)構(gòu)沒有被破壞，圖像亮度均一，不存在電荷集聚現(xiàn)象。

圖3 噴金樣品在不同加速電壓下的SEM圖像

樣品噴金后在進(jìn)行SEM 拍攝時(shí)，會(huì)將表面聚集的大量電荷傳導(dǎo)轉(zhuǎn)移，減少了荷電現(xiàn)象，提高了樣品耐受電子束轟擊的能力，但是鍍金層也會(huì)掩蓋樣品表面的部分細(xì)節(jié)。在觀察此類樣品時(shí)，使用較低的加速電壓直接觀察樣品，會(huì)得到表面細(xì)節(jié)更加豐富、輪廓邊緣更加清楚的表面形貌[19]。綜合考慮樣品電子轟擊的耐受性和清晰度，本文建議使用場(chǎng)發(fā)射SEM 觀察此類材料時(shí)選擇1 kV 或更低的加速電壓。

2.3 采用Image J軟件結(jié)果分析

本文采用Image J 軟件分別對(duì)未噴金和噴金樣品的孔結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析。對(duì)未噴金樣品，1 kV 加速電壓下的SEM 圖像（圖4a）使用Image J 軟件分析得到的孔隙率如圖4b 所示，其中黑色部分為軟件分析的孔，與SEM圖像分析結(jié)果相近。相對(duì)于人工統(tǒng)計(jì)計(jì)算的繁瑣，使用Image J 軟件統(tǒng)計(jì)結(jié)果更加快捷方便。利用Image J軟件分析樣品的孔隙率，得出該SEM 圖像的孔隙率為58.6%。值得注意的是，SEM 圖像的高亮區(qū)域（圖4a紅色方框區(qū)域）在軟件分析中并沒有作為孔存在的區(qū)域（圖4b、4d 的紅色方框區(qū)域），這說明在電荷集聚區(qū)域，現(xiàn)有的Image J 軟件還不能有效地進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。材料在1 kV 加速電壓下的孔徑分布圖如圖4c 所示，與SEM圖像接近。利用Image J 軟件分析樣品的孔徑，得出該SEM 樣品的孔徑最小值為2 μm，最大值為204 μm，平均值為12 μm。

圖4 1 kV未噴金樣品的SEM圖像（a）、使用Image J軟件分析得到的孔隙率圖（b）、Image J軟件分析得到的孔徑分布結(jié)果圖（c）和使用Image J軟件分析得到的孔徑圖（d）

噴金樣品在15 kV 加速電壓下的SEM 圖（圖5a）的孔徑分析如圖5b、5d 所示。15 kV 加速電壓下，圖像亮度和清晰度均有較大提升，解決了電荷集聚現(xiàn)象，具有更精確的統(tǒng)計(jì)結(jié)果。圖5c 的孔徑分布結(jié)果顯示，該樣品孔徑最小值為2 μm，最大值為207 μm，平均值為14 μm。

圖5 15 kV噴金樣品的SEM圖像（a）、使用Image J軟件分析得到的孔隙率圖（b）、Image J軟件分析得到的孔徑分布結(jié)果圖（c）、使用Image J軟件分析得到的孔徑圖（d）

通過對(duì)未噴金樣品和噴金樣品的孔徑結(jié)果進(jìn)行分析可知，在孔徑分布方面，噴金樣品和未噴金樣品的統(tǒng)計(jì)結(jié)果差別不大。在拍攝時(shí)選擇合適的加速電壓，樣品則不必采用噴金方式，可降低測(cè)試過程檢測(cè)費(fèi)用，節(jié)省時(shí)間。但是如果對(duì)尺寸要求較嚴(yán)格，則可采用適度噴金方式，提高膠原蛋白材料耐受電壓轟擊的能力，減少不導(dǎo)電樣品的荷電現(xiàn)象，提高測(cè)試結(jié)果的準(zhǔn)確性。

為了驗(yàn)證SEM 圖片和Image J 方法測(cè)試結(jié)果的有效性，對(duì)同一樣品隨機(jī)選取不同區(qū)域區(qū)域的孔結(jié)構(gòu)進(jìn)行測(cè)試，測(cè)試數(shù)據(jù)如表1 所示，均為1 kV 加速電壓下在未噴金樣品上采集的數(shù)據(jù)。不同區(qū)域采集的平均孔隙率為50.9%，孔隙率Cv為8.6%＜10%；平均孔徑為11.9 μm，孔徑Cv為6.7%＜10%，說明上述測(cè)試方法測(cè)試數(shù)據(jù)的重復(fù)性較高，結(jié)果可信。能夠作為相關(guān)樣品孔徑分析的檢驗(yàn)方法。

表1 1 kV加速電壓下，同一樣品不同區(qū)域的孔隙率孔徑分析數(shù)據(jù)

膠原蛋白材料密度小，導(dǎo)電性差，較高電壓下樣品受電子束轟擊易塌陷變形，而選擇合適的加速電壓可以減少荷電現(xiàn)象，獲得細(xì)節(jié)豐富、輪廓清晰的微觀形貌[18]。樣品在噴金后其耐受電子束轟擊的能力得到了提高，在較低加速電壓和較高加速電壓的情況下，均可獲得更加清晰的微觀結(jié)構(gòu)。使用Image J 軟件可分析所得圖像的孔隙率和孔徑分布，該方法克服了壓汞法和氣體吸附法無法對(duì)該類材料孔結(jié)構(gòu)進(jìn)行檢測(cè)的缺點(diǎn)，減少了人工理論計(jì)算的繁瑣步驟，節(jié)省了科研人員的時(shí)間和經(jīng)濟(jì)成本，且方法有效可行。

但本方法仍存在一些不足之處：使用Image J 軟件分析的SEM 圖像是二維圖像，對(duì)于一些三維孔結(jié)構(gòu)參數(shù)，如孔容積無法獲得[20]；另外，有些膠原蛋白材料含有水分[21]，無法直接使用SEM 進(jìn)行觀察，而樣品干燥后其微觀結(jié)構(gòu)可能已被改變，對(duì)于該類材料孔結(jié)構(gòu)的評(píng)價(jià)仍存在一定的困難。

3 討論與總結(jié)

本研究針對(duì)可吸收膠原蛋白材料耐受電壓有限、導(dǎo)電性差、在不噴金條件下易發(fā)生電荷積聚和表面燒蝕的問題，提出了利用場(chǎng)發(fā)射SEM 結(jié)合Image J 軟件表征該類材料微觀結(jié)構(gòu)的方法。選擇合適的加速電壓，可以得到較清晰的SEM 圖像；噴金后，樣品導(dǎo)電性和耐電子束轟擊性能顯著提升，可以在較高加速電壓下獲得更清晰的圖像，有利于對(duì)孔徑結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析。利用Image J 軟件，可對(duì)可吸收膠原蛋白材料的SEM 圖像進(jìn)行定量分析。實(shí)際測(cè)試中，使用場(chǎng)發(fā)射SEM 拍攝不噴金樣品的情況下，選用低電壓的方式即可滿足大部分孔徑結(jié)構(gòu)分析需求，在個(gè)別尺寸要求嚴(yán)格的情況下可采用適當(dāng)噴金。

綜上所述，SEM 圖像和Image J 軟件結(jié)合可以直觀地分析可吸收膠原蛋白材料的孔的結(jié)構(gòu)特性（包括孔隙率、孔徑等信息），解決相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)中方法缺失的問題，為研究該材料的臨床應(yīng)用提供數(shù)據(jù)支持。