李 娟 蔡 萃 聶 晶 吳宇婧 張東陽(yáng)

阿爾茨海默?。ˋlzheimer's disease，AD）是一種起病隱匿的進(jìn)行性發(fā)展的中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，臨床表現(xiàn)為認(rèn)知、記憶、語(yǔ)言、活動(dòng)能力等障礙，可改變患者人格及行為等[1]。研究[2]發(fā)現(xiàn)，AD 的發(fā)病具有明顯的家庭聚集性，其中β-淀粉樣前體蛋白（β-amyloid precursor protein，APP）基因多個(gè)位點(diǎn)的突變與AD 的發(fā)病密切相關(guān)。APP 是在多種細(xì)胞和組織中表達(dá)的內(nèi)在膜蛋白，在β 淀粉樣前體蛋白裂解酶1（beta-site amyloid precursor protein cleaving enzyme 1，BACE1）等蛋白酶的作用下水解成為β 淀粉樣蛋白（β-amyloid，Aβ），并在神經(jīng)細(xì)胞中沉積產(chǎn)生神經(jīng)毒性，導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞功能損傷，引起AD 的發(fā)生[3]。Toll 樣受體（Toll-like receptor，TLRs）同源分子是典型的跨膜模式識(shí)別受體，可以響應(yīng)多種細(xì)胞內(nèi)外信號(hào)的刺激，調(diào)控細(xì)胞炎癥因子的表達(dá)和分泌，引發(fā)炎癥反應(yīng)及促進(jìn)抗原提呈細(xì)胞的成熟，誘導(dǎo)機(jī)體的獲得性免疫反應(yīng)[4]。其中，Toll 樣受體7（Toll-like receptor 7，TLR-7）可以識(shí)別微小RNA（microRNA，miRNA），并通過(guò)與miRNA 的結(jié)合參與多種細(xì)胞生理活動(dòng)的調(diào)節(jié)[5]。研究發(fā)現(xiàn)，TLR-7 可能在神經(jīng)炎癥反應(yīng)中發(fā)揮了重要作用[6]，但其在AD 中的功能仍不清楚。本研究顯示，在AD 模型人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞（SH-SY5Y）中，沉默TLR-7 通過(guò)靶向微小RNA-15b（miR-15b）介導(dǎo)核因子κB（NF-κB）信號(hào)傳導(dǎo)及與BACE1 的表達(dá)，抑制神經(jīng)細(xì)胞Aβ 的異常積累和炎癥因子分泌，緩解了APP 突變引起的神經(jīng)細(xì)胞損傷。

1 材料與方法

1.1 試 劑 DMEM 高糖培養(yǎng)基（貨號(hào)11965095）、胎牛血清（貨號(hào)10091148）、胰酶消化液（貨號(hào)25200072）、Lipofectamine 2000 轉(zhuǎn)染試劑（貨號(hào)11668019）購(gòu)自美國(guó)賽默飛世爾科技公司；總RNA提取試劑盒（貨號(hào)DP451）、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（貨號(hào)KR116）、實(shí)時(shí)熒光定量PCR 試劑（貨號(hào)FP201）購(gòu)自北京天根生物科技公司；雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒（貨號(hào)E1910）購(gòu)自美國(guó)普洛麥格公司；Aβ、白介素-1β（IL-1β）、白介素-6（IL-6）和腫瘤壞死因子-α（TNF-α）酶聯(lián)免疫吸附試劑盒（貨號(hào)DAB142、MLB00C、D6050、DTA00D）購(gòu)自美國(guó)R&D 公司；兔抗APP 抗體、β-肌動(dòng)蛋白、山羊抗兔二抗（貨號(hào)ab32136、ab8653、ab6721）購(gòu)自美國(guó)Abcam 公司。

1.2 儀 器 CO2培養(yǎng)箱（3111-GP，Thermo 公司）；酶標(biāo)儀（800Ts，Bio-Rad 公司）；流式細(xì)胞儀（Novo-Cyte，Aceabio 公司）；熒光PCR 儀（QuantStudioTM5，Thermo 公司）。

1.3 AD 細(xì)胞模型的建立 人胚腎細(xì)胞系HEK293T（貨號(hào)ZQ0033，中喬新舟）和人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系SH-SY5Y（貨號(hào)YS3685C，上海雅吉生物）在含10%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)基中傳代培養(yǎng)。APP 瑞典家系突變（APP695 KM670/671NL，APPswe）慢病毒包裝質(zhì)粒pLenti-APPswe 由本研究室構(gòu)建，pLenti-APPswe 質(zhì)粒與慢病毒包裝輔助質(zhì)粒共同轉(zhuǎn)染HEK293T 細(xì)胞，轉(zhuǎn)染48 h 后，收集培養(yǎng)基上清液，用0.45 μm 一次性濾器過(guò)濾后，加入SH-SY5Y 細(xì)胞培養(yǎng)基中，孵育24 h 后，加入含1.5 μg/mL 嘌呤霉素的完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)48 h，最終得到APP 瑞典家系突變?nèi)松窠?jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系（SH-SY5Y/APPswe）。

1.4 細(xì)胞轉(zhuǎn)染和分組 以上述獲得的SH-SY5Y/APPswe 和SH-SY5Y 細(xì)胞為研究對(duì)象，按照1.3 中的轉(zhuǎn)染方法，將TLR-7 敲低質(zhì)粒（sh-TLR-7）、對(duì)照質(zhì)粒（sh-NC）、miR-15b 抑制質(zhì)粒（miR-15b inhibitor）和對(duì)照質(zhì)粒（inhibitor NC）分別轉(zhuǎn)染至SH-SY5Y/APPswe 細(xì)胞中。將細(xì)胞分為SH-SY5Y 組、SHSY5Y/APPswe 組、TLR-7 敲 低SH-SY5Y/APPswe（SH-SY5Y/APPswe+sh-TLR-7）組、敲低對(duì)照SHSY5Y/APPswe（SH-SY5Y/APPswe+sh-NC）組、TLR-7敲低+miR-15b 抑制SH-SY5Y/APPswe（SH-SY5Y/APPswe+sh-TLR-7+miR-15b inhibitor）組和TLR-7敲低+miR-15b 抑制對(duì)照SH-SY5Y/APPswe（SHSY5Y/APPswe+sh-TLR-7+inhibitor NC）組。各組轉(zhuǎn)染細(xì)胞系培養(yǎng)24 h 后收集細(xì)胞進(jìn)行檢測(cè)。

1.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 離心收集各組細(xì)胞，加入1 mL 預(yù)冷的Trizol 裂解液室溫放置5 min；加入200 μL 氯仿，充分混勻后經(jīng)12000 g 4 ℃離心10 min，取上層水相500 μL，加入等體積異丙醇，12000 g 4 ℃離心10 min，棄去上清；加入1 mL 75%乙醇漂洗2次，加入無(wú)RNA 酶的焦磷酸二乙酯（DEPC）水30 μL使沉淀充分溶解總RNA。取1 μg 總RNA，用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA，再行PCR 擴(kuò)增目標(biāo)基因。將所得cDNA 加至PCR 反應(yīng)體系中擴(kuò)增目標(biāo)片段，PCR 反應(yīng)體系為20 μL。PCR 反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性15 min 后，94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，40 個(gè)循環(huán)。最后一次循環(huán)后做溶解曲線，并采用β肌動(dòng)蛋白（β-actin）做標(biāo)準(zhǔn)曲線作為參考值，所需引物序列見(jiàn)表1。

表1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 引物序列

1.6 酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn) 用無(wú)菌管收集各組細(xì)胞培養(yǎng)基，1000 r/min 離心10 min，加入預(yù)先包被抗體的酶標(biāo)板中，并設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)品孔和樣本孔，標(biāo)準(zhǔn)品孔各加不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品50 μL，樣本孔中加入待測(cè)樣本50 μL。4 ℃孵育2 h，再加入辣根過(guò)氧化物酶（HRP）標(biāo)記的檢測(cè)抗體100 μL，4 ℃孵育2 h，隨后用漂洗液充分漂洗5 次。最后在每孔加入顯色底物50 μL，室溫避光孵育15 min 后，加入終止液50 μL，立即酶標(biāo)儀讀取450 nm 波長(zhǎng)處測(cè)定各孔的OD 值。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品孔實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)繪制Aβ、IL-1β、IL-6 和TNF-α 標(biāo)準(zhǔn)曲線，并計(jì)算各樣本孔待測(cè)樣品濃度。

1.7 蛋白質(zhì)印跡實(shí)驗(yàn) 離心收集SH-SY5Y 細(xì)胞和SY-SY5Y/APPswe 細(xì)胞，加入200 μL 4 ℃預(yù)冷的放射免疫沉淀法裂解緩沖（RIPA）細(xì)胞裂解液，冰上裂解20 min，離心后取其上清液；采取BCA 法測(cè)定蛋白濃度，并調(diào)整蛋白提取液的濃度，加入5×SDS 上樣緩沖液，煮沸加熱5 min。在100 V 恒壓條件下進(jìn)行SDS-PAGE 凝膠電泳90 min，結(jié)束后，繼續(xù)在100 V恒壓條件下轉(zhuǎn)膜2 h，后將帶有蛋白樣品的PVDF 膜于5%脫脂奶粉中封閉1 h，隨后分別用兔抗APP 抗體（1∶3000 稀釋）、β-肌動(dòng)蛋白（1∶4000 稀釋）和HRP山羊抗兔二抗（1∶8000 稀釋），室溫各孵育2 h。充分漂洗后，在膜上滴加化學(xué)發(fā)光底物，用凝膠成像儀獲取蛋白印跡圖片。

1.8 熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn) 用Lipofectamine 2000 轉(zhuǎn)染試劑轉(zhuǎn)染，將NF-κB 熒光素酶報(bào)告基因質(zhì)粒pNF-κB-Luc 和對(duì)照質(zhì)粒pRL-TK 轉(zhuǎn)染各組細(xì)胞24 h，棄掉上清，在細(xì)胞培養(yǎng)板中加入500 μL 細(xì)胞裂解液，室溫靜置5 min，隨后取20 μL 細(xì)胞裂解液加入白色不透光96 孔板，每組設(shè)置3 個(gè)復(fù)孔。先后在孔中加入螢火蟲(chóng)熒光素酶底物和海參熒光素底物，用酶標(biāo)儀讀取300～700 nm 波長(zhǎng)自發(fā)光信號(hào)。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 18.0 軟件進(jìn)行分析，符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間兩兩比較采用獨(dú)立樣本t 檢驗(yàn)，以P＜0.05 表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 SH-SY5Y 細(xì)胞AD 模型的建立 蛋白質(zhì)印跡實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與正常SH-SY5Y 細(xì)胞相比，慢病毒穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的SH-SY5Y/APPswe 細(xì)胞APP 695 亞型表達(dá)水平上調(diào)，表明穩(wěn)定細(xì)胞系構(gòu)建成功，見(jiàn)圖1。

圖1 蛋白質(zhì)印跡實(shí)驗(yàn)檢測(cè)APP 的表達(dá)

2.2 敲低TLR-7 對(duì)miR-15b 和BACE1 mRNA 表達(dá)及Aβ42 分泌的影響 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 實(shí)驗(yàn)檢測(cè)各組細(xì)胞中TLR-7、BACE1 mRNA 和miR-15b 的表達(dá)水平。酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)檢測(cè)Aβ 分泌水平。與SH-SY5Y 組細(xì)胞比較，AD 模型SH-SY5Y/APPswe組細(xì)胞TLR-7、BACE1 mRNA 和miR-15b 表達(dá)水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），而分泌到培養(yǎng)基中的Aβ42 水平則顯著升高（P＜0.01）。與SH-SY5Y/APPswe+sh-NC 組比較，SH-SY5Y/APPswe+sh-TLR-7 組細(xì)胞TLR-7、BACE1 mRNA 表達(dá)水平顯著下降（P＜0.01），miR-15b 表達(dá)水平顯著升高（P＜0.01），Aβ42分泌水平明顯降低（P＜0.01），見(jiàn)表2。

表2 敲低TLR-7 對(duì)BACE1 mRNA、miR-15b 表達(dá)和Aβ42 分泌的影響（±s）

表2 敲低TLR-7 對(duì)BACE1 mRNA、miR-15b 表達(dá)和Aβ42 分泌的影響（±s）

注：SH-SY5Y 為人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞；SH-SY5Y/APPswe 為APP 瑞典家系突變轉(zhuǎn)染SH-SY5Y；TLR-7 為Toll 樣受體7；BACE1 為β 淀粉樣前體蛋白裂解酶1；miR-15b 為微小RNA-15b；Aβ42 為β 淀粉樣蛋白42；與SH-SY5Y 組比較，aP＜0.01；與SH-SY5Y/APPswe+sh-NC 組比較，bP＜0.01

組別SH-SY5Y 組SH-SY5Y/APPswe 組SH-SY5Y/APPswe+sh-NC 組SH-SY5Y/APPswe+sh-TLR-7 組孔數(shù)3333 TLR-7 mRNA 1.00±0.00 0.97±0.03 0.98±0.07 0.15±0.02b BACE1 mRNA 1.00±0.00 0.94±0.06 1.02±0.03 0.72±0.06b miR-15b 1.00±0.00 1.08±0.06 1.10±0.05 2.98±0.21b Aβ42（ng/mL）2.09±0.17 11.24±0.76a 10.52±0.67 6.09±0.42b

2.3 TLR-7 通過(guò)miR-15b 調(diào)控BACE1 的表達(dá)及Aβ42 分泌 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 和酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)顯示，與SY-SY5Y/APPswe+sh-NC 組比較，SHSY5Y/APPswe+sh-TLR-7 組BACE1 mRNA 表達(dá)和Aβ42 分泌顯著降低（P＜0.01，P＜0.05），miR-15b 表達(dá)明顯升高（P＜0.01）；與SH-SY5Y/APPswe+sh-TLR-7+inhibitor NC 組比較，同時(shí)敲低TLR-7 和miR-15b的SH-SY5Y/APPswe+sh-TLR-7+miR-15b inhibitor組BACE1 mRNA 表達(dá)水平顯著升高（P＜0.05），Aβ42 分泌水平明顯升高（P＜0.01），miR-15b 表達(dá)水平下降（P＜0.01），見(jiàn)表3。

表3 敲低TLR-7 與抑制miR-15b 對(duì)BACE1 mRNA、miR-15b 表達(dá)和Aβ42 分泌的影響（±s）

表3 敲低TLR-7 與抑制miR-15b 對(duì)BACE1 mRNA、miR-15b 表達(dá)和Aβ42 分泌的影響（±s）

注：SH-SY5Y 為人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞；SH-SY5Y/APPswe 為APP 瑞典家系突變轉(zhuǎn)染SH-SY5Y；BACE1 為β 淀粉樣前體蛋白裂解酶1；miR-15b為微小RNA-15b；Aβ42 為β 淀粉樣蛋白42；與SH-SY5Y/APPswe+sh-NC 組比較，aP＜0.05，bP＜0.01；與SH-SY5Y/APPswe+shTLR-7+inhibitor NC 組比較，cP＜0.05，dP＜0.01

組別SH-SY5Y 組SH-SY5Y/APPswe 組SH-SY5Y/APPswe+sh-NC 組SH-SY5Y/APPswe+sh-TLR-7 組SH-SY5Y/APPswe+sh-TLR-7+inhibitor NC 組SH-SY5Y/APPswe+sh-TLR-7+miR-15b inhibitor 組孔數(shù)333333 BACE1 mRNA 1.00±0.00 1.02±0.04 1.10±0.06 0.69±0.07b 0.71±0.05 1.39±0.42c miR-15b 1.00±0.00 0.95±0.11 1.03±0.07 3.32±0.19b 2.96±0.35 0.67±0.13d Aβ42（ng/mL）2.32±0.68 13.65±1.98 14.77±2.74 6.99±1.85a 7.47±1.58 19.54±3.01d

2.4 TLR-7 通過(guò)miR-15b 調(diào)控炎癥因子IL-1β、IL-6 和TNF-α mRNA 的表達(dá)和分泌 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與SH-SY5Y 組細(xì)胞比較，AD 模型SH-SY5Y/APPswe 組細(xì)胞IL-1β、IL-6 和TNF-α mRNA 表達(dá)水平顯著升高（P＜0.01）。與SH-SY5Y/APPswe+sh-NC 組比較，SH-SY5Y/APPswe+sh-TLR-7 組細(xì)胞IL-1β、IL-6 和TNF-α mRNA 表達(dá)水平顯著下降（P＜0.01）。與SH-SY5Y/APPswe+sh-TLR-7+inhibitor NC 組細(xì)胞比較，SH-SY5Y/APPswe+sh-TLR-7+miR-15b inhibitor 組 細(xì) 胞IL-1β、IL-6 和TNF-α mRNA 表達(dá)水平顯著升高（P＜0.01），見(jiàn)表4。

表4 各組細(xì)胞IL-1β、IL-6 和TNF-α mRNA 表達(dá)比較（±s）

表4 各組細(xì)胞IL-1β、IL-6 和TNF-α mRNA 表達(dá)比較（±s）

注：SH-SY5Y 為人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞；SH-SY5Y/APPswe 為APP 瑞典家系突變轉(zhuǎn)染SH-SY5Y；IL-1β 為白介素-1β；IL-6 為白介素-6；TNF-α為腫瘤壞死因子-α；與SH-SY5Y 組比較，aP＜0.01；與SH-SY5Y/APPswe+sh-NC 組比較，bP＜0.01；與SH-SY5Y/APPswe+sh-TLR-7+inhibitor NC組比較，cP＜0.01

組別SH-SY5Y 組SH-SY5Y/APPswe 組SH-SY5Y/APPswe+sh-NC 組SH-SY5Y/APPswe+sh-TLR-7 組SH-SY5Y/APPswe+sh-TLR-7+inhibitor NC 組SH-SY5Y/APPswe+sh-TLR-7+miR-15b inhibitor 組孔數(shù)333333 IL-1β 1.00±0.00 4.95±0.28a 4.62±0.41 3.34±0.25b 3.55±0.33 6.07±0.43c IL-6 1.00±0.00 5.90±0.47a 5.43±0.31 3.75±0.34b 4.02±0.22 5.98±0.28c TNF-α 1.00±0.00 1.98±0.14a 2.07±0.18 1.25±0.11b 1.36±0.20 1.88±0.21c

酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與SH-SY5Y 組比較，AD 模型SH-SY5Y/APPswe 組IL-1β、IL-6 和TNF-α 分泌水平顯著升高（P＜0.01）。與SH-SY5Y/APPswe+sh-NC 組比較，SH-SY5Y/APPswe+sh-TLR-7 組IL-1β、IL-6 和TNF-α 分泌水平顯著下降（P＜0.01）。與SH-SY5Y/APPswe+sh-TLR-7+inhibitor NC組比較，SH-SY5Y/APPswe+sh-TLR-7+miR-15b inhibitor 組IL-1β、IL-6 和TNF-α 分泌水平顯著升高（P＜0.05），見(jiàn)表5。

表5 各組細(xì)胞IL-1β、IL-6 和TNF-α 分泌水平比較（pg/mL，±s）

注：SH-SY5Y 為人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞；SH-SY5Y/APPswe 為APP 瑞典家系突變轉(zhuǎn)染SH-SY5Y；IL-1β 為白介素-1β；IL-6 為白介素-6；TNF-α為腫瘤壞死因子-α；與SH-SY5Y 組比較，aP＜0.01；與SH-SY5Y/APPswe+sh-NC 組比較，bP＜0.01；與SH-SY5Y/APPswe+sh-TLR-7+inhibitor NC組比較，cP＜0.05

組別SH-SY5Y 組SH-SY5Y/APPswe 組SH-SY5Y/APPswe+sh-NC 組SH-SY5Y/APPswe+sh-TLR-7 組SH-SY5Y/APPswe+sh-TLR-7+inhibitor NC 組SH-SY5Y/APPswe+sh-TLR-7+miR-15b inhibitor 組孔數(shù)333333 IL-1β 57.20±4.95 112.43±10.89a 101.76±7.95 61.40±7.76b 68.62±5.41 155.32±13.67c IL-6 117.62±19.57 982.42±78.84a 893.35±101.43 547.29±39.11b 439.73±60.01 1255.49±119.79c TNF-α 137.89±21.37 356.17±29.08a 375.28±33.99 256.17±24.32b 227.82±26.53 423.66±34.32c

2.5 TLR-7 通過(guò)miR-15b 調(diào)控NF-κB 信號(hào)通路的激活 熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)結(jié)果顯示，與SHSY5Y 組比較，AD 模型SH-SY5Y/APPswe 組NF-κB熒光素酶活性顯著升高（P＜0.01）。與SH-SY5Y/APPswe+sh-NC 組比較，SH-SY5Y/APPswe+sh-TLR-7 組NF-κB 熒光素酶活性顯著下降（P＜0.01）。與SHSY5Y/APPswe+sh-TLR-7+inhibitor NC 組比較，SH-SY5Y/APPswe+sh-TLR-7+miR-15b inhibitor 組NFκB 熒光素酶活性顯著升高（P＜0.01），見(jiàn)表6。

表6 各組細(xì)胞NF-κB 相對(duì)熒光素酶活性（±s）

表6 各組細(xì)胞NF-κB 相對(duì)熒光素酶活性（±s）

注：SH-SY5Y 為人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞；SH-SY5Y/APPswe 為APP 瑞典家系突變轉(zhuǎn)染SH-SY5Y；NF-κB 為核因子κB；與SH-SY5Y 組比較，aP＜0.01；與SH-SY5Y/APPswe+sh-NC 組比較，bP＜0.01；與SH-SY5Y/APPswe+sh-TLR-7+inhibitor NC 組比較，cP＜0.01

組別SH-SY5Y 組SH-SY5Y/APPswe 組SH-SY5Y/APPswe+sh-NC 組SH-SY5Y/APPswe+sh-TLR-7 組SH-SY5Y/APPswe+sh-TLR-7+inhibitor NC 組SH-SY5Y/APPswe+sh-TLR-7+miR-15b inhibitor 組孔數(shù)333333相對(duì)熒光素酶活性1.00±0.00 5.27±0.44a 5.01±0.52 3.25±0.31b 3.58±0.27 5.91±0.66c

3 討 論

盡管AD 是一類多因素疾病，但Aβ 的異常積累被認(rèn)為是誘發(fā)AD 的最主要因素，APP 蛋白在以BACE1 為主的水解酶作用下分解產(chǎn)生Aβ，并伴隨自由基釋放，引發(fā)細(xì)胞氧化損傷，誘發(fā)慢性炎癥，進(jìn)而影響神經(jīng)細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)與功能[7]。研究[8]發(fā)現(xiàn)，BACE1 在AD 患者大腦中的表達(dá)和活性水平均呈現(xiàn)明顯的增強(qiáng)，因而B(niǎo)ACE1 一直被作為AD 治療和藥物開(kāi)發(fā)的重要靶點(diǎn)。此外，研究BACE1 在AD 疾病進(jìn)展中的調(diào)控機(jī)制，也是該領(lǐng)域的熱點(diǎn)問(wèn)題。神經(jīng)系統(tǒng)慢性炎癥反應(yīng)伴隨了AD 的整個(gè)發(fā)病過(guò)程，在正常的生理狀態(tài)下，神經(jīng)炎癥有助于神經(jīng)系統(tǒng)損傷的修復(fù)，而當(dāng)炎癥反應(yīng)過(guò)度時(shí)則會(huì)造成細(xì)胞損傷，加速AD 惡化，因此，炎癥反應(yīng)在AD 中極其重要，適度調(diào)控炎癥反應(yīng)將對(duì)AD 的治療大有裨益[9]。TLR-7 受體及其下游信號(hào)通路在炎癥反應(yīng)的調(diào)控中發(fā)揮了重要作用。Mottas 等[10]研究發(fā)現(xiàn)，TLR-7 可以誘導(dǎo)Aβ 攝取及炎癥反應(yīng)，從而在AD 發(fā)病過(guò)程中發(fā)揮作用，而Ren 等[11]研究發(fā)現(xiàn)，TLR-7 的激活可以下調(diào)B 淋巴細(xì)胞miR-15b 的表達(dá)。本研究發(fā)現(xiàn)，在過(guò)表達(dá)APPswe 的AD 模型SH-SY5Y 細(xì)胞中，敲低TLR-7 可導(dǎo)致miR-15b表達(dá)水平的上調(diào)和BCAE1 表達(dá)水平下調(diào)，并抑制了Aβ42 的分泌（P＜0.01）。為了進(jìn)一步研究TLR-7 是否通過(guò)miR-15b 調(diào)控BACE1 的表達(dá)，本研究通過(guò)miR-15b inhibitor 在TLR-7 敲低的細(xì)胞中進(jìn)一步抑制miR-15b 的表達(dá)，結(jié)果證實(shí)了抑制miR-15b 可以恢復(fù)SH-SY5Y/APPswe 細(xì)胞BCAE1 mRNA 的表達(dá)和Aβ42 的分泌（P＜0.05，P＜0.01）。

有研究[12]發(fā)現(xiàn)，NF-κB 的激活在包括AD 在內(nèi)的神經(jīng)炎癥性疾病中扮演著重要的角色，在AD 發(fā)病過(guò)程中，Aβ 誘導(dǎo)的NF-κB 激活上調(diào)了促炎細(xì)胞如IL-1β、IL-6 等的表達(dá)，也有研究[13]表明，NF-κB 活化可刺激BACE1 和APP 的表達(dá)。本研究也發(fā)現(xiàn)，在SH-SY5Y/APPswe 細(xì)胞中，TLR-7 可以通過(guò)miR-15b 調(diào)控NF-κB 的轉(zhuǎn)錄活性及IL-1β、TNF-α 和IL-6 等炎癥因子的分泌，這提示TLR-7/miR-15b 對(duì)BACE1 和Aβ 分泌的影響可能是通過(guò)對(duì)NF-κB 信號(hào)調(diào)節(jié)實(shí)現(xiàn)的。

綜上所述，本研究揭示了TLR-7/miR-15b 對(duì)AD 模型SH-SY5Y/APPswe 細(xì)胞的Aβ 分泌和炎癥因子表達(dá)的重要調(diào)控作用和分子機(jī)制，提示TLR-7/miR-15b 在抑制Aβ 積累和神經(jīng)炎癥反應(yīng)中潛在的靶點(diǎn)作用，為AD 的致病機(jī)制和干預(yù)策略的研究提供了新思路。