沈冠男 宛傳奇 楊 揚 吳肖葦 何煜舟

接種疫苗是預防和控制傳染病傳播的最有效策略，但單一抗原成分的疫苗引出的免疫反應無法給機體提供有效的免疫保護，因此需要在疫苗中添加佐劑以提升人體免疫效果[1]。佐劑是增強和調節(jié)疫苗抗原免疫反應的免疫刺激物，與抗原共同注射機體后，可延長機體對抗原的免疫時間，增強單核吞噬細胞系統(tǒng)的吞噬呈遞作用以及刺激淋巴細胞的增殖分化，以提高疫苗的有效性[2]。鋁佐劑是最早被發(fā)現的佐劑，自1932 年首次應用于人體以來，在傳染病的預防中發(fā)揮了重大作用，研究表明氫氧化鋁一般只誘導Th2 型免疫反應，近年來也有研究稱鋁佐劑可誘導Th1 型免疫反應但是受接種途徑的影響[3]。之后發(fā)現的油乳劑雖然可以同時誘導Th1 和Th2 型免疫反應但同時存在發(fā)燒、頭痛、惡心、炎癥等不良反應[4]。近年來中藥多糖的免疫學活性被發(fā)掘，其中黃芪多糖（astragalus polysaccharides，APS）是備受關注的一種多糖，諸多學者證實APS 可被用作疫苗佐劑。本文基于這些研究對于APS 作為一種疫苗佐劑的免疫活性研究進展作以下綜述。

1 中藥多糖佐劑分子機制

從中藥植物提取的多糖，具有生物相容性、可降解性和安全的免疫調節(jié)作用[5]。研究表明，從黃芪、枸杞、板藍根、茯苓和肉蓯蓉中提取的多糖成分可以作為佐劑應用在疫苗中刺激免疫應答[6]。中藥植物多糖疫苗佐劑分子機制主要包括以下幾個方面[7]：（1）激活巨噬細胞吞噬與呈遞功能；（2）促進樹突狀細胞的成熟與分化；（3）促進淋巴細胞的增殖和活化；（4）降低Tregs 細胞對效應T 細胞增殖的抑制作用。但由于中藥來源廣泛，提取工藝不同，不同來源的多糖結構存在較大差異，這種差異對多糖的免疫活性產生的影響未知[8]。

2 APS 的構成

黃芪首載于《神農本草經》，被列為上品，具有“補氣圣藥”的美稱，來源為豆科植物蒙古黃芪Astragalus membranaceus（Fisch.）Bge.var.mongholicus（Bge.）Hsiao 或 膜 莢 黃 芪Astragalus membranaceus（Fisch.）Bge.的干燥根。黃芪中提取的主要化學成分——APS 是近年來研究的熱點，具有調節(jié)免疫、抗腫瘤、降血糖、抗衰老和抗炎等藥理作用[9-10]。APS 的有效成分主要由多種單糖和葡聚糖（glucan，Glu）構成。根據已有研究，APS 含有的單糖組分包括葡萄糖、葡萄糖醛酸、鼠李糖、阿拉伯糖、果糖、半乳糖、半乳糖醛酸、甘露糖、巖藻糖及來蘇糖。Glu 是基于吡喃葡萄糖基的多糖，根據其單糖殘基結構，可以是α-D-Glu、β-D-Glu 或α，β-D-Glu[11]。APS 的分子量分布較廣，大致可分為4 段，＞1000 kDa、100～1000 kDa、10～100 kDa 和＜10 kDa[12]。受不同提取方式的影響，APS 的性質與生物學活性也有很大差別。以往研究表明糖苷鍵和單糖的鏈接方式對多糖生物活性的影響大于單糖的組成，分支度過大或過小都無法使多糖生物活性達到理想狀態(tài)。Jiang 等[13]先采用沸水浸提APS，之后分別采用不同濃度的乙醇分級醇沉（20%、40%、60%、80%）得到4 種APS，對這4 種APS的分子量采用高效凝膠滲透色譜法聯合示差折光檢測器測定，得到結果分別為257.7、40.1、15.3 和3.2 kDa。其中，APS1 只含有葡萄糖，APS2 只含有阿拉伯糖，APS3 含有鼠李糖、葡萄糖、半乳糖和阿拉伯糖，摩爾比為1∶10.76∶6.55∶12，APS4 含有半乳糖和阿拉伯糖，摩爾比為3.02∶1。將這四種多糖進行生物活性研究，發(fā)現只有APS2 和APS3 具有免疫學活性，可刺激淋巴細胞增殖，這說明不同的化學結構對APS 生物活性存在影響。李宏全等[14]使用微波輔助提取技術提取得到APS，進一步分離純化后利用柱前衍生化HPLC 法測試APS 的單糖組成。結果顯示APS 由鼠李糖、葡萄糖、半乳糖和阿拉伯糖構成，其物質的量比為1.19∶72.01∶5.85∶20.95，相對分子質量為1.1×104，葡萄糖以α-型糖苷鍵連接成其主鏈，并含有少量β-糖苷鍵。該團隊前期研究發(fā)現APS 作為疫苗佐劑可提高雞新城疫和傳染性腔上囊病疫苗免疫力和免疫器官增重[15]，但并未證實不同糖苷鍵對APS 的免疫學活性存在影響。

3 APS 的免疫調節(jié)作用

3.1 對巨噬細胞的影響 當巨噬細胞受到抗原刺激后極化成M1 型巨噬細胞和M2 型巨噬細胞，前者能夠分泌相應的促炎性細胞因子，在炎癥發(fā)生的早期具有重要意義，后者在炎癥消退、組織改造、功能修復等方面起到重要作用；識別并消滅病原體、清除衰亡細胞、維持機體內環(huán)境穩(wěn)態(tài)是巨噬細胞吞噬功能的主要表現形式[16]。巨噬細胞處理外源性抗原和內源性抗原后，具有免疫原性的小分子肽段與主要組織相容性復合體（major histocompatiblity complex，MHC）結合形成肽-MHC 復合物并表達于細胞表面，T 細胞識別這些肽-MHC 復合物后被激活。羅晶晶等[17]發(fā)現巨噬細胞的活化和吞噬功能以及巨噬細胞表面細胞活化標志分子的水平受APS 影響。在加入了不同濃度的APS（0.1、1、10、50 和100 μg/mL，對照組為0 μg/mL）培養(yǎng)基中，使用100 μg/mL 的APS 處理過的巨噬細胞表面CD80、CD86、MHC-Ⅱ分子的表達水平、細胞吞噬率及單個細胞吞噬能力最高。在免疫抑制狀態(tài)下，APS 依舊可以刺激巨噬細胞活化，且與劑量呈正相關。史晶晶等[18]建立了環(huán)磷酰胺所致免疫抑制模型小鼠，給予不同劑量的APS（0.02、50、100、200 mg/kg），小鼠腹腔巨噬細胞的吞噬百分率和吞噬指數隨APS 劑量增加而增加，在給予200 mg/kg APS 時作用最強。Bamodu 等[19]發(fā)現，用APS 與人單核細胞衍生巨噬細胞（human monocyte-derived macrophage，MDM）共培養(yǎng)的非小細胞肺癌細胞培養(yǎng)基中，暴露于16 mg/mL APS 的培養(yǎng)基培養(yǎng)48 h 后極化成M1 型巨噬細胞的MDM 從處理前的1.59%上升到78.1%，相反的是M2 極化呈下調趨勢。該團隊稱此實驗首次證明了APS 對巨噬細胞M1 極化有優(yōu)先調節(jié)作用。Zhu 等[20]發(fā)現APS（10～80 μg/mL）通過增加MHC-Ⅱ、CD40、CD80 和CD86 的 表 達 促 進RAW264.7 巨噬細胞的成熟。

3.2 對樹突狀細胞（DC）的影響 DC 是機體免疫反應的始動者，是機體最強的抗原提呈細胞。DC 根據存在狀態(tài)分可分為成熟狀態(tài)和未成熟狀態(tài)，未成熟DC 具有免疫監(jiān)視、檢測潛在抗原等重要作用，成熟DC 具有啟動和調節(jié)免疫應答作用，當受到抗原刺激后，它們捕捉并加工抗原，以MHC-多肽復合物的形式呈現于細胞表面，通過MHC-多肽復合物激活T 細胞與B 細胞[21-22]。An 等[23]研究發(fā)現，APS 可以刺激人外周血DC 活化，增加DC 表面MHC-Ⅱ、CD86和CD9 等各種免疫相關抑制因子的表達，從而增強DC 與T 細胞之間的相互作用。另一項研究[24]發(fā)現，APS 處理的漿細胞DC（pDC）在緩解期比未經處理的慢性粒細胞白血病（CML）組分泌更多的干擾素-α（IFN-α）、白細胞介素-6（IL-6）和腫瘤壞死因子-α（TNF-α），這表明APS 可以促進pDC 在CML 中的功能,并促進pDC 向DC 轉化。Hwang 等[25]研究了鼻內給予APS 對注射了B16 黑色素瘤細胞（0.5×106/100 μL）的小鼠黏膜免疫細胞活化的影響，發(fā)現APS 的鼻內治療刺激了小鼠腸系膜淋巴結（mesenteric lymph nodes，mLN）中DC 增長，其作用機制為上調CC-趨化因子受體7 的表達來發(fā)揮作用。此外，鼻內治療APS 激活了DC，這進一步刺激了mLN中的自然殺傷細胞和T 細胞。這些發(fā)現表明，APS可作為局部黏膜佐劑，增強免疫檢查點抑制劑的抗癌作用。

3.3 對T/B 淋巴細胞的影響 T 淋巴細胞和B 淋巴細胞是人體最為重要的免疫細胞，兩者相互協(xié)作，具有免疫識別功能。T 淋巴細胞誘導細胞免疫，分化成熟后識別并直接殺死靶細胞。Th1 細胞和Th2 細胞是輔助性T 細胞的兩種亞型，是機體重要的免疫調節(jié)細胞，Th1 細胞特征在于分泌干擾素-γ（IFN-γ）和腫瘤壞死因子-α（TNF-α），Th2 細胞特征在于分泌白細胞介素-4（IL-4）、白細胞介素-5（IL-5）、白細胞介素-10（IL-10）和白細胞介素-13（IL-13）。CD3+T 細胞代表總T 細胞水平，根據細胞表面標志物不同，T淋巴細胞又分為CD4+T 和CD8+T 淋巴細胞兩個主要亞群，CD4+T 淋巴細胞可提高免疫功能，而CD8+T 淋巴細胞則相反[26]。劉艷玲等[27]使用APS 高、中、低劑量（400、200、100 mg/kg）給予肺癌模型小鼠，發(fā)現小鼠脾組織白細胞介素-2（IL-2）和IFN-γ 含量顯著升高，IL-4 和IL-10 含量顯著降低，且呈劑量依賴性。此外APS 可顯著提高肺癌小鼠免疫功能，主要表現在APS 劑量依賴性提高小鼠胸腺指數、脾指數，CD3+T 細胞、CD4+T 細胞、CD8+T 細胞水平和CD4+/CD8+比值。Jin 等[28]研究發(fā)現，APS 硫酸化淫羊藿多糖（APSsulfated epimedium polysaccharide，APS-sEPS）對新生仔豬外周血淋巴細胞和腸黏膜具有免疫作用，可增強外周血和空腸黏膜中IFN-γ、IL-4、IL-10、分泌型免疫球蛋白（Immunoglobulin，Ig）的濃度，并刺激仔豬T 淋巴細胞增殖。

B 淋巴細胞誘導體液免疫，基本功能是產生抗體、呈遞抗原和分泌細胞因子。參與體液免疫應答過程的Ig 主要有3 種, 即IgA、IgG 和IgM，因此檢測Ig 濃度是監(jiān)測體液免疫功能強弱的重要指標之一。舒迎霜等[29]發(fā)現APS 可提高比格犬血清IgA、IgG、IgM 和IFN-γ 水平，能增強體液免疫應答。研究[30-32]發(fā)現APS 可以提高環(huán)磷酰胺誘導的免疫抑制小鼠的免疫力，促進T 淋巴細胞和B 淋巴細胞的增殖，刺激IgA、IgG、IgM、IL-6、IFN-γ、補體C3、補體C4、TNF-α 產生，刺激淋巴細胞轉化及提高免疫器官指標。

3.4 對調節(jié)性T 細胞（Terg）的影響 Treg 細胞是一類控制體內自身免疫反應性的T 細胞亞群，能夠抑制其他細胞的免疫應答。Du 等[33]研究表明，APS 通過抑制Treg 細胞活性來增強小鼠乙型肝炎病毒（HBV）疫苗的免疫反應，高效刺激細胞毒性淋巴細胞的活性。Li 等[34]研究表明，APS 可通過上調IFNγ，下調IL-4 和IL-10 的表達，抑制FOXp3 mRNA的表達，降低Treg 細胞在腫瘤微環(huán)境下的免疫抑制作用。

4 APS 作為疫苗佐劑的免疫調節(jié)作用

APS 作為疫苗佐劑在動物模型中起到明顯的免疫增強效果，研究涉及新城疫病毒、乙型肝炎病毒、手足口病、流感等多種疫苗。Xue 等[35]在新城疫病毒疫苗動物模型研究中發(fā)現，新城疫疫苗聯合APS 可促進淋巴細胞增殖，顯著提高血清抗NDV 抗體滴度和IFN-γ、IL-2、IL-4 和IL-6 濃度，提高外周血中CD4+和CD8+T 細胞濃度?？傮w結果表明，雞用新城疫活疫苗聯合APS 可以刺激新孵雛雞體液和細胞反應增強。Du 等[33]研究了APS 作為乙型肝炎病毒疫苗佐劑對小鼠免疫系統(tǒng)的影響，發(fā)現APS 可增強乙型肝炎病毒疫苗對小鼠體液免疫和細胞免疫應答，通過增加MHC-Ⅰ/Ⅱ和共刺激分子（CD40、CD80 和CD86）的表達，從而促進樹突狀細胞成熟。Li 等[36]研究發(fā)現手足口病疫苗聯合APS 能上調INF-γ 和IL-6 基因表達，并上調特異性抗體滴度，這表明APS 可用作手足口病疫苗的免疫調節(jié)劑提供更好的抗手足口病病毒保護。有研究[37]發(fā)現，APS作為甲型流感（H3N2）疫苗佐劑可通過誘導Th1/Th2 平衡和IL-17 和IgG1 抗體的產生增強瑞士白化病小鼠的免疫應答。Abdullahi 等[38]聯合使用APS和H5N1 流感疫苗，實驗結果表明APS 組雛雞血清中IL-2、IL-10、TNF-α 和IFN-β 的表達增強，說明APS 能刺激細胞因子產生和巨噬細胞活化，聯合使用APS 可能對雞致命的H5N1 流感病毒感染有更好的保護作用。

5 小 結

APS 提取自天然植物黃芪，具有毒性低、安全性好的優(yōu)點，然而受到不同提取手段影響，APS 分子結構、分子量、單糖組成及糖鏈連接上均有差異。近年來大量研究發(fā)現APS 對免疫系統(tǒng)具有強大的調節(jié)作用，是一種很有開發(fā)潛力的新型疫苗佐劑。但目前APS 作為疫苗佐劑大多應用于動物疫苗，用于人類疫苗的研究存在空白，今后開發(fā)人用APS 疫苗佐劑仍需作進一步深入探討。此外APS 作為多組分物質，提純和結構研究限制了其作為臨床疫苗佐劑的發(fā)展[39]。因此今后研究的重點與難點在于闡明APS 的高級結構并分析寡糖片段及相對應的生物活性，進一步探討糖結構作用的有效靶點及其機制。