祝昕杰 張世亮 馬月香 李昱靜 玄霄宇

原發(fā)性高血壓(Essential hypertension)又稱高血壓病(HBP),其重要表現(xiàn)是平均血壓增加,是心腦血管疾病的危險(xiǎn)因素,與其他危險(xiǎn)因素并存,可損傷心、腦、腎的結(jié)構(gòu)和功能,甚至導(dǎo)致嚴(yán)重后果及器官功能衰竭[1]。高血壓病是導(dǎo)致殘疾和死亡的首要危險(xiǎn)因素,甚至比吸煙和高血糖等更嚴(yán)重[2]。降壓藥物、運(yùn)動(dòng)和減重等方法可達(dá)到降壓目的,但仍有部分患者血壓控制效果不盡如人意[3]。

桑白皮[4]藥用歷史悠久,可追溯到《神農(nóng)本草經(jīng)》。該藥味甘、性寒,歸肺經(jīng),具有瀉肺平喘、利水消腫的功效,用于醫(yī)治肺熱喘咳、顏面浮腫、小便不利等癥狀[5]。研究表明,桑白皮不僅有平喘、鎮(zhèn)咳、祛痰、利尿等藥效,還具有擴(kuò)張毛細(xì)血管、抗炎、鎮(zhèn)痛、抗氧化、抗過敏、降血糖、免疫調(diào)節(jié)等諸多藥理作用[6]。夏枯草性味辛、苦、寒,有助于清肝瀉火、明目、散結(jié)消腫,可用于治療頭痛眩暈、目赤腫痛、目珠夜痛等[7]。藥理學(xué)表明,夏枯草還含有明顯降血壓、降低血糖、抗氧化、抗炎、免疫調(diào)節(jié)等功用[8]。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)聯(lián)通了藥物、成分、靶點(diǎn),將其復(fù)雜的關(guān)系通過網(wǎng)絡(luò)簡(jiǎn)單化、可視化,分析各節(jié)點(diǎn)的關(guān)系,進(jìn)而闡釋中藥對(duì)疾病的作用機(jī)制,搭建了中醫(yī)藥與現(xiàn)代藥理學(xué)的橋梁,為中醫(yī)藥的研究提供了平臺(tái)[9],其系統(tǒng)性和整體性特征符合中醫(yī)整體觀念,從系統(tǒng)和網(wǎng)絡(luò)的角度認(rèn)識(shí)了疾病與生物學(xué)的關(guān)系。本研究借助網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué),以桑白皮-夏枯草藥對(duì)為例,闡釋中醫(yī)藥治療原發(fā)性高血壓的作用機(jī)制,為進(jìn)一步研究奠定基礎(chǔ)。

1 資料與方法

1.1 桑白皮夏枯草潛在有效化合物的獲取與靶標(biāo)的篩選 在中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫與分析平臺(tái)(TCMSP,http://tcmspw.com/tcmsp.php)中搜索桑白皮、夏枯草,在項(xiàng)目欄中,選擇類藥性(DL)≥0.18且口服生物利用度(OB)≥30%的成分,其余成分不需要經(jīng)過過濾。導(dǎo)出篩選后的成分及其對(duì)應(yīng)的所有靶標(biāo)。將靶標(biāo)數(shù)據(jù)導(dǎo)入全球蛋白質(zhì)資源數(shù)據(jù)庫(UniProt,http://www.uniprot.org),翻譯成對(duì)應(yīng)的人類基因簡(jiǎn)稱,移除非人源的靶標(biāo),便于后續(xù)的分析和處理。

1.2 HBP疾病相關(guān)靶標(biāo)預(yù)測(cè)訪問基因卡片數(shù)據(jù)庫(GeneCards,http://www.genecards.org),以“essential hypertension”為關(guān)鍵詞檢索,得到HBP相關(guān)靶標(biāo)。

1.3 桑白皮-夏枯草與高血壓病靶標(biāo)PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建將桑白皮和夏枯草的靶標(biāo)合并去除重復(fù)項(xiàng),與疾病的靶標(biāo)取交集,在生物分子功能注釋系統(tǒng)(STRING 11.5,http://string-db.org)中,限定Multiple proteins模式,勾選物種Homo sapiens,構(gòu)建藥物與疾病的蛋白相互作用(PPI)網(wǎng)絡(luò)模型,將其輸入Cytoscape 3.9.1,利用該軟件中的Centiscape插件進(jìn)行濾過,選擇介數(shù)(Betweenness)、密切度(Closeness)、連接度(Degree)作為分析條目,從而確定藥對(duì)治療HBP的核心靶標(biāo)。

1.4 核心靶標(biāo)的GO功能和KEGG通路富分析將上一步得到的核心靶標(biāo)錄入David功能注釋網(wǎng)站(http://david.ncifcrf.gov),通過對(duì)“Homo sapiens”物種的生命功能和通路進(jìn)行富集研究,利用微生信(http://www.bioinformatics.com.cn)的在線繪圖技術(shù),將富集結(jié)果可視化。

1.5 成分-靶標(biāo)-通路網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建將藥物成分、核心靶標(biāo)和前20條通路整合到Excel文件中,并將其上傳至Cytoscape 3.9.1軟件,利用軟件中的Analyze Network功能,對(duì)網(wǎng)絡(luò)拓?fù)渲忻總€(gè)節(jié)點(diǎn)的參數(shù)加以解析,以確定藥物的主要藥效成分、核心靶標(biāo)和關(guān)鍵路徑,最終構(gòu)建出成分-靶標(biāo)-通路的網(wǎng)絡(luò)圖。

2 結(jié)果

2.1 桑白皮-夏枯草潛在有效活性成分及靶標(biāo)的獲取在TCMSP中,桑白皮和夏枯草的化學(xué)成分分別為194種和60種,經(jīng)過篩選,桑白皮有效成分31種,夏枯草有效成分11種,2種藥物有3個(gè)共同成分,經(jīng)過重復(fù)值刪除后,最終確定了39種有效活性成分,包括槲皮素(Quercetin)、山萘酚(kaempferol)、β-谷甾醇(beta-sitosterol)、木犀草素(luteolin)、豆甾醇(Stigmasterol)等。桑白皮有6個(gè)成分無對(duì)應(yīng)靶標(biāo),剩余25個(gè)成分對(duì)應(yīng)195個(gè)作用靶標(biāo);夏枯草11個(gè)成分對(duì)應(yīng)211個(gè)作用靶標(biāo),最終并集靶標(biāo)218個(gè)。

2.2 HBP疾病相關(guān)靶標(biāo)的預(yù)測(cè)在GeneCards中,發(fā)現(xiàn)了7964個(gè)與HBP相關(guān)的靶標(biāo)。

2.3 PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及核心作用靶標(biāo)篩選將疾病與藥物靶標(biāo)進(jìn)行映射,得到了194個(gè)共同靶標(biāo)。使用STRING構(gòu)建共同靶標(biāo)的蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圖,共獲得194個(gè)節(jié)點(diǎn),3716條邊,平均節(jié)點(diǎn)度值為38.3。通過使用Cytoscape及Centiscape插件濾過得到41個(gè)核心作用靶標(biāo)。其中,前5位靶標(biāo)是絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶1(AKT1)、細(xì)胞腫瘤抗原P53(TP53)、腫瘤壞死因子(TNF)、白細(xì)胞介素-6(IL-6)、人原癌基因c-Jun(JUN)。

2.4 GO功能與KEGG富集分析應(yīng)用David數(shù)據(jù)平臺(tái),對(duì)核心靶標(biāo)進(jìn)行分析,獲得其所參與的功能及通路。于微生信平臺(tái)繪制BP、CC、MF、KEGG氣泡圖。見圖1。

圖1 BP CC MF KEGG氣泡圖

GO分析顯示桑白皮-夏枯草治療高血壓病涉及454個(gè)生物過程,KEGG通路富集分析顯示143條通路,癌癥通路(Pathways in cancer)與高血壓病密切相關(guān),其次是糖尿病并發(fā)癥中的AGE-RAGE信號(hào)通路(AGE-RAGE signaling pathway in diabetic complications)、流體剪切應(yīng)力與動(dòng)脈粥樣硬化(Fluid shear stress and atherosclerosis)、膀胱癌(Bladder cancer)、脂質(zhì)和動(dòng)脈粥樣硬化(Lipid and atherosclerosis)等。

2.5 藥物成分-靶標(biāo)-通路網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建從Cytoscape構(gòu)建“中藥成分-靶標(biāo)-通路”網(wǎng)絡(luò)圖,并從中分析選取到9個(gè)關(guān)鍵藥物成分,41個(gè)核心作用靶標(biāo),9條重要富集通路。

3 討論

高血壓病是西醫(yī)學(xué)病名,癥狀主要為頭暈、頭痛、心悸、頸項(xiàng)板緊、疲勞等[10],與中醫(yī)學(xué)的“眩暈、頭痛”類似[11]?！饵S帝內(nèi)經(jīng)》曾提到:“諸風(fēng)掉眩,皆屬于肝”,指眩暈屬風(fēng),為肝之變。夏枯草歸肝經(jīng),可清泄肝經(jīng)郁火,治療肝火上炎或肝陽上亢的頭痛眩暈、目赤腫痛等;桑白皮清肝降壓,治療水腫脹滿尿少、肝陽肝火偏旺之高血壓病[7]。二藥合用,平肝陽,瀉肝火,消水腫,緩解眩暈[7]。

該過程涉及多種藥物成分,有研究證實(shí)槲皮素有顯著降壓效果,可作用于心血管系統(tǒng),機(jī)制為抑制收縮反應(yīng)、改善血管內(nèi)皮依賴性松弛[12]。此外,槲皮素可以下調(diào)TLR4/NF-kB信號(hào)通路,保護(hù)實(shí)驗(yàn)大鼠血管內(nèi)皮功能,降低自發(fā)高血壓病大鼠的血壓值[13,14]。山萘酚有著與槲皮素相似的生化構(gòu)成,在預(yù)防心血管疾病、降血糖、抗炎、抗氧化、緩解骨質(zhì)疏松等方面有較高的藥用價(jià)值,臨床上已廣泛用于治療心腦血管疾病和胃癌[15]。山萘酚還可下調(diào)MAPK通路,逆轉(zhuǎn)內(nèi)皮損傷及其炎癥反應(yīng)[16],增強(qiáng)內(nèi)皮依賴性血管舒張功能,其通過舒張血管,起到降壓作用[17]。研究證明,β-谷甾醇有類似于氫化可的松和強(qiáng)的松等較強(qiáng)抗炎作用,豆甾醇也有一定消炎功能,且均無可的松類藥物的不良作用,因此能夠當(dāng)作輔助抗炎癥藥物持續(xù)使用,而且還具備近似于阿司匹林類的退熱鎮(zhèn)痛效果[18]。β-谷甾醇還具備多種藥理活性,包括抗炎、鎮(zhèn)痛、降低血脂和抗腫瘤等[19]。藥對(duì)中各化學(xué)成分間存在相互關(guān)系,在治療中共同發(fā)揮作用。

PPI網(wǎng)絡(luò)各靶標(biāo)間也呈現(xiàn)出密切而復(fù)雜的聯(lián)系。苗艷菊等[20]研究發(fā)現(xiàn)AKT1 mRNA蛋白的表達(dá)與活化參與高血壓病心肌纖維化的發(fā)展。TP53是一種抑癌基因,其與細(xì)胞的增殖和惡變有關(guān),并且可能與高血壓病左心室肥厚及動(dòng)脈硬化有關(guān)[21]。TNF會(huì)使體內(nèi)ET-1等縮血管物質(zhì)分泌增多、NO等血管舒張因子減少,進(jìn)而引發(fā)小動(dòng)脈痙攣,使血壓升高[22]。王海蓉等[23]指出TNF-α、IL-6水平升高后會(huì)增加高血壓病及心血管不良事件的發(fā)生。炎癥過程中IL-6的低甲基化也與高血壓病密切相關(guān)[24]。郭光明等[25]指出C-JUN蛋白在腫瘤細(xì)胞中發(fā)揮雙向作用,促進(jìn)細(xì)胞增殖和細(xì)胞凋亡雙向調(diào)節(jié)。PPI網(wǎng)絡(luò)錯(cuò)綜復(fù)雜,也充分說明該藥對(duì)治療HBP多途徑、多靶標(biāo)的復(fù)雜方式。

經(jīng)過GO和KEGG分析,癌癥通路涉及關(guān)鍵靶標(biāo)31個(gè),在高血壓病治療中起到關(guān)鍵作用。AGE與RAGE相互作用,促使血管平滑肌細(xì)胞增生,進(jìn)而誘導(dǎo)血管肥厚,產(chǎn)生肺動(dòng)脈高壓[26]。較高的血流剪切力可以維持血管內(nèi)皮的正常功能,減少內(nèi)皮損傷因子的分泌,保護(hù)血管內(nèi)膜,有效預(yù)防高血壓病的發(fā)生[27]。由此,中藥治療高血壓病也得到更加充分、多元的印證。

綜上所述,本研究從網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)角度初步揭示了桑白皮-夏枯草藥對(duì)治療HBP的理論,其通過多種成分、大量靶標(biāo)、數(shù)種功能與信號(hào)通路協(xié)同發(fā)揮作用,這些發(fā)現(xiàn)為臨床治療HBP提供依據(jù),并為進(jìn)一步研究奠定基礎(chǔ)。但本研究是基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的理論性探索,其機(jī)制仍有待進(jìn)一步試驗(yàn)的考察和驗(yàn)證。