劉廣梅

胸部腫瘤在放射治療中肺組織接受較高劑量或較大容積照射,易發(fā)生放射性肺炎,直接或間接導(dǎo)致病理性改變,表現(xiàn)為炎癥介質(zhì)釋放,細(xì)胞因子活化,放射性肺炎為胸部放療常見的并發(fā)癥,發(fā)病率約為10%[1,2]。輔助性T細(xì)胞17(Th17細(xì)胞)通過(guò)分泌細(xì)胞因子促進(jìn)炎癥性疾病發(fā)生,調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞(Treg 細(xì)胞)可抑制炎癥反應(yīng)的發(fā)生,Th17/Treg 細(xì)胞在機(jī)體內(nèi)存在動(dòng)態(tài)平衡[3,4]。Th17/Treg失衡參與了重癥肺炎的發(fā)生發(fā)展,檢測(cè)外周血Th17和Treg的百分率及其相應(yīng)細(xì)胞因子水平對(duì)評(píng)估重癥肺炎的病情和預(yù)后有重要的臨床意義[5]。核因子-κB(NF-κB )為具有多種功能的核轉(zhuǎn)錄因子,能夠參與多種基因啟動(dòng)子,在肺部疾病、感染、炎癥反應(yīng)時(shí)NF-κB 被激活,而NF-κB 通路中p65和 IκBα 在肺炎中發(fā)揮關(guān)鍵作用[6,7]。有研究發(fā)現(xiàn),NF-κB和PI3K-Akt通路參與調(diào)控肺炎鏈球菌HSP40誘導(dǎo)BMDM免疫應(yīng)答的過(guò)程[8]。肺寧湯為新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第三附屬醫(yī)院治療肺炎的院內(nèi)協(xié)定方,具有清熱解毒、養(yǎng)陰清肺功效,具有較好的臨床療效,但其作用機(jī)制尚不明確。本研究探討肺寧湯對(duì)急性放射性肺炎模型大鼠細(xì)胞炎癥因子、外周血 Th17/Treg 平衡及NF-κB 通路的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司采購(gòu)SD大鼠,雄性,體質(zhì)量(220±20)g,鼠齡8～10周,生產(chǎn)許可證(SCXK-[京]2012-0001),動(dòng)物合格證號(hào):110011191100175。12 h晝夜節(jié)律飼養(yǎng),自由飲水進(jìn)食,符合《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理?xiàng)l件》要求。

肺寧湯藥物組成:牛蒡子10 g,白花蛇舌草10 g,黃芩10 g,麻黃10 g,杏仁15 g,麥冬15 g,熟地黃10 g,連翹15 g,苦參10 g,川貝母10 g,黃精10 g,魚腥草10 g,甘草10 g。各味藥材均有院內(nèi)中藥房提供,藥材加水煎煮2次,濃縮至1 ml含1 g原藥材的藥液。地塞米松片(廣東華南藥業(yè)集團(tuán)有限公司,生產(chǎn)批號(hào):20220412),加生理鹽水配置成0.125 mg/ml的溶液。HE染色液(上海研域化學(xué)試劑有限公司),IFN-γ、TNF-α和IL-6檢測(cè)試劑盒(北京中同生物技術(shù)有限公司),CD4、CD25、Foxp3、IL-17A抗體試劑盒(美國(guó)BD公司),抗體 p65和IκBα蛋白一抗(南京建成生物科技公司),二抗(河北博海生物工程開發(fā)有限公司),顯色液(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)。

Precise型醫(yī)用直線加速器(瑞典醫(yī)科達(dá)公司),RM2235型病理切片機(jī)(德國(guó)萊卡公司),NIKON CI-S型倒置顯微鏡(日本尼康公司),TD5A-WS/TD5AWS型低速離心機(jī)(湖南湘儀離心機(jī)有限公司),ELx800酶標(biāo)儀(美國(guó)伯騰儀器有限公司),FACSCalibur 型流式細(xì)胞儀(美國(guó)BD公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 動(dòng)物分組與給藥40只SD大鼠除空白組的30只,水合氯醛腹腔麻醉,平躺仰臥于照射臺(tái)上,充分暴露胸部,固定,Precise型醫(yī)用直線加速器調(diào)整照射野,上至大鼠前肢兩腋窩中點(diǎn)連線,下至胸骨劍突水平,直線加速器進(jìn)行全胸單次照射,源靶距為100 cm,劑量率為250 cGy/min,總劑量為16 Gy[9]。照射完畢大鼠自然蘇醒后,常規(guī)飼養(yǎng)?？瞻捉M近麻醉固定,同等條件下肺部假照射。與照射后第2天開始干預(yù),空白組和模型組給予生理鹽水灌胃,試驗(yàn)組給予肺寧湯灌胃,陽(yáng)性組給予地塞米松灌胃,劑量分別為5 ml/kg,每日1 次,連續(xù)給藥14 d。

1.2.2 標(biāo)本采集給藥2周后,取各組大鼠,麻醉,固定于木板上,腹主動(dòng)脈取血,肝素鈉抗凝管留取2 ml,然后摘取右肺中葉,10%福爾馬林溶液固定,摘取余肺,液氮冷卻后-86 ℃保存。

1.2.3 HE染色取10%福爾馬林溶液固定的右肺中葉,不同濃度的乙醇脫水,二甲苯固定,石蠟包埋,切片,厚度為5 μm,烤片,二甲苯脫蠟,乙醇水化,蘇木精染色,鹽酸乙醇溶液中分化,自來(lái)水沖洗返藍(lán),伊紅染色,中性樹膠進(jìn)行封片,顯微鏡下觀察。

1.2.4 炎癥因子檢測(cè)取肝素鈉抗凝管留取2 ml,離心,取上清,采用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)測(cè)定各組大鼠血清干擾素-γ(IFN-γ)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)和白細(xì)胞介素-6(IL-6)水平,按照說(shuō)明書操作。

1.2.5 流式細(xì)胞檢測(cè)取肝素鈉抗凝管留取2 ml,離心,取中間部分,分為2份,一份行外周血 Th17細(xì)胞含量檢測(cè),加入溶血素,離心,加入磷酸鹽緩沖液洗滌2次,重懸細(xì)胞,避光孵育,先染表面抗體CD4及同型,破膜后再染IL-17,上機(jī)檢測(cè)分析。一份行Treg細(xì)胞含量檢測(cè),10%溶血素裂解紅細(xì)胞,先染表面抗體CD4、CD25,破膜后再染Foxp3,上機(jī)檢測(cè)分析。

1.2.6 Western Blot檢測(cè)取新鮮冷凍肺組織,適量,加入含有蛋白酶抑制劑的細(xì)胞裂解液,肺組織勻漿,離心,取上清,BCA測(cè)定蛋白濃度,勻漿上清液與上樣緩沖液等量混合,電泳,轉(zhuǎn)膜,封閉,一抗4 ℃過(guò)夜,二抗室溫孵育1 h,漂洗,ECL曝光液曝光,凝膠成像系統(tǒng)檢測(cè),測(cè)定各組條帶灰度值,按照說(shuō)明書操作。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠肺組織病理學(xué)形態(tài)比較空白組大鼠肺組織結(jié)構(gòu)正常,未見炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。模型組肺泡壁增寬,肺泡壁結(jié)構(gòu)不完整,炎性滲出水腫明顯,肺泡內(nèi)大量炎性細(xì)胞,可見大量巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞等炎性細(xì)胞浸潤(rùn),肺泡壁結(jié)構(gòu)不完整,纖維素樣滲出物,局灶性壞死。試驗(yàn)組和陽(yáng)性組充血、水腫、滲出等顯著改善,炎細(xì)胞浸潤(rùn)減輕,可見少量炎性細(xì)胞,間質(zhì)輕度水腫,肺泡壁結(jié)構(gòu)相對(duì)完整。見圖1。

圖1 大鼠肺組織病理改變比較(HE染色,x400倍)

2.2 各組大鼠炎癥因子水平比較與空白組比較,模型組IFN-γ、TNF-α和IL-6水平顯著升高(P<0.05),提示急性放射性肺炎模型大鼠炎癥因子水平顯著升高。治療后,與模型組比較,試驗(yàn)組和陽(yáng)性組IFN-γ、TNF-α和IL-6水平顯著降低(P<0.05),但試驗(yàn)組和陽(yáng)性組大鼠炎癥因子水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

表1 各組大鼠炎癥因子水平比較 (只,

2.3 各組大鼠外周血Th17和Treg細(xì)胞含量比較與空白組比較,模型組外周血 Th17細(xì)胞含量顯著升高,Treg細(xì)胞含量顯著降低(P<0.05),提示急性放射性肺炎模型大鼠 Th17/Treg 細(xì)胞失衡。治療后,與模型組比較,試驗(yàn)組和陽(yáng)性組Th17細(xì)胞含量顯著降低,Treg細(xì)胞含量顯著升高,且試驗(yàn)組優(yōu)于陽(yáng)性組(P<0.05)。見表2。

表2 各組大鼠外周血 Th17和Treg細(xì)胞含量比較 (只,

2.4 各組大鼠p65和IκBα蛋白表達(dá)水平比較與空白組比較,模型組肺組織p65蛋白表達(dá)水平顯著升高,IκBα蛋白表達(dá)水平顯著降低(P<0.05),提示急性放射性肺炎模型大鼠 肺組織p65顯著升高,IκBα顯著降低。給予肺寧湯和地塞米松灌胃2周后,與模型組比較,試驗(yàn)組和陽(yáng)性組肺組織p65蛋白表達(dá)水平顯著降低,IκBα蛋白表達(dá)水平顯著升高,且試驗(yàn)組優(yōu)于陽(yáng)性組(P<0.05)。見表3。

表3 各組大鼠組織p65和IκBα蛋白表達(dá)水平比較

3 討論

放射性肺炎為放療過(guò)程中常見的并發(fā)癥,西醫(yī)治療以糖皮質(zhì)激素及免疫抑制劑為主,雖有療效,但不良反應(yīng)較多,中醫(yī)藥治療放射性肺炎優(yōu)勢(shì)明顯,療效顯著,為放射性肺炎的防治提供了新思路。放射性肺炎屬中醫(yī)“肺痿、肺痹”等范疇,外來(lái)火熱邪毒,熱邪犯肺可耗傷氣血陰津,導(dǎo)致肺失濡養(yǎng),造成干咳、氣喘、出血等典型癥狀,治宜清熱解毒,養(yǎng)陰潤(rùn)肺[10,11]。研究發(fā)現(xiàn),清肺養(yǎng)陰活血方聯(lián)合潑尼松龍能提高放射性肺炎患者臨床療效,明顯緩解患者癥狀,改善氧化應(yīng)激狀態(tài),增強(qiáng)機(jī)體免疫功能,安全可靠[12]。研究發(fā)現(xiàn),麻杏石甘湯聯(lián)合葦莖湯治療放射性肺炎急性期比單純激素抗感染治療效果顯著[13]。前期臨床也發(fā)現(xiàn)具有清熱解毒、養(yǎng)陰清肺功效肺寧湯對(duì)放射性肺炎具有較好的臨床療效,但其作用機(jī)制尚不明確。

Th17和Treg 是近年發(fā)現(xiàn)的CD4+T細(xì)胞的亞群,參與調(diào)節(jié)機(jī)體的免疫功能并維持其動(dòng)態(tài)平衡,促炎性Th17細(xì)胞與抑制炎癥性Treg細(xì)胞的平衡在自身免疫性疾病和腫瘤免疫中發(fā)揮重要作用[14]。研究發(fā)現(xiàn),放射性肺炎形成過(guò)程中出現(xiàn)Th17/Treg失衡,這為進(jìn)一步揭示放射性肺炎的發(fā)病機(jī)制及臨床尋找放射性肺炎的預(yù)測(cè)因子提供了重要信息。NF-κB 為能特異性結(jié)合基因啟動(dòng)子或增強(qiáng)子的調(diào)節(jié)因子,以p65及p50二聚體形式存在,受到刺激時(shí)IκBα 被降解,釋放NF-κBp65,調(diào)節(jié)炎癥相關(guān)基因的表達(dá)。早期放射性肺損傷NF-κB p65、IL-1β的mRNA表達(dá)明顯上調(diào),IκBα表達(dá)下調(diào),抑制NF-κB p65、減輕炎癥反應(yīng)可能減緩放射性肺損傷[15]。

本研究發(fā)現(xiàn),試驗(yàn)組和陽(yáng)性組少量炎性細(xì)胞,間質(zhì)輕度水腫,肺泡壁結(jié)構(gòu)相對(duì)完整,IFN-γ、TNF-α和IL-6水平顯著降低,Th17細(xì)胞含量顯著降低,Treg細(xì)胞含量顯著升高,肺組織p65蛋白表達(dá)水平顯著降低,IκBα蛋白表達(dá)水平顯著升高。肺寧湯由牛蒡子、白花蛇舌草等13味中藥材組成,方中牛蒡子疏散風(fēng)熱、宣肺透疹、消腫解毒,有抗腫瘤、抗炎、抗糖尿病、抗菌及抗病毒作用;白花蛇舌草清熱、利濕、解毒,具有增強(qiáng)免疫功能和抑瘤等作用;黃芩清熱燥濕、瀉火解毒,麻黃發(fā)汗解表、宣肺平喘、利水消腫;杏仁降氣止咳平喘,具有鎮(zhèn)咳、平喘、增強(qiáng)人體免疫力、抑制和殺死癌細(xì)胞作用;麥冬養(yǎng)陰潤(rùn)肺、益胃生津,具有抗疲勞、清除自由基、提高細(xì)胞免疫功能作用;熟地黃補(bǔ)血滋陰,益精填髓;連翹清熱解毒、散結(jié)消腫;川貝潤(rùn)肺止咳、化痰平喘,用于肺虛、久咳、肺癰、瘰疬、癰腫等,黃精補(bǔ)脾、潤(rùn)肺生津,具有抗病原微生物、抗疲勞、抗氧化作用;魚腥草清熱解毒、消腫療瘡,具有增強(qiáng)免疫力、抗腫瘤、抗病原微生物等藥理作用,甘草調(diào)和諸藥藥性。全方共奏清熱解毒、養(yǎng)陰清肺功效。

綜上所述,肺寧湯可保護(hù)急性放射性肺炎模型大鼠肺組織,其機(jī)制可能與降低細(xì)胞炎癥因子,調(diào)整 Th17/Treg 細(xì)胞平衡,抑制NF-κB 通路蛋白表達(dá)有關(guān)。