張曉潤,宋 爽,朱麗瑩,王文靜,陶 臻

(南京醫(yī)科大學附屬南京醫(yī)院/南京市第一醫(yī)院感染性疾病科,江蘇 南京 210000)

金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus, SA)是一種在自然界廣泛存在的病原菌,在臨床上可以引起多種感染性疾病,如皮膚軟組織感染、血流感染和中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染等[1]。近年來,因全球范圍內(nèi)廣譜抗菌藥物的過度使用,SA的耐藥率呈現(xiàn)不斷上升趨勢,除了耐藥基因的表達外,還有一個重要的原因是生物膜的形成。生物膜是細菌在生長過程中黏附于生物或非生物表面后,被細菌自身分泌的胞外物質(zhì)包裹而形成的細菌聚集膜樣物,可以保護細菌免受宿主免疫系統(tǒng)、抗菌藥物及物理機械壓力的影響[2]。SA生物膜相關(guān)感染往往會造成治療失敗以及復發(fā)性感染,不僅導致疾病的發(fā)病率和病死率上升,還會給全球經(jīng)濟造成巨大的損失[3]。目前研究[4]表明,抗菌藥物在亞抑菌濃度(sub-MIC)下會對SA生物膜的形成產(chǎn)生影響,且不同抗菌藥物影響細菌生物膜形成的作用機制不同。因此,本綜述將對SA生物膜的形成過程及基因調(diào)控、不同抗菌藥物在sub-MIC下對SA生物膜形成的影響及作用機制進行概述,以期為臨床有效控制及治療SA生物膜相關(guān)感染提供一定依據(jù)。

1 sub-MIC的定義及意義

最低抑菌濃度(MIC)是抑制細菌生長的最低藥物濃度,敏感菌株在抗菌藥物濃度高于MIC時被抑制,而耐藥菌株則需要更高的抗菌藥物濃度才能被抑制,其上限被稱為防突變濃度(MPC),兩者之間的濃度集合被稱為突變選擇窗口(MSW)。MSW理論認為,耐藥突變菌株的選擇性富集只發(fā)生在MSW內(nèi),當抗菌藥物濃度低于MIC時,雖然治療無效但也不會導致耐藥菌的富集[5]。隨著研究人員對細菌耐藥機制的深入研究,進一步提出了sub-MIC和最小選擇濃度(MSC)的概念,補充了MSW理論。研究人員將野生型敏感菌和同源的耐藥菌按1∶1 的比例混合,當抗菌藥物濃度較低時,因耐藥菌存在適應(yīng)性代價,故敏感菌具有生長優(yōu)勢;當抗菌藥物濃度增加時,耐藥菌逐漸克服適應(yīng)性代價,兩者生長速度相同、適應(yīng)性相同的藥物濃度即為MSC,當抗菌藥物濃度高于MSC但仍低于MIC時就可以選擇性富集耐藥突變菌株[6-7]。見圖1。因此,sub-MIC是指低于MIC但仍對細菌具有選擇作用的抗菌藥物濃度,由于藥物在體內(nèi)濃度分布不同和藥物自身不良反應(yīng)的影響,以及臨床長期應(yīng)用抗菌藥物導致菌群MIC值升高,細菌不可避免會處于sub-MIC環(huán)境[8]。當菌群處于sub-MIC環(huán)境時,不僅可以富集預先存在的耐藥突變菌株,還可以通過增加適應(yīng)性進化頻率來產(chǎn)生更高水平的耐藥突變,最終導致藥物治療失敗[9]。

圖1 細菌在sub-MIC選擇窗口和傳統(tǒng)突變選擇窗口中的生長[9]

2 SA生物膜的形成過程及基因調(diào)控

生物膜是細菌附著于表面后被自身分泌的胞外基質(zhì)(ECM)包裹形成的結(jié)構(gòu)性群落,ECM主要由胞外多糖(EPS)、胞外DNA(eDNA)、蛋白質(zhì)、脂類和其他生物分子組成[10]。目前關(guān)于生物膜的研究主要以體外模型為主,盡管參與生物膜形成的分子成分因細菌種類不同而異,但廣泛認可的生物膜生長模型包括三個連續(xù)階段:黏附、聚集/成熟、分離/擴散[11]。隨著研究的深入,Moormeier等[12]借助微流控活細胞分析系統(tǒng)和延時顯微鏡實時觀察SA生物膜的發(fā)展過程,并提出了五階段生物膜生長模型,即黏附、聚集、外流、成熟、擴散。見圖2。接下來將對五個階段及相關(guān)基因調(diào)控進行概述。

圖2 SA生物膜生長模型

2.1 初始黏附 生物膜形成的第一步是浮游的SA黏附到生物或非生物表面。SA與生物表面之間主要通過一組N端含有信號肽序列、C端含有“LPXTG”模體(motif)的表面蛋白即細胞壁錨定蛋白進行黏附,其中一類與ECM成分結(jié)合的蛋白分子稱為識別黏附基質(zhì)分子的微生物表面成分(MSCRAMMs)[13]。MSCRAMMs主要包括凝集因子A(ClfA)和凝集因子B(ClfB)、纖維蛋白結(jié)合蛋白A(FnBPA)和纖維蛋白結(jié)合蛋白B(FnBPB)、絲氨酸-天冬氨酸重復序列蛋白(Sdr)、骨唾液酸結(jié)合蛋白(Bbp)、膠原黏附素(Cna)等[14]。這些蛋白由其對應(yīng)的基因編碼,可以促進細菌與生物表面進行特異性黏附。而SA與非生物表面之間則是通過靜電作用和疏水作用實現(xiàn)非特異性黏附[15]。除此之外,SA自身分泌的自溶素(atlA)亦有助于細菌在聚苯乙烯表面黏附[16]。

2.2 細胞聚集 完成初始黏附后的細菌在存在流體剪切力的情況下很容易脫離表面,因此,SA會產(chǎn)生多種因子幫助細胞聚集從而增加生物膜的穩(wěn)定性。首先,SA在黏附過程中產(chǎn)生的一些細胞外蛋白可以在最初附著后即發(fā)揮促進細胞聚集的作用,如FnBPA、FnBPB、ClfB和SdrC[17]。其次,多糖胞間黏附素(PIA)已被證明可以在SA生物膜形成的第二階段即細胞聚集中發(fā)揮重要作用[18]。PIA的合成主要受ica基因的調(diào)控,ica由四個功能基因(icaA、icaD、icaB、icaC)和一個調(diào)節(jié)基因(icaR)組成,其表達容易受環(huán)境條件(如高溫、高滲透壓、抗菌藥物等)的影響,因此,只有特定菌株或在特定條件下SA可以依賴PIA實現(xiàn)細胞聚集[19]。此外,研究[20]表明,SA可以通過烯醇化酶和甘油三醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)在低pH值環(huán)境下使細胞自我裂解釋放eDNA和細胞質(zhì)蛋白,從而促進細胞聚集。

2.3 早期外流 過去認為,SA與其他細菌一樣有著相似的生物膜形成過程[21],但研究人員通過延時顯微鏡對SA生物膜形成過程觀察后發(fā)現(xiàn),在聚集階段開始后約6 h,細胞出現(xiàn)了明顯的釋放,即早期外流階段[12]。此階段主要由SA自身分泌的核酸酶(nuc)介導,nuc是一種熱穩(wěn)定的核酸內(nèi)切酶,也是SA的一種重要毒力因子,可以降解生物膜的主要成分eDNA引起細胞早期外流[22]。SA nuc突變體缺少早期外流階段,同時也無法觀察到生物膜成熟所需的微菌落結(jié)構(gòu)的形成[12]。因此,SA獨特的早期外流階段便于生物膜進行結(jié)構(gòu)重建,進而形成更有利于生物膜發(fā)展的結(jié)構(gòu)形態(tài)。

2.4 生物膜成熟 無論何種細菌,其生物膜成熟的關(guān)鍵都在于微菌落結(jié)構(gòu)的形成[23],SA亦不例外。通過延時顯微鏡觀察SA生物膜形成發(fā)現(xiàn),在生物膜成熟過程中,不斷有細菌脫離黏附,殘留在基底層的細胞則生成小簇菌落結(jié)構(gòu),即微菌落[13]。這些微菌落不斷解離和生成,使得生物膜高度結(jié)構(gòu)化,以便于細菌進行營養(yǎng)交換與廢物排除[24]。在此過程中,SA主要通過一類具有表面活性劑性質(zhì)的α-螺旋多肽兩性分子,即酚溶性調(diào)節(jié)蛋白(PSMs)實現(xiàn)生物膜成熟。PSMs可以破壞生物膜的非共價作用,使得生物膜結(jié)構(gòu)得到修飾和重塑進而逐漸趨于成熟,而PSMs的表達則受Agr系統(tǒng)的嚴格調(diào)控[25]。

2.5 細胞擴散 生物膜積累成熟后,生物膜內(nèi)的細胞可以通過擴散重新恢復到浮游狀態(tài),因此細胞擴散既是生物膜生長和發(fā)展過程的最后階段,也是另一個生長周期的開始[26]。此階段主要受機械力、表面活性劑PSMs以及降解生物膜基質(zhì)分子酶(如蛋白酶等)的影響,因此細胞擴散很大程度上亦受Agr系統(tǒng)調(diào)控[27]。在Agr系統(tǒng)中,首先由啟動子P2、P3分別啟動RNA II和 RNA III的轉(zhuǎn)錄,然后再由RNA II編碼AgrA、AgrB、AgrC和AgrD蛋白,其中AgrD編碼自誘導肽前體(pre-AIP),在AgrB的作用下成熟為自誘導肽(AIP),當細胞外AIP濃度達閾值時,Agr系統(tǒng)被激活,AgrC結(jié)合AIP后使AgrA磷酸化,從而再反作用于P2、P3啟動子以及其他幾個轉(zhuǎn)錄靶點,調(diào)控相關(guān)細胞外蛋白酶的表達而促進生物膜擴散[28]。同時,AgrA還可以直接調(diào)控PSMs的表達,從而有助于生物膜的擴散[29]。

3 sub-MIC抗菌藥物影響SA生物膜形成的作用機制

sub-MIC抗菌藥物既可以促進生物膜形成,也可以抑制生物膜形成?，F(xiàn)已充分證實不同抗菌藥物在sub-MIC下影響SA生物膜形成[30-43],本文針對常見抗菌藥物對SA生物膜的影響進行概述。見表1。由于生物膜形成過程中涉及眾多基因及其復雜的調(diào)控機制,至今還無法將常用抗菌藥物與SA生物膜形成的作用靶點一一對應(yīng)。因此,以下部分總結(jié)了目前sub-MIC抗菌藥物影響SA生物膜形成的作用機制。見圖3。

圖3 sub-MIC抗菌藥物影響SA生物膜形成的作用機制

3.1 改變初始黏附 初始黏附是生物膜形成的早期關(guān)鍵步驟。SA可以通過細胞表面蛋白與表面相互作用,也可以通過靜電作用和疏水作用與表面黏附。已有多項研究觀察到SA在sub-MIC抗菌藥物作用下,其表面蛋白含量(包括黏附相關(guān)蛋白)會發(fā)生變化。通過對氨芐西林誘導和非氨芐西林誘導的生物膜進行轉(zhuǎn)錄組學分析發(fā)現(xiàn),SA在sub-MIC氨芐西林作用下,一些編碼表面蛋白基因以及黏附相關(guān)基因的表達會上調(diào),有助于細菌形成生物膜[30]。同時,研究[34,40]表明,sub-MIC鏈霉素或諾氟沙星可以通過改變SA表面電荷和疏水性增加細菌與表面的初始黏附,促進生物膜的形成。

3.2 釋放eDNA 細菌生物膜主要由EPS、eDNA、蛋白質(zhì)、脂類和其他生物分子組成[10]。在過去的生物膜研究中,EPS被認為是主要和最重要的組成部分,然而隨著研究的不斷深入,人們發(fā)現(xiàn)eDNA在生物膜形成中發(fā)揮著重要作用[44]。由于生理、生長速率或細胞周期的不同,大多數(shù)細菌在抗菌藥物敏感性上會表現(xiàn)出一定的異質(zhì)性,即一些細胞在抗菌藥物濃度低于MIC時就會死亡[45-46]。因此,sub-MIC抗菌藥物影響生物膜形成的另一種潛在機制可能是細胞死亡后eDNA的釋放。sub-MIC阿莫西林可以誘導SA eDNA的釋放而增加生物膜的形成[31]。eDNA除了可以直接釋放到細胞外空間促進生物膜形成外,還可以封閉在膜囊泡內(nèi)參與生物膜的形成[47],如sub-MIC萬古霉素刺激SA生物膜形成的潛在機制是膜囊泡分泌的增加[39]。

3.3 調(diào)控Agr系統(tǒng) 群體感應(yīng)系統(tǒng)(QS系統(tǒng))是細菌細胞間的一種通訊系統(tǒng),控制著許多基因的表達以響應(yīng)群體密度[48],而Agr系統(tǒng)是SA QS系統(tǒng)的重要部分[49]。Agr系統(tǒng)在生物膜形成過程中起著至關(guān)重要的調(diào)控作用,因此,sub-MIC抗菌藥物可以通過直接影響Agr系統(tǒng)而影響SA生物膜的形成,也可以通過影響Agr系統(tǒng)調(diào)節(jié)下游基因的表達而影響生物膜的形成。例如,sub-MIC環(huán)丙沙星促進SA生物膜形成的作用機制是sub-MIC環(huán)丙沙星結(jié)合了AgrC受體,從而影響下游agrA、icaA及icaR基因的表達[41]。sub-MIC莫匹羅星則通過上調(diào)cidA的表達刺激SA生物膜的形成,故cidA的表達受到群體感應(yīng)Agr系統(tǒng)的正向調(diào)節(jié)[50]。最近研究[51]表明,SA在sub-MIC左氧氟沙星和萬古霉素作用下可能引起Agr系統(tǒng)發(fā)生自發(fā)基因突變,刺激群體欺騙效應(yīng),導致生物膜形成的增加。

3.4 改變nuc活性 nuc是SA分泌的一種胞外核酸內(nèi)切酶,主要由nuc1基因編碼,其不僅可以降解eDNA引起細胞早期外流從而促進生物膜的形成[22],還可以切斷中性粒細胞胞外陷阱(NET)的主干DNA從而實現(xiàn)免疫逃逸,避免NET對生物膜產(chǎn)生殺傷作用[52]。因此,sub-MIC抗菌藥物可以通過影響nuc活性從而影響SA生物膜的形成,如多西環(huán)素在sub-MIC下可抑制nuc活性,從而抑制SA生物膜的形成[53]。

3.5 觸發(fā)應(yīng)激反應(yīng) 為了在不同的環(huán)境條件下生長,SA可以利用高效的信號轉(zhuǎn)導系統(tǒng)調(diào)整細胞生理機能,從而響應(yīng)環(huán)境刺激,這種信號轉(zhuǎn)導系統(tǒng)的一個關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子是σB(SigB),其主要參與細菌的應(yīng)激反應(yīng)[54]。因此,sub-MIC抗菌藥物可以通過影響σB而影響應(yīng)激反應(yīng)的發(fā)生,從而調(diào)節(jié)SA生物膜的形成。如sub-MIC克林霉素可以替代σB,從而觸發(fā)細菌的應(yīng)激反應(yīng),并上調(diào)生物膜相關(guān)基因如atlA、agrA、psm、fnbA和fnbB的表達,使得SA生物膜的形成增加[42]。

4 小結(jié)

sub-MIC抗菌藥物會影響SA的生物膜結(jié)構(gòu)和基因表達,也會對細菌的毒力表達和耐藥性產(chǎn)生不同程度的影響。目前關(guān)于sub-MIC抗菌藥物作用下生物膜的相關(guān)研究大部分為體外研究,且樣本量較小,因而難免造成抽樣誤差的增加,使得研究結(jié)果的可靠性下降。因此,不同抗菌藥物在sub-MIC狀態(tài)下對SA生物膜的影響還存在爭議。同時,正如本綜述中所提到的,sub-MIC抗菌藥物影響SA生物膜是一個涉及多基因的復雜過程,雖然與之相關(guān)的研究很多,但大多數(shù)未闡明具體的作用機制。因此,對于sub-MIC抗菌藥物對SA生物膜形成的影響及相關(guān)機制還需要更多的研究進一步證明。

利益沖突:所有作者均聲明不存在利益沖突。