陳 璐，周省委，徐可可，張高陽(yáng)，劉汶澤，曹小鳳，楊林林，董誠(chéng)明

（1.河南中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院，河南 鄭州 450046；2.河南省道地藥材生態(tài)種植工程技術(shù)研究中心，河南 鄭州 450046）

冬凌草為唇形科植物碎米椏[Rabdosia rubescens（Hemsl.）Hara]的干燥地上部分。氣微香，味苦、甘，微寒，歸肺、胃、肝經(jīng)，其主要活性成分有萜類(lèi)、甾體、黃酮、揮發(fā)油、有機(jī)酸等成分，具有抗腫瘤、抗菌消炎、抗氧化、免疫增強(qiáng)等作用[1]。中藥藥渣是中藥制藥過(guò)程中產(chǎn)生的主要廢棄物，每年產(chǎn)量高達(dá)數(shù)千萬(wàn)噸，其中殘留多種有效成分并且仍具有蛋白質(zhì)、淀粉、多糖等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)[2]。前期調(diào)研發(fā)現(xiàn)，冬凌草藥材生產(chǎn)過(guò)程中主要提取了冬凌草甲素、冬凌草乙素等活性成分，產(chǎn)生大量以葉為主的藥渣，而藥渣中還含有未完全提取的齊墩果酸、熊果酸等有效成分及營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，但尚未有相關(guān)藥渣的綜合利用研究，這不僅造成了中藥資源的浪費(fèi)，還對(duì)環(huán)境造成了危害，制約了中藥綠色產(chǎn)業(yè)經(jīng)濟(jì)的健康發(fā)展。齊墩果酸又名土當(dāng)歸酸，屬五環(huán)三萜類(lèi)化合物，具有抗炎、抗腫瘤、抗糖尿病、抗動(dòng)脈粥樣硬化、保肝、抗骨質(zhì)疏松等作用[3]；熊果酸又名烏索酸，屬三萜類(lèi)化合物，具有鎮(zhèn)靜、抗炎、抗病毒、抗腫瘤、抗氧化和保肝等多種藥理活性[4]。楊夕鳴等[5]通過(guò)研究齊墩果酸和熊果酸的關(guān)鍵分子機(jī)制，發(fā)現(xiàn)其對(duì)腫瘤既有直接抑制作用，也能以調(diào)控機(jī)體免疫力間接表現(xiàn)抗腫瘤效果。夏禹等[6]研究發(fā)現(xiàn)，溫莪術(shù)藥渣再提取后仍含有多種姜黃素類(lèi)化合物、莪術(shù)二酮等活性成分，進(jìn)行分離純化后可得到安全有效的抗氧化劑。付亮等[7]水提淫羊藿藥渣，發(fā)現(xiàn)藥渣中含有大量黃酮類(lèi)物質(zhì)和少量的多糖，仍具有一定的藥效和抗氧化活性。雷茜等[8]研究發(fā)現(xiàn)，苦豆子藥渣中富含粗蛋白、粗纖維及磷等微量元素，營(yíng)養(yǎng)價(jià)值較高，可二次利用生產(chǎn)蛋白質(zhì)飼料。酵母菌、乳酸菌、芽孢桿菌等是常用的益生菌[9-11]，諸多研究表明，飼料中添加酵母菌、乳酸菌可以讓動(dòng)物消化吸收得到改善，機(jī)體免疫力明顯提高[12-16]。因此，酵母菌、乳酸菌經(jīng)常作為天然的飼料添加劑應(yīng)用于中藥藥渣再利用生產(chǎn)中[17]。嗜酸乳桿菌是人類(lèi)和動(dòng)物腸道中的一種重要的乳酸菌，具有維持腸道菌群平衡、提高動(dòng)物生產(chǎn)性能和機(jī)體免疫功能等作用，且其耐酸性強(qiáng)，能夠利用葡萄糖、果糖、乳糖和蔗糖等進(jìn)行發(fā)酵并產(chǎn)生乳酸等有機(jī)酸[18]。固體發(fā)酵具有生產(chǎn)成本相對(duì)較低、代謝物得到充分保留、儲(chǔ)存和運(yùn)輸方便等優(yōu)點(diǎn)，更適應(yīng)于生產(chǎn)的要求[19]。向宇[20]采用益生菌組合固體發(fā)酵甘草藥渣，發(fā)現(xiàn)甘草黃酮析出量增多，纖維素酶和酸性蛋白酶活力增加。陳華[21]研究發(fā)現(xiàn)，混合菌固體發(fā)酵黃芪藥渣產(chǎn)生的纖維素酶可有效降解藥渣纖維素，促進(jìn)藥渣中黃芪甲苷的析出。戴德慧等[22]的研究結(jié)果表明，酵母菌和乳酸菌發(fā)酵丹參藥渣，可溶性多糖和真蛋白含量增加。因此，探討中藥藥渣合理利用途徑是節(jié)約生態(tài)資源、推動(dòng)畜牧業(yè)減抗增效的可行措施之一。

以冬凌草藥渣為主要原料，利用IBM SPSS Statistics 26.0 對(duì)測(cè)定指標(biāo)進(jìn)行相關(guān)性和主成分分析，綜合評(píng)價(jià)確定適合冬凌草藥渣固體發(fā)酵的條件，旨在通過(guò)酵母菌和乳酸菌固體發(fā)酵，降低其中的纖維素含量，促進(jìn)殘留活性成分析出，增加粗蛋白、粗脂肪、鈣、粗灰分、賴(lài)氨酸含量，提高冬凌草藥渣利用率，解決廢棄冬凌草藥渣大量浪費(fèi)的問(wèn)題，為提升中藥生態(tài)產(chǎn)業(yè)，生產(chǎn)綠色、安全的冬凌草藥渣微生態(tài)添加劑提供參考。

1 材料和方法

1.1 材料與試劑

冬凌草藥渣：河南濟(jì)世藥業(yè)有限公司；酵母菌：釀酒酵母，安琪酵母股份有限公司；嗜酸乳桿菌：北京北納創(chuàng)聯(lián)生物技術(shù)研究院；齊墩果酸標(biāo)準(zhǔn)品、熊果酸標(biāo)準(zhǔn)品均購(gòu)于上海源葉生物科技有限公司，其他常用化學(xué)試劑均為市售分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

RTOP-430D智能人工氣候培養(yǎng)箱：浙江托普儀器有限公司；HY-8 調(diào)速振蕩器：國(guó)華電器有限公司；LDZM-80KCS 型立式壓力蒸汽滅菌器：上海申安醫(yī)療器械廠(chǎng)；Agilent 1260 型高效液相色譜儀：美國(guó)安捷倫公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品前處理 將冬凌草藥渣打成粉末，過(guò)篩，粒度為0.425 mm，保存于干燥器中。

1.3.2 試驗(yàn)方法 酵母菌接種液制備：將轉(zhuǎn)接復(fù)活的酵母菌接種在YPD平板培養(yǎng)基上，28 ℃溫度條件下培養(yǎng)2 d，挑取單一菌落制備1×108cfu/mL菌懸液，將菌懸液按1%接種量接種在YPD 液體培養(yǎng)基中，28 ℃、160 r/min 培養(yǎng)24 h，得酵母菌接種液。乳酸菌接種液制備：將轉(zhuǎn)接復(fù)活的酵母菌接種在MRS平板培養(yǎng)基上，37 ℃溫度條件下培養(yǎng)3 d，挑取單一菌落制備1×108cfu/mL 菌懸液，將菌懸液按1%接種量接種在MRS 液體培養(yǎng)基中，37 ℃、100 r/min 培養(yǎng)48 h，得乳酸菌接種液。

取上述接種液1 mL，離心后棄去上清液，將沉淀稀釋至1 mL，振蕩混勻后使用酶標(biāo)儀測(cè)其OD600值，根據(jù)測(cè)得OD600值將酵母菌接種液稀釋或濃縮至OD600=0.6，乳酸菌接種液稀釋或濃縮至OD600=0.5，用于之后接種。

固體發(fā)酵方法：稱(chēng)取1.3.1 中冬凌草藥渣粉末100 g 置于600 mL 蘭花瓶中，加去離子水調(diào)整料液比為1∶1.2，滅菌，冷卻后接種9%酵母菌或乳酸菌接種液，攪拌均勻，置于28 ℃恒溫恒濕條件下靜置培養(yǎng)6 d，隔24 h翻料一次，每組設(shè)置3個(gè)重復(fù)。

1.3.3 冬凌草藥渣固體發(fā)酵培養(yǎng)條件優(yōu)化

1.3.3.1 接種量對(duì)固體發(fā)酵的影響 將1.3.2 中的接種液以3%、6%、9%、12%、15%的接種量接種于料液比為1∶1.2 的固體發(fā)酵培養(yǎng)基中，在28 ℃溫度條件下培養(yǎng)6 d。

1.3.3.2 料液比對(duì)固體發(fā)酵的影響 將1.3.2 中的接種液以9%的接種量接種在固體發(fā)酵培養(yǎng)基中，分別選擇1∶0.8、1∶1.0、1∶1.2、1∶1.4、1∶1.6 的料液比，在28 ℃溫度條件下培養(yǎng)6 d。

1.3.3.3 時(shí)間對(duì)固體發(fā)酵的影響 將1.3.2 中的接種液以9%的接種量接種于料液比為1∶1.2 的固體發(fā)酵培養(yǎng)基中，在28 ℃溫度條件下分別培養(yǎng)1、3、6、9、12 d。

1.3.3.4 溫度對(duì)固體發(fā)酵的影響 將1.3.2 中的接種液以9%的接種量接種于料液比為1:1.2的固體發(fā)酵培養(yǎng)基中，酵母菌分別在25、28、31、34、37 ℃的溫度條件下發(fā)酵6 d，乳酸菌分別在23、28、33、38、42 ℃的溫度條件下發(fā)酵6 d。

1.3.4 測(cè)定方法 粗蛋白含量測(cè)定方法：采用凱氏法，參照《飼料中粗蛋白的測(cè)定凱氏定氮法》（GB/T 6432—2018）；粗纖維含量測(cè)定方法：采用過(guò)濾法，參照《飼料中粗纖維的含量測(cè)定方法》（GB/T 6434—2006）；粗脂肪含量測(cè)定方法：參照《飼料中粗脂肪的測(cè)定》（GB/T 6433—2006）；鈣含量的測(cè)定方法：采用乙二胺四乙酸二鈉絡(luò)合滴定法，參照《飼料中鈣的測(cè)定》（GB/T 6436—2018）；粗灰分含量的測(cè)定方法：參照《飼料中粗灰分的測(cè)定》（GB/T 6438—2007）；賴(lài)氨酸含量的測(cè)定方法：采用常規(guī)酸水解法，參照《飼料中氨基酸的測(cè)定》（GB/T 18246—2019）。冬凌草藥渣齊墩果酸、熊果酸含量的測(cè)定參考崔田[23]的方法略有改動(dòng)，色譜柱:安捷倫ZORBAX SB-Cl8 色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；柱溫:30 ℃；流動(dòng)相:甲醇-0.2% 醋酸溶液（88∶12）；流速:1.0 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng):210 nm；進(jìn)樣量10 μL；采用外標(biāo)法進(jìn)行定量。

1.4 數(shù)據(jù)與處理

用Excel 2022 整理數(shù)據(jù)，利用IBM SPSS Statistics 26.0 軟件進(jìn)行Pearson 相關(guān)性分析和主成分分析，利用GraphPad Prism 9 軟件處理數(shù)據(jù)并作圖，利用ChiPlot 工具在https://www.chiplot.online 作組間相關(guān)性分析熱圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 接種量對(duì)固體發(fā)酵的影響

2.1.1 酵母菌接種量對(duì)固體發(fā)酵的影響 從圖1可以看出，加入不同接種量酵母菌接種液后，粗蛋白含量整體呈緩慢上升趨勢(shì)，15%接種量時(shí)粗蛋白含量最高，比原藥渣增加0.62%；粗纖維含量變化呈W形，12%接種量時(shí)粗纖維含量最低，比原藥渣減少21.70%；粗脂肪含量先下降后升高再呈下降趨勢(shì)，3% 接種量時(shí)粗脂肪含量最高，比原藥渣減少30.77%；鈣含量先升高后下降再升高，15%接種量時(shí)鈣含量最高，比原藥渣增加5.56%；粗灰分含量先下降后呈緩慢上升趨勢(shì)，3%接種量時(shí)粗灰分含量最高，比原藥渣增加10.53%；賴(lài)氨酸含量整體呈緩慢上升趨勢(shì)，15%接種量時(shí)賴(lài)氨酸含量最高。從表1 可以看出，酵母菌6%接種量時(shí)，熊果酸含量最高，為0.38 mg/g，比原藥渣增加2.70%，此時(shí)齊墩果酸含量為0.20 mg/g；酵母菌15%接種量時(shí)，齊墩果酸含量最高為0.21 mg/g，比原藥渣增加5.00%，此時(shí)熊果酸含量為0.36 mg/g。

表1 酵母菌接種量對(duì)冬凌草藥渣中齊墩果酸及熊果酸含量的影響Tab.1 Effect of inoculation amount of yeast on the content of oleanolic acid and ursolic acid in residue of Rabdosia rubescens（Hemsl.）Hara

圖1 不同接種量對(duì)冬凌草藥渣各產(chǎn)物的影響Fig.1 Effect of different inoculation amount on the products in residue of Rabdosia rubescens（Hemsl.）Hara

2.1.2 乳酸菌接種量對(duì)固體發(fā)酵的影響 從圖1可以看出，加入不同接種量乳酸菌接種液后，粗蛋白含量先下降后緩慢升高，3%接種量時(shí)粗蛋白含量最高，比原藥渣增加14.14%；粗纖維含量先下降后升高，6%接種量時(shí)粗纖維含量最低，比原藥渣減少17.22%；粗脂肪含量先下降后升高，12%接種量時(shí)粗脂肪含量最高，比原藥渣減少15.38%；鈣含量變化呈M 形降低，6%接種量時(shí)鈣含量最高，比原藥渣增加44.44%；粗灰分含量先下降后趨于穩(wěn)定，9%接種量時(shí)粗灰分含量最高，比原藥渣增加25.00%；賴(lài)氨酸含量先下降后升高再下降，3%接種量時(shí)賴(lài)氨酸含量最高，比原藥渣增加6.06%。從表2 可以看出，乳酸菌接種量的改變對(duì)齊墩果酸和熊果酸含量的提升沒(méi)有太大效果。

表2 乳酸菌接種量對(duì)冬凌草藥渣中齊墩果酸及熊果酸含量的影響Tab.2 Effect of inoculation amount of lactic acid bacteria on the content of oleanolic acid and ursolic acid in residue of Rabdosia rubescens（Hemsl.）Hara

2.2 料液比對(duì)固體發(fā)酵的影響

2.2.1 酵母菌料液比對(duì)固體發(fā)酵的影響 從圖2可以看出，酵母菌料液比變化對(duì)冬凌草藥渣固體發(fā)酵檢測(cè)產(chǎn)物鈣含量、粗灰分含量、賴(lài)氨酸含量的影響不大。酵母菌發(fā)酵，料液比變化時(shí)，粗蛋白含量緩慢降低，料液比1∶0.8 時(shí)粗蛋白含量最高，比原藥渣增加23.32%；粗纖維含量先下降后緩慢升高，料液比1∶1 時(shí)粗纖維含量最低，比原藥渣減少26.65%；粗脂肪含量隨著發(fā)酵中含水量的增加緩慢降低，料液比1∶0.8 時(shí)粗脂肪含量最高，比原藥渣減少15.38%。從表3 可以看出，酵母菌發(fā)酵，料液比1∶1.0 時(shí)間時(shí)熊果酸含量最高，為0.45 mg/g，比原藥渣增加21.62%，此時(shí)齊墩果酸含量為0.22 mg/g；料液比1∶1.2 時(shí)齊墩果酸含量最高，比原藥渣增加20.00%，此時(shí)熊果酸含量為0.42 mg/g。

表3 酵母菌料液比對(duì)冬凌草藥渣中齊墩果酸及熊果酸含量的影響Tab.3 Effect of yeast material-liquid ratio on the content of oleanolic acid and ursolic acid in residue of Rabdosia rubescens（Hemsl.）Hara

圖2 不同料液比對(duì)冬凌草藥渣各產(chǎn)物的影響Fig.2 Effect of different ratio of material to liquid on the products in residue of Rabdosia rubescens（Hemsl.）Hara

2.2.2 乳酸菌料液比對(duì)固體發(fā)酵的影響 從圖2可以看出，乳酸菌發(fā)酵料液比變化時(shí)，粗蛋白含量整體呈下降趨勢(shì)，料液比1∶0.8 時(shí)粗蛋白含量最高，比原藥渣增加36.22%；粗纖維含量先下降后緩慢升高，料液比1∶1.0 時(shí)粗纖維含量最低，比原藥渣減少26.65%；粗脂肪含量先升高后下降，料液比1∶1.4 時(shí)粗脂肪含量最高，比原藥渣增加46.15%。從表4 可以看出，乳酸菌發(fā)酵，料液比1∶0.8 時(shí)齊墩果酸和熊果酸含量最高，比原藥渣增加10.00%、18.92%。

表4 乳酸菌料液比對(duì)冬凌草藥渣中齊墩果酸及熊果酸含量的影響Tab.4 Effect of material-liquid ratio of lactic acid bacteria on the content of oleanolic acid and ursolic acid in residue of Rabdosia rubescens（Hemsl.）Hara

2.3 發(fā)酵時(shí)間對(duì)固體發(fā)酵的影響

2.3.1 酵母菌發(fā)酵時(shí)間對(duì)固體發(fā)酵的影響 從圖3

圖3 不同固體發(fā)酵時(shí)間對(duì)冬凌草藥渣各產(chǎn)物的影響Fig.3 Effect of different solid fermentation time on the products in residue of Rabdosia rubescens（Hemsl.）Hara

可以看出，酵母菌發(fā)酵后，粗蛋白含量先下降后呈上升趨勢(shì)，在發(fā)酵1 d 時(shí)含量最高，比原藥渣增加9.39%；粗纖維含量變化呈N 形，在發(fā)酵9 d 時(shí)含量最低，比原藥渣減少12.26%；粗脂肪含量先升高并在發(fā)酵3 d 后趨于穩(wěn)定，在發(fā)酵3 d 時(shí)含量最高，比原藥渣增加23.07%；鈣含量先下降后升高，在發(fā)酵9 d 時(shí)含量最高，比原藥渣增加31.48%；粗灰分含量先升高后下降，在發(fā)酵3 d 時(shí)含量最高，比原藥渣增加19.74%；賴(lài)氨酸含量隨著發(fā)酵時(shí)間逐步升高，在發(fā)酵9 d 時(shí)含量最高，比原藥渣增加6.06%。從表5可以看出，酵母菌發(fā)酵3 d，齊墩果酸及熊果酸含量最高，比原藥渣增加15.00%、16.22%。

表5 酵母菌固體發(fā)酵時(shí)間對(duì)冬凌草藥渣中齊墩果酸及熊果酸含量的影響Tab.5 Effect of solid fermentation time of yeast on the content of oleanolic acid and ursolic acid in residue of Rabdosia rubescens（Hemsl.）Hara

2.3.2 乳酸菌發(fā)酵時(shí)間對(duì)固體發(fā)酵的影響 從圖3可以看出，乳酸菌發(fā)酵后，粗蛋白含量先下降后升高，在發(fā)酵9 d時(shí)含量最高，比原藥渣增加9.39%；粗纖維含量先下降后緩慢升高，在發(fā)酵3 d 時(shí)含量最低，比原藥渣減少7.78%；粗脂肪含量隨著發(fā)酵時(shí)間緩慢升高，在發(fā)酵9 d 時(shí)含量最高，比原藥渣增加38.46%；鈣含量先下降后升高，在發(fā)酵12 d 時(shí)含量最高，比原藥渣增加37.04%；粗灰分含量先降低后呈上升趨勢(shì)，在發(fā)酵12 d 時(shí)含量最高，比原藥渣增加15.79%；賴(lài)氨酸含量先下降后緩慢上升，在發(fā)酵12 d時(shí)含量最高，比原藥渣增加3.03%。從表6可以看出，乳酸菌發(fā)酵1 d，齊墩果酸及熊果酸含量最高，比原藥渣增加15.00%、18.92%。

表6 乳酸菌固體發(fā)酵時(shí)間對(duì)冬凌草藥渣中齊墩果酸及熊果酸含量的影響Tab.6 Effect of solid fermentation time of lactic acid bacteria on the content of oleanolic acid and ursolic acid in residue of Rabdosia rubescens（Hemsl.）Hara

2.4 溫度對(duì)固體發(fā)酵的影響

2.4.1 酵母菌發(fā)酵溫度對(duì)固體發(fā)酵的影響 從圖4可以看出，酵母菌發(fā)酵溫度變化時(shí)，粗蛋白含量整體呈上升趨勢(shì)，發(fā)酵溫度37 ℃粗蛋白含量最高，比原藥渣增加9.60%；粗纖維含量先下降后上升再下降，發(fā)酵溫度27 ℃粗纖維含量最低，比原藥渣減少13.68%；粗脂肪含量先下降后升高，發(fā)酵溫度37 ℃粗脂肪含量最高為1.30%；鈣含量先下降后升高，發(fā)酵溫度37 ℃鈣含量最高，比原藥渣增加29.63%；粗灰分含量整體呈上升趨勢(shì)，發(fā)酵溫度37 ℃粗灰分含量最高，比原藥渣增加17.11%；賴(lài)氨酸含量整體呈上升趨勢(shì)，發(fā)酵溫度37 ℃賴(lài)氨酸含量最高，比原藥渣增加12.12%。從表7 可以看出，酵母菌發(fā)酵溫度25 ℃時(shí)，齊墩果酸和熊果酸含量最高，比原藥渣增加10.00%、8.10%。

表7 酵母菌固體發(fā)酵溫度對(duì)冬凌草藥渣中齊墩果酸及熊果酸含量的影響Tab.7 Effect of solid fermentation temperature of yeast on the content of oleanolic acid and ursolic acid in residue of Rabdosia rubescens（Hemsl.）Hara

圖4 不同固體發(fā)酵溫度對(duì)冬凌草藥渣中各產(chǎn)物的影響Fig.4 Effects of different solid fermentation temperatures on the products in residue of Rabdosia rubescens（Hemsl.）Hara

2.4.2 乳酸菌發(fā)酵溫度對(duì)固體發(fā)酵的影響 從圖4可以看出，乳酸菌發(fā)酵溫度變化時(shí)，粗蛋白含量、粗纖維含量、鈣含量、粗灰分含量變化不大，粗脂肪含量先升高后降低，發(fā)酵溫度28 ℃粗脂肪含量最高，比原藥渣增加46.15%；賴(lài)氨酸含量先下降后趨于穩(wěn)定，發(fā)酵溫度23 ℃賴(lài)氨酸含量最高，比原藥渣增加21.21%。從表8 可以看出，乳酸菌發(fā)酵溫度變化對(duì)齊墩果酸和熊果酸含量增加沒(méi)有顯著效果。

表8 乳酸菌固體發(fā)酵溫度對(duì)冬凌草藥渣中齊墩果酸及熊果酸含量的影響Tab.8 Effect of solid fermentation temperature of lactic acid bacteria on the content of oleanolic acid and ursolic acid in residue of Rabdosia rubescens（Hemsl.）Hara

2.5 酵母菌和乳酸菌固體發(fā)酵冬凌草藥渣產(chǎn)物相關(guān)性分析

2.5.1 酵母菌固體發(fā)酵冬凌草藥渣產(chǎn)物相關(guān)性分析 采用IBM SPSS Statistics 26.0 對(duì)酵母菌發(fā)酵冬凌草藥渣不同檢測(cè)產(chǎn)物進(jìn)行組內(nèi)Pearson 相關(guān)性分析，結(jié)果如圖5所示，齊墩果酸與粗脂肪相關(guān)性達(dá)到0.45 呈顯著正相關(guān)，與熊果酸相關(guān)性達(dá)到0.86 極顯著正相關(guān)；粗蛋白與鈣、粗灰分、賴(lài)氨酸相關(guān)性分別達(dá)到0.95、0.97、0.90 呈極顯著正相關(guān)，與粗纖維相關(guān)性達(dá)到-0.87 呈極顯著負(fù)相關(guān)；粗纖維與鈣、粗灰分、賴(lài)氨酸相關(guān)性分別達(dá)到-0.90、-0.91、-0.76 呈極顯著負(fù)相關(guān)；鈣與粗灰分、賴(lài)氨酸相關(guān)性分別達(dá)到0.96、0.84 呈極顯著正相關(guān)；粗灰分與賴(lài)氨酸相關(guān)性達(dá)到0.87呈極顯著正相關(guān)。

圖5 酵母菌發(fā)酵冬凌草藥渣各產(chǎn)物的相關(guān)性Fig.5 Correlation of yeast fermentation products in residue of Rabdosia rubescens（Hemsl.）Hara

2.5.2 乳酸菌固體發(fā)酵冬凌草藥渣產(chǎn)物相關(guān)性分析 采用IBM SPSS Statistics 26.0 對(duì)乳酸菌發(fā)酵冬凌草藥渣不同檢測(cè)產(chǎn)物進(jìn)行組內(nèi)Pearson 相關(guān)性分析，結(jié)果如圖6所示，齊墩果酸與熊果酸相關(guān)性達(dá)到0.89，呈極顯著正相關(guān)；熊果酸與粗蛋白相關(guān)性達(dá)到0.53，呈顯著正相關(guān)；粗蛋白與鈣相關(guān)性達(dá)到0.46，呈顯著正相關(guān)，與賴(lài)氨酸相關(guān)性達(dá)到0.77，呈極顯著正相關(guān)；粗脂肪與鈣、粗灰分相關(guān)性分別達(dá)到0.56、0.57，呈極顯著正相關(guān)；鈣與粗灰分相關(guān)性達(dá)到0.46，呈顯著正相關(guān)，與賴(lài)氨酸相關(guān)性達(dá)到0.68，呈極顯著正相關(guān)。

圖6 乳酸菌發(fā)酵冬凌草藥渣各產(chǎn)物的相關(guān)性Fig.6 Correlation of lactic acid bacteria fermentation products in residue of Rabdosia rubescens（Hemsl.）Hara

2.6 酵母菌和乳酸菌固體發(fā)酵冬凌草藥渣產(chǎn)物主成分分析

2.6.1 酵母菌固體發(fā)酵冬凌草藥渣產(chǎn)物主成分分析 由表9 可知，8 個(gè)理化指標(biāo)因子可形成3 個(gè)主成分，3 個(gè)主成分的累計(jì)方差貢獻(xiàn)率為82.624%，涵蓋了大于總體信息的80%，符合分析要求，可依次進(jìn)行主成分分析，綜合評(píng)價(jià)冬凌草藥渣產(chǎn)物。將各指標(biāo)變量的主成分載荷除以主成分相對(duì)應(yīng)的特征值平方根得到標(biāo)準(zhǔn)化變量的系數(shù)向量，依此列出主成分解析表達(dá)式：

表9 酵母菌固體發(fā)酵冬凌草藥渣產(chǎn)物的載荷矩陣Tab.9 Load matrix of products of residue of Rabdosia rubescens（Hemsl.）Hara by solid fermentation of yeast

F3=0.616X1+0.489X2-0.214X3+0.190X4+0.142X5-0.185X6-0.182X7-0.460X8。

根據(jù)各指標(biāo)成分在每個(gè)主成分中的提取貢獻(xiàn)度進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理，計(jì)算每個(gè)主成分的得分。根據(jù)主成分F1、F2、F3在累計(jì)值中的占比，計(jì)算各處理的總得分F，排序比較。

從表10 可以看出，酵母菌固體發(fā)酵各處理中，處理12 得分最高。處理12（接種量6%、料液比1∶1.2、發(fā)酵時(shí)間3 d、發(fā)酵溫度28 ℃）粗蛋白含量相較于發(fā)酵前提高0.93%，粗纖維含量相較于發(fā)酵前減少1.19%，粗脂肪含量相較于發(fā)酵前提高23.08%，鈣含量相較于發(fā)酵前提高13.89%，齊墩果酸含量相較于發(fā)酵前提高15.00%，熊果酸含量較發(fā)酵前提高16.22%。

表10 酵母菌固體發(fā)酵冬凌草藥渣各處理的評(píng)價(jià)分值Tab.10 Evaluation score of each treatment of residue of Rabdosia rubescens（Hemsl.）Hara by solid fermentation of yeast

2.6.2 乳酸菌固體發(fā)酵冬凌草藥渣產(chǎn)物主成分分析 由表11 可知，8 個(gè)理化指標(biāo)因子可形成2 個(gè)主成分，2 個(gè)主成分的累計(jì)方差貢獻(xiàn)率為84.582%，涵蓋了大于總體信息的80%，符合分析要求，可依次進(jìn)行主成分分析，綜合評(píng)價(jià)冬凌草藥渣產(chǎn)物。將各指標(biāo)變量的主成分載荷除以主成分相對(duì)應(yīng)的特征值平方根得到標(biāo)準(zhǔn)化變量的系數(shù)向量，依此列出主成分解析表達(dá)式：

表11 乳酸菌固體發(fā)酵冬凌草藥渣檢測(cè)產(chǎn)物的載荷矩陣Tab.11 Load matrix of products of residue of（Rabdosia rubescens（Hemsl.）Hara by solid fermentation of lactic acid bacteria

F1=0.115X1+0.033X2+0.456X3-0.425X4+0.121X5+0.447X6+0.454X7+0.420X8；

F2=0.643X1+0.650X2+0.015X3+0.089X4+0.422X5-0.100X6-0.082X7-0.083X8。

根據(jù)各指標(biāo)成分在每個(gè)主成分中的提取貢獻(xiàn)度進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理，計(jì)算每個(gè)主成分的得分。根據(jù)主成分F1、F2在累計(jì)值中的占比，計(jì)算各處理的總得分F，排序比較。

從表12 可以看出，乳酸菌固體發(fā)酵各處理中，處理8得分最高。處理8（接種量6%、料液比1∶1.2、發(fā)酵時(shí)間6 d、發(fā)酵溫度28 ℃）粗蛋白含量較發(fā)酵前提高33.02%，粗纖維含量相較于發(fā)酵前減少24.76%，粗脂肪含量相較于發(fā)酵前提高23.08%，鈣含量相較于發(fā)酵前提高了74.07%，賴(lài)氨酸含量相較于發(fā)酵前提高21.21%。

表12 乳酸菌發(fā)酵冬凌草藥渣各處理的評(píng)價(jià)分值Tab.12 Evaluation score of each treatment of residue of Rabdosia rubescens（Hemsl.）Hara by solid fermentation of lactic acid bacteria

3 結(jié)論與討論

冬凌草藥渣為工業(yè)生產(chǎn)提取冬凌草甲素、冬凌草乙素后剩余的殘?jiān)?，目前工業(yè)生產(chǎn)提取方式較為單一，經(jīng)提取后的藥渣中仍含有大量的有效成分。齊墩果酸和熊果酸作為冬凌草藥渣中的兩種重要藥用活性成分，是其發(fā)揮藥效的物質(zhì)基礎(chǔ)[1]，可以幫助禽畜動(dòng)物增強(qiáng)抵抗力，提高抗炎能力，預(yù)防腫瘤的形成[24]。粗蛋白、粗纖維、粗脂肪、鈣、粗灰分、賴(lài)氨酸等是評(píng)價(jià)飼料營(yíng)養(yǎng)價(jià)值常用的指標(biāo)[25]。冬凌草藥渣中的粗纖維可能是一種抗?fàn)I養(yǎng)因子，因此，要降低其含量[26]。酵母菌作為酶、優(yōu)質(zhì)蛋白質(zhì)、游離核苷酸、B族維生素和氨基酸的豐富來(lái)源，廣泛應(yīng)用于飼料生產(chǎn)中，同時(shí)作為生長(zhǎng)刺激劑取代抗生素，有效克服了使用抗生素所產(chǎn)生的耐藥性、藥物殘留等一系列問(wèn)題，具有巨大的益生潛力[27]。乳酸菌具有抗菌、維持腸道菌群平衡、促進(jìn)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)消化吸收、刺激或誘導(dǎo)機(jī)體免疫系統(tǒng)、提高動(dòng)物免疫力等生理功能[28]。因此，本研究分別用酵母菌、乳酸菌作為單一發(fā)酵菌株，對(duì)冬凌草藥渣進(jìn)行固體發(fā)酵，并優(yōu)化發(fā)酵工藝，將藥渣中動(dòng)物不能直接利用的纖維素降解，提高冬凌草藥渣中齊墩果酸和熊果酸等活性物質(zhì)的含量。發(fā)酵后的冬凌草藥渣可用作一種具有高價(jià)值的飼料資源，不僅能緩解畜牧飼料資源緊張的問(wèn)題，也能解決廢棄冬凌草藥渣對(duì)周?chē)h(huán)境造成污染的問(wèn)題，為生產(chǎn)天然、安全的冬凌草微生態(tài)添加劑提供技術(shù)支撐。本研究通過(guò)單因素條件優(yōu)化，對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行相關(guān)性和主成分分析，最終篩選出適合酵母菌固體發(fā)酵冬凌草藥渣的最優(yōu)條件為接種量6%、料液比1∶1.2、發(fā)酵天數(shù)3 d、發(fā)酵溫度28 ℃，以此方法發(fā)酵冬凌草藥渣后齊墩果酸、熊果酸含量均較發(fā)酵前顯著提高，這可能是由于酵母菌可以有效提高合成齊墩果酸和熊果酸的前體α-香樹(shù)脂醇和β-香樹(shù)脂醇[29]，其確切機(jī)制還需要進(jìn)一步研究。粗脂肪較發(fā)酵前顯著提高，這與王雪濤[30]和裴麗鵬[31]的研究結(jié)果相似，粗蛋白含量較發(fā)酵前提高，但沒(méi)有顯著性差異，粗纖維含量較發(fā)酵前減少，但沒(méi)有顯著性差異，關(guān)于延長(zhǎng)酵母菌發(fā)酵時(shí)間和增加酵母菌接種量是否能繼續(xù)提高粗蛋白含量或減少粗纖維含量，有待進(jìn)一步探討。適合乳酸菌固體發(fā)酵冬凌草藥渣的最優(yōu)條件為接種量6%、料液比1∶1.2、發(fā)酵天數(shù)6 d、發(fā)酵溫度28 ℃，以此方法發(fā)酵冬凌草藥渣后齊墩果酸、熊果酸含量沒(méi)有顯著變化。甘奕[32]研究發(fā)現(xiàn)，乳酸菌發(fā)酵山楂液后游離氨基酸顯著增加，齊墩果酸含量顯著降低，本試驗(yàn)與上述研究結(jié)果一致，這表明乳酸菌可能抑制了齊墩果酸和熊果酸的析出。但乳酸菌發(fā)酵后粗蛋白、粗脂肪、賴(lài)氨酸含量均較發(fā)酵前顯著提高，粗纖維含量較發(fā)酵前顯著降低，這與吳鵬濤等[33]的研究結(jié)果相似，表明乳酸菌可以有效降解冬凌草藥渣中的纖維素，并在一定程度上增加了粗蛋白、粗脂肪等活性成分的含量。本研究中，酵母菌和乳酸菌固體發(fā)酵后的冬凌草藥渣，其鈣、粗灰分含量均有所提高，這可能是發(fā)酵過(guò)程中冬凌草藥渣中的有機(jī)物被酵母菌和乳酸菌消耗，導(dǎo)致這些無(wú)機(jī)物含量的增加[34]，乳酸菌發(fā)酵后鈣含量的顯著增加可能是由于乳酸菌促進(jìn)冬凌草藥渣中的大分子轉(zhuǎn)化為小分子，富集鈣離子[35]。綜上所述，冬凌草藥渣經(jīng)酵母菌或乳酸菌發(fā)酵后，營(yíng)養(yǎng)價(jià)值得到提高，可以添加到動(dòng)物日糧中，提高動(dòng)物的免疫力和生長(zhǎng)性能。

本研究?jī)H對(duì)冬凌草藥渣進(jìn)行了酵母菌或乳酸菌單一菌種發(fā)酵，下一步可以考慮酵母菌和乳酸菌或其他菌種混合以不同比例發(fā)酵，進(jìn)一步探究混合菌固體發(fā)酵對(duì)冬凌草藥渣的影響，解決乳酸菌發(fā)酵對(duì)冬凌草藥渣中齊墩果酸、熊果酸含量提升不明顯的問(wèn)題，為冬凌草藥渣制備飼料添加劑的研究與開(kāi)發(fā)提供技術(shù)支撐。