屈小天，王雅楠，許倩茹，李雪洋，張申立，張二芹，張改平，4

（1.河南農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，河南 鄭州450046；2.吉林大學(xué) 動物醫(yī)學(xué)院，吉林 長春130062；3.河南農(nóng)業(yè)大學(xué) 動物醫(yī)學(xué)院/國家動物免疫學(xué)國際聯(lián)合研究中心，河南 鄭州450046；4.河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 動物免疫學(xué)重點實驗室，河南 鄭州450002）

H5N1 亞型禽流感病毒（Avian influenza virus，AIV）是一種單股負(fù)鏈RNA 病毒，屬于RNA 病毒的正黏病毒科。H5N1 AIV 引起高致病性傳染病，傳播途徑是禽類之間的接觸和飛沫傳播，有時也可能通過污染的水源傳播。H5N1 AIV 主要以家禽類和野生鳥類為宿主，也有少數(shù)情況下感染人類并引起嚴(yán)重病癥，但并不會在人和人之間傳播。H5N1 AIV在全世界范圍的廣泛傳播，嚴(yán)重危害了畜牧養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)經(jīng)濟(jì)和公共衛(wèi)生安全[1-2]。做好生物安全防護(hù)和接種疫苗是預(yù)防和治療AIV 的主要手段，研發(fā)更加穩(wěn)定高效的H5亞型禽流感疫苗是非常重要的。

H5N1 AIV 由8個不同的基因片段組成，這些基因可編碼10 種不同的結(jié)構(gòu)蛋白和非結(jié)構(gòu)蛋白[3-4]。結(jié)構(gòu)蛋白有外層的神經(jīng)氨酸酶（NA）、血凝素（HA），內(nèi)部的基質(zhì)蛋白M2 和M1、核蛋白（NP），及酸性聚合酶（PA）和堿性聚合酶1（PB1）、堿性聚合酶2（PB2）3 種聚合酶，非結(jié)構(gòu)蛋白有NS1 和NS2。HA蛋白是H5N1亞型禽流感病毒表面最主要囊膜糖蛋白，呈棒狀纖突，以三聚體（HA0、HA1、HA2）形式存在，在病毒的宿主特異性、吸附、穿膜和致病力中都發(fā)揮著重要作用[5]，是研究H5 亞型禽流感疫苗的重要靶蛋白[6]，對于研制更加高效H5 亞型禽流感亞單位疫苗具有重要意義。

目前，臨床上廣泛使用H5 亞型禽流感的滅活疫苗和減毒活疫苗來預(yù)防和治療H5N1 亞型禽流感，效果良好。但是滅活疫苗沒有交叉保護(hù)作用，同時在制備過程中需要雞胚多次傳代導(dǎo)致生產(chǎn)效率較低、成本高，無法應(yīng)對突發(fā)性的禽流感大流行[7]。減毒活疫苗存在著接種方式受限、成本高和強(qiáng)毒苗安全性低等問題，只適用于在免疫系統(tǒng)較強(qiáng)的人群中應(yīng)用[8]。相較于滅活疫苗和減毒活疫苗，亞單位疫苗具有安全性高和抗原特異性高等優(yōu)點?？蒲腥藛T已經(jīng)在多種表達(dá)系統(tǒng)中成功表達(dá)了HA 蛋白，如大腸桿菌[9]、昆蟲細(xì)胞[10]、乳酸桿菌[11]和畢赤酵母[12]等。但由于重組HA 蛋白的免疫原性和穩(wěn)定性等問題，限制了這些表達(dá)系統(tǒng)在臨床中的應(yīng)用[13]。水稻被認(rèn)為是一種安全高效的分子生物反應(yīng)器，其生長快和生長期短，而且在體外培養(yǎng)條件下易于大規(guī)模培養(yǎng)和管理。水稻細(xì)胞壁比較薄，細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)中含有較低的蛋白酶活性，這使得水稻易于實現(xiàn)高效的外源蛋白表達(dá)。水稻作為真核表達(dá)系統(tǒng)，能夠?qū)χ亟MHA 蛋白進(jìn)行正確的翻譯、折疊和修飾；并且植物自身攜帶的植物性病毒和微生物不會對人與動物造成危害[14-15]。使用水稻胚乳表達(dá)H5 亞型重組HA 蛋白具有非常高的安全性，而且生產(chǎn)成本低和容易規(guī)?；a(chǎn)[16-17]。為此，利用水稻胚乳表達(dá)體系的優(yōu)點，構(gòu)建H5N1 AIV 重組HA 蛋白的穩(wěn)定表達(dá)體系，并對重組HA 蛋白進(jìn)行了分離純化和免疫原性評估，以期為后續(xù)H5N1 AIV 診斷試劑的研發(fā)和亞單位疫苗的制備奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 基因、載體、主要試劑及供試動物

pUC57-HA由南京金斯瑞生物科技有限公司合成；中間載體pMP3、植物表達(dá)載體pCAMBIA-1300和EHA105農(nóng)桿菌感受態(tài)由武漢禾元生物科技股份有限公司提供；大腸桿菌DH5α 菌株、DL1500 Marker和GeneRuler 1 kb DNA Marker購自大連寶生生物公司；MlyⅠ、XhoⅠ、NaeⅠ、EcoR Ⅰ和HindⅢ內(nèi)切酶購自NEB（英國）公司；陰離子Q 填料購自TOSOH（日本）公司；疏水Butyl填料、75 pg凝膠過濾純化柱購自GE（美國）公司；蛋白質(zhì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)購自Thermo（美國）公司；超敏ECL 化學(xué)發(fā)光試劑盒（250 mL）購自蘇州新賽美生物科技有限公司；辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的山羊抗鼠IgG購自Abbkine公司；H5N1 A/goose/Guangdong/1/1996株、H5滅活苗陽性血清保存于國家動物免疫學(xué)國際聯(lián)合中心；4周齡Balb/c小鼠購自鄭州市實驗動物中心。

1.2 重組載體pMP3-HA和pCAMBIA1300-HA的構(gòu)建

由南京金斯瑞公司合成重組質(zhì)粒pUC57-HA，用限制性核酸內(nèi)切酶MlyⅠ和XhoⅠ雙酶切重組質(zhì)粒pUC57-HA，回收HA 片段，用限制性核酸內(nèi)切酶NaeⅠ和XhoⅠ雙酶切pMP3 中間載體，回收pMP3片段，將HA 和pMP3 連接后獲得中間載體pMP3-HA。將其轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α 中，挑白斑菌落，使用LB 液體培養(yǎng)（卡那霉素50 μg/mL）。用AXYEGN 試劑盒提取重組質(zhì)粒pMP3-HA，雙酶切（EcoR Ⅰ和Hind Ⅲ）和PCR 鑒定后，送至武漢擎科生物有限公司測序。使用限制性核酸內(nèi)切酶EcoRⅠ和Hind Ⅲ雙酶切pCAMBIA1300，連接HA與pCAMBIA1300，并轉(zhuǎn)化到DH5α 中，挑白斑菌落，使用LB 液體培養(yǎng)（卡那霉素50 μg/mL），對重組質(zhì)粒pCAMBIA1300-HA進(jìn)行雙 酶切（EcoR Ⅰ和HindⅢ）和PCR鑒定。

1.3 水稻遺傳轉(zhuǎn)化及重組HA蛋白表達(dá)鑒定

1.3.1 水稻遺傳轉(zhuǎn)化 將重組質(zhì)粒pCAMBIA1300-HA通過電轉(zhuǎn)化方法轉(zhuǎn)化到EHA105 農(nóng)桿菌中，并用PCR 方法篩選陽性菌。用陽性根瘤農(nóng)桿菌EHA105侵染培養(yǎng)8 d左右的TP309胚乳愈傷組織，經(jīng)過暗培養(yǎng)、潮霉素篩選、愈傷分化、生根、成苗。利用CTAB法提取水稻葉片的DNA，利用HA引物（表1）進(jìn)行PCR 擴(kuò)增鑒定。最后將篩選到的陽性植株種植到大田中，4個月后收獲水稻種子。

表1 引物序列Tab.1 Primer sequences

1.3.2 重組HA 蛋白鑒定 收獲不同株系的水稻種子，研磨成粉末，加入HA 蛋白提取液（30 mmol/L Tris-HCl，pH 值7.5），室溫下攪拌1.5 h，4 ℃離心機(jī)12 000 r/min 離心15 min，取上清。以H5 滅活苗陽性血清為一抗，HRP 標(biāo)記的山羊抗鼠抗體為二抗，Western blot鑒定各個植株HA蛋白的表達(dá)量。

1.4 重組HA蛋白的純化

1.4.1 蛋白質(zhì)提取液的篩選 將1.3.2 中HA 蛋白表達(dá)量高的水稻種子脫殼，研磨成粉，分別與不同提取溶液（表2）按照質(zhì)量體積比（m/V）1∶5的比例混合，室溫下攪拌提取1.5 h，4 ℃離心機(jī)12 000 r/min離心15 min，棄沉淀，上清經(jīng)0.22 μm 濾膜過濾，作為HA 蛋白的粗提液。Western blot 篩選最佳的HA蛋白提取液。

表2 不同的提取緩沖液信息Tab.2 Different extraction buffers

1.4.2 純化方法的組合 摸索不同層析組合方式，最終確立了三步純化方法，首先使用50 mL TOSOH Q 填料對重組HA 蛋白粗提液進(jìn)行初步分離純化，收集7%洗脫液，進(jìn)行25%硫酸銨沉淀。硫酸銨沉淀上清液使用10 mL Butyl 填料進(jìn)一步分離純化，收集100%洗脫液。采用pH 值7.5 的30 mmol/L Tris-HCl緩沖液對100%洗脫液進(jìn)行濃縮換液后，用凝膠過濾層析柱進(jìn)行最終純化。將蛋白質(zhì)粗提液與所有流穿液和洗脫液進(jìn)行SDS-PAGE 和Western blot鑒定，評估目的蛋白純度。

1.5 重組HA蛋白的免疫評價

1.5.1 免疫程序 將純化的重組HA 蛋白與ISA 50V 佐劑按照1∶1（m/V）混合并乳化制備成疫苗，以20 μg/只皮下多點注射法免疫3只Balb/c小鼠作為試驗組；以200 μL PBS 皮下多點注射法免疫3只Balb/c 小鼠作為陰性對照組。首次免疫14 d 后加強(qiáng)免疫一次。加強(qiáng)免疫14 d 后眼眶靜脈叢采血，分離血清。

1.5.2 特異性抗體檢測 使用間接ELISA 法測定免疫小鼠的特異性抗體產(chǎn)生水平，將待檢測血清和陰性血清從1∶1 000 倍比稀釋到1∶128 000，分別加入純化的重組HA 蛋白抗原包被的微孔中，每組樣品重復(fù)3 次，37 ℃孵育1 h，每孔加入150 μL PBST洗滌5 次；每孔加入50 μL 酶標(biāo)二抗，37 ℃孵育1 h，每孔加入150 μL PBST 洗滌5 次；加入顯色液避光作用15 min，加入終止液，酶標(biāo)儀以450 nm 波長進(jìn)行讀數(shù)（OD450），待檢測血清OD450值（P）大于陰性血清OD450值（N）2.1倍時判定為陽性。

2 結(jié)果與分析

2.1 重組載體pMP3-HA和pCAMBIA1300-HA的鑒定

用MlyⅠ和XhoⅠ雙酶切重組質(zhì)粒載體pUC57-HA后，HA基因大小為3 175 bp（圖1A）。將回收的HA基因和載體pMP3 連接，構(gòu)建重組中間載體PMP3-HA，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α 中，使用EcoRⅠ和Hind Ⅲ雙酶切鑒定HA基因的大小為4 660 bp（圖1B）。將回收的HA基因與載體pCAMBIA1300連接，構(gòu)建重組植物表達(dá)載體PCAMBIA1300-HA并轉(zhuǎn)化到DH5α 中，使用EcoR Ⅰ和Hind Ⅲ雙酶切鑒定，HA基因的大小為4 660 bp（圖1C），與預(yù)期大小一致。

圖1 重組載體pUC57-HA（A）、pMP3-HA（B）和pCAMIBIA1300-HA（C）酶切鑒定Fig.1 Enzyme digestion identification of recombinant vectors pUC57-HA（A），pMP3-HA（B）and pCAMIBIA1300-HA（C）

2.2 HA基因陽性植株的篩選

采用CTAB 法提取水稻葉片的DNA，經(jīng)PCR 擴(kuò)增鑒定，結(jié)果顯示，在75 株水稻中篩選到58 株陽性植株，HA基因擴(kuò)增大小為608 bp，圖2 為部分植株的PCR 鑒定結(jié)果，表明HA基因已成功整合到水稻基因組中。

圖2 HA基因陽性植株P(guān)CR鑒定Fig.2 PCR identification of HA gene positive plants

2.3 HA蛋白表達(dá)的鑒定

挑選11 個株系的水稻種子，經(jīng)研磨、提取液提取后，進(jìn)行Western blot鑒定。結(jié)果顯示，HA蛋白大小約為140 ku（圖3），與預(yù)期結(jié)果一致，表明HA基因在水稻胚乳中成功地表達(dá)，即成功構(gòu)建了H5N1亞型禽流感病毒HA蛋白的水稻胚乳表達(dá)系統(tǒng)。

圖3 重組HA蛋白Western blot鑒定Fig.3 Western blot identification of recombinant HA protein

2.4 重組HA蛋白的純化

2.4.1 蛋白質(zhì)提取液的篩選 根據(jù)重組HA 蛋白特性和水稻胚乳蛋白特性，篩選能夠最大程度溶解重組HA 蛋白的提取液，Western blot 結(jié)果如圖4 所示，6、7和8三種蛋白質(zhì)提取液溶解的HA蛋白較多。最終確定，以6 號蛋白質(zhì)提取液（50 mmol/L Tris，1 mmol/L EDTA，pH值7.5）作為重組HA蛋白提取液。

2.4.2 純化方法的效果 第一步使用陰離子層析分離純化重組HA 蛋白，填料為Q，SDS-PAGE（圖5A）和Western blot（圖5B）表明，在使用Q 柱層析分離純化后，重組HA 蛋白在7%洗脫液中，相較于重組HA 蛋白粗提液，重組HA 蛋白得到了富集，并除去了大部分雜蛋白（流穿液和100%洗脫液均為去除的雜蛋白）。

圖5 HA蛋白Q陰離子層析SDS-PAGE（A）和Western blot（B）鑒定Fig.5 HA protein Q anion chromatography identified by SDS-PAGE（A）and Western blot（B）

第二步分離純化重組HA 蛋白的方法為疏水層析。SDS-PAGE（圖6A）和Western blot（圖6B）鑒定結(jié)果顯示，重組HA 蛋白在100%洗脫液中，相較于第一步分離純化，重組HA 蛋白得到進(jìn)一步的富集和純化，去除了較多的雜蛋白（流穿液和60%洗脫液均為去除的雜蛋白）。

圖6 HA蛋白疏水層析SDS-PAGE（A）和Western blot（B）鑒定Fig.6 HA protein hydrophobic chromatography identified by SDS-PAGE（A）and Western blot（B）

最后是凝膠過濾層析分離純化HA 蛋白，以達(dá)到最終的純化效果，SDS-PAGE（圖7A）和Western blot（圖7B）的檢測可知，HA 蛋白在流穿液2 中，Quantity One 軟件分析重組HA 蛋白純度達(dá)到90%以上，達(dá)到目的純度。

圖7 HA蛋白凝膠過濾層析SDS-PAGE（A）和Western blot（B）鑒定Fig.7 HA protein gel filtration chromatography identified by SDS-PAGE（A）and Western blot（B）

2.5 重組HA蛋白的免疫評估

加強(qiáng)免疫14 d 后采集并分離小鼠血清，間接ELISA 法檢測小鼠血清抗體水平。從圖8 可以看出，3 只小鼠血清的抗體效價都達(dá)到1∶128 000 以上，具有較高的抗體水平，表明重組HA 蛋白具有很好的免疫原性。

圖8 小鼠血清抗體水平測定結(jié)果Fig.8 Measurement of serum antibody levels in mice

3 結(jié)論與討論

H5N1 亞型禽流感是甲型流感病毒引起的急性和高接觸性傳染病，自1996 年首次分離出H5N1 亞型禽流感病毒以來，該病毒在許多國家和地區(qū)出現(xiàn)，主要分布在亞洲、非洲和歐洲，嚴(yán)重危害著養(yǎng)殖業(yè)和公共衛(wèi)生安全，研發(fā)更加安全高效的疫苗便顯得十分重要。HA 蛋白是禽流感表面最主要囊膜糖蛋白，能夠誘導(dǎo)產(chǎn)生中和抗體，是研究禽流感疫苗的重要靶蛋白[18-20]。S?CZY?SKA 等[21]在大腸桿菌中表達(dá)了H5N1 AIV 重組HA 蛋白rH5-E.coli，但原核表達(dá)系統(tǒng)在其表達(dá)過程中不一定能夠正確地翻譯后修飾，特別是糖基化修飾，從而無法保證其生物學(xué)功能，rH5-E.coli作為抗原進(jìn)行免疫不具有免疫持久性。TANG 等[22]利用昆蟲細(xì)胞成功表達(dá)了H5N1 AIV 重組HA 蛋白，但表達(dá)量較低，穩(wěn)定細(xì)胞系建立難度較大，成本較高，無法滿足疫苗生產(chǎn)時大規(guī)模生產(chǎn)蛋白質(zhì)的需要。

本研究采用不含His標(biāo)簽、不含生物毒性、具備糖基化修飾、安全性高且同時具備容易培養(yǎng)、成本低廉等優(yōu)勢的轉(zhuǎn)基因水稻來表達(dá)重組HA 蛋白。水稻作為植物表達(dá)系統(tǒng)的主要宿主之一，廣泛應(yīng)用于生產(chǎn)重組蛋白[23]、抗體[24-25]和制備疫苗[26]等方面。水稻生長快、生長期短，而且在體外培養(yǎng)條件下易于大規(guī)模培養(yǎng)和管理，同時在水稻基因組中存在一些高效的啟動子和轉(zhuǎn)錄因子元件，如OsAct1、OsUbiquitin 和OsUbi-1 等元件，這些元件有利于構(gòu)建和優(yōu)化水稻表達(dá)載體。目前，已有H9 亞型禽流感病毒HA蛋白、新城疫病毒HN蛋白和狂犬病病毒G 蛋白等在水稻中成功表達(dá)，表達(dá)出的蛋白質(zhì)具有遺傳穩(wěn)定、表達(dá)高效和免疫原性好等優(yōu)點[27]?？梢?，水稻是一種很好的植物生物反應(yīng)器[28]。但其在使用過程中，后期的分離純化是一個難題。重組HA 蛋白經(jīng)過分離純化后才能被應(yīng)用，但是重組HA 蛋白的純化成本高昂，占總成本的60%～80%[29]。由于目的蛋白自身的復(fù)雜性和來源的多樣性，導(dǎo)致目前尚未能夠建立起一種通用的蛋白質(zhì)分離純化技術(shù)。常用的蛋白質(zhì)分離純化方法包括離子交換層析、等電點沉淀法、疏水層析、親和層析和凝膠過濾層析等[30]。Ni 離子親和層析是實驗室最常用的蛋白質(zhì)分離純化方法，但是由于添加了His標(biāo)簽，有可能影響蛋白質(zhì)構(gòu)象，同時Ni 離子親和層析填料成本高，導(dǎo)致難以應(yīng)用于工業(yè)化生產(chǎn)。疏水填料和離子填料可以多次重復(fù)使用并且蛋白質(zhì)結(jié)合載量高，常常被用作批量化生產(chǎn)。

本試驗以HA 蛋白為研究對象，前期研究確定了最佳的色譜填料后，還需進(jìn)一步研究pH 值、離子強(qiáng)度等與填料相互作用的最優(yōu)條件。利用梯度洗脫法，逐級篩選出適宜的離子強(qiáng)度，使重組HA 蛋白與填料之間的相互作用最大化，并降低雜質(zhì)蛋白質(zhì)與填料之間的相互作用，從而達(dá)到最佳的分離效果。單一的疏水相互作用層析或離子交換層析很難獲得較好的分離效果，故本研究將2 個填料結(jié)合應(yīng)用于目的蛋白的分離純化。在此基礎(chǔ)上，本研究采用3個步驟，先后使用Q 陰離子交換色譜、疏水色譜和凝膠過濾色譜分離純化重組HA 蛋白的純化方法，通過SDS-PAGE 和Western blot 檢測重組HA 蛋白的純化效果，可以直觀觀測到去除的雜蛋白含量和目的蛋白位置，重組HA 蛋白純度純化到90%以上。以重組HA 蛋白為抗原制備亞單位疫苗，生產(chǎn)工藝簡單、易于大規(guī)模生產(chǎn)且生物安全性高，彌補了滅活疫苗和減毒活疫苗的缺點，是開發(fā)H5N1 亞型禽流感亞單位疫苗的一個重要方向。因此，本研究利用純化的重組HA 蛋白與ISA 50V 混合并乳化制備成亞單位疫苗，免疫小鼠，二免2周后小鼠血清抗體水平ELISA 效價達(dá)到1∶128 000 以上，表明重組HA蛋白具有較好的免疫原性。

綜上所述，本研究成功構(gòu)建了能夠穩(wěn)定表達(dá)H5N1 亞型禽流感病毒HA 蛋白的水稻胚乳表達(dá)系統(tǒng)，并使用三步分離純化方法獲得了純度為90%以上的重組HA蛋白，對重組HA蛋白免疫原性進(jìn)行了評估，為H5N1亞型禽流感病毒HA蛋白的功能研究和亞單位疫苗的研發(fā)奠定基礎(chǔ)。