劉麗娜，李順峰，許方方，崔國梅，高帥平，王安建，田廣瑞，魏書信

（河南省農(nóng)業(yè)科學院 農(nóng)產(chǎn)品加工研究中心，河南 鄭州 450002）

香菇（Lentinus edodes）隸屬真菌門擔子菌亞門層菌綱傘菌目側耳科，是我國人工栽培最廣泛的大宗食用菌種類[1]。香菇是一種典型的木腐菌，其栽培主要以富含木質纖維素的農(nóng)林業(yè)生物質資源為原料，生長過程中可分泌系列降解酶破壞木質纖維素的結構，轉化成可吸收利用的小分子物質[2-3]。這種營養(yǎng)模式通過菌類生長達到對木質纖維類生物質的高效、溫和處理，在生產(chǎn)美味菌菇的同時，還發(fā)揮著重要的生態(tài)作用。

木質纖維素類生物質結構復雜，其降解利用對香菇的生長發(fā)育至關重要[4-6]。因此，探索木質纖維素的生物降解規(guī)律具有十分重要的作用，已成為食用菌生產(chǎn)的熱點研究領域之一。目前，僅有少量有關食用菌降解木質纖維素的研究報道，且主要集中在菌株篩選[3，7]、酶學特性[8-9]、營養(yǎng)成分變化[10]、降解機制[11-12]等方面，并沒有香菇栽培過程中木質纖維素成分的變化特征的詳細報道。鑒于此，以不同生長期的香菇栽培料為研究對象，對香菇栽培過程中木質纖維素含量、纖維素結晶度、傅里葉紅外光譜和纖維形態(tài)進行研究，旨在闡明香菇栽培過程中培養(yǎng)料木質纖維素的變化特征，為更好地研究香菇對培養(yǎng)料木質纖維素降解利用機制提供科學依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

供試香菇菌株森源19、木屑、麩皮、石灰、石膏由洛陽雙惠菌業(yè)有限公司提供，培養(yǎng)料配方為木屑78%、麩皮20%、石灰1%、石膏1%，含水量55%。

1.2 試劑與儀器

乙二胺四乙酸鈉、四硼酸鈉、十六烷基三甲基溴化銨、十二烷基硫酸鈉、無水磷酸氫二鈉、乙二醇乙醚、冰醋酸、硫酸等均為分析純，購自國藥集團化學試劑有限公司。

儀器主要包括：FA2004C 分析天平（上海越平科學儀器有限公司）、YP30002 電子天平（上海佑科儀器儀表有限公司）、XB-20B 多功能粉碎機（上海兆申科技有限公司）、DF-101S 集熱式恒溫加熱磁力攪拌器（河南省予華儀器有限公司）、Advanced-I艾柯超純水機（臺灣艾柯成都康寧實驗專用純水設備廠）、X-射線衍射儀（荷蘭Panalytical Empyrean 公司）、Nicolet is5 型傅里葉變換紅外光譜儀（賽默飛世爾科技公司）、OlmpusBX51 光學顯微鏡（日本OLYMPUS公司）。

1.3 試驗方法

將培養(yǎng)料拌勻裝袋，塑料袋規(guī)格15 cm×55 cm×0.007 cm，袋裝料質量（2.2±0.1）kg，裝好的料袋放入滅菌鍋中100 ℃常壓滅菌12 h，當袋溫降至28 ℃以下時，按常規(guī)無菌操作進行接種。按照河南省地方標準《春栽香菇代料栽培技術規(guī)程》[13]（DB41/T 2048—2020）進行香菇的栽培管理。分別在香菇接種前原料（S0）、菌絲滿袋（S1）、菌袋轉色（S2）、收獲一茬菇（S3）、收獲二茬菇（S4）5 個時期進行取樣。在每個生長期各隨機選取6 個不同的栽培袋，將培養(yǎng)料揉碎混勻后作為該時期的代表樣品，凍干后粉碎，過0.30 mm篩用于測定。

1.4 測定方法

1.4.1 木質纖維素含量的測定 木質纖維素主要由纖維素、半纖維素和木質素三部分組成。根據(jù)VAN SOEST 等[14-15]的方法測定纖維素、半纖維素和木質素含量，其中纖維素和半纖維素含量之和為綜纖維素含量。

1.4.2 X-射線衍射分析 取少量干燥后的培養(yǎng)料粉末樣品進行X-射線衍射分析[16]，以銅靶為測試靶材，掃描范圍為5～50°，掃描速度為5°/min，獲得X-射線衍射圖。采用Segal 法計算樣品纖維素結晶度（Cellulose crystallinity index，CrI），計算公式如下：

式中：CrI表示纖維素結晶度（%）；I002表示纖維素結晶區(qū)部分的衍射峰強度；Iam表示纖維素無定形區(qū)部分的衍射峰強度。

1.4.3 紅外光譜分析 采用李順峰等[17]的方法取培養(yǎng)料粉末樣品，壓片后用傅立葉變換紅外光譜儀（Fourier transform infrared spectroscopy，F(xiàn)TIR）掃描，所得結果用Omnic 8.0軟件進行分析。

1.4.4 光學顯微成像分析 采用黃慧等[18]的方法使用未粉碎的香菇培養(yǎng)料對其纖維形態(tài)進行測定。使用雙氧水和冰醋酸（體積比1∶1）混合液制作觀察玻片，利用光學顯微鏡和數(shù)碼顯微成像系統(tǒng)（Mshot digital imaging system V9.0）測量纖維各形態(tài)尺寸，在40 倍顯微鏡下測量纖維長度，在100 倍顯微鏡下測量纖維寬度。

1.5 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS 22.0 統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析，LSD方差分析法（P＜0.05）進行統(tǒng)計學分析。

2 結果與分析

2.1 不同生長期香菇培養(yǎng)料的木質纖維素含量

對木質纖維素的生物降解作用，不同香菇菌株間存在著一定差異，香菇降解木質纖維素（纖維素、半纖維素和木質素）的能力比草腐菌強[19]。由表1可知，香菇培養(yǎng)料原料中木質纖維素含量高達85.266%，木質纖維素各組分含量在香菇不同生長期之間均存在顯著差異。在香菇栽培過程中木質纖維素各組分含量的變化趨勢大體類似，總體上呈現(xiàn)一直下降的趨勢。半纖維素與木質素含量在菌絲生長階段（S1）降解較慢，半纖維素在菌絲滿袋（S1）時，比原料（S0）略有增加，這可能是因為半纖維素、木質素的降解速率小于因菌絲呼吸而引起的培養(yǎng)料失重速率。纖維素在菌絲生長階段（S1）降解了12.92%，生殖生長階段（S2、S3 和S4）降解了21.81%，說明纖維素生殖生長階段降解較多。半纖維素、木質素、綜纖維素的降解具有明顯的階段性，前期菌絲生長階段（S1）降解速度較慢，進入轉色（S2）后降解速度加快。半纖維素、木質素、綜纖維素及纖維素最快降解時期均在一茬菇（S3），該階段各指標降解百分比達到最大值，分別為30.09%、31.00%、19.10% 和14.76%。二茬菇（S4）與原料（S0）相比，纖維素降解34.73%，半纖維素降解61.58%、木質素降解57.15%、綜纖維素降解42.33%；纖維素、半纖維素、木質素、綜纖維素含量此時均降到最低，但仍處于較高水平，說明香菇對培養(yǎng)料的降解并不徹底，有必要進一步增加出菇茬數(shù)以提高香菇對培養(yǎng)料的利用效率。此外，香菇對半纖維素、木質素的降解率均在55%以上，顯著高于纖維素，具有一定的降解優(yōu)勢和選擇性，這可能與植物細胞壁的構成有關[20]。

表1 不同生長期香菇培養(yǎng)料的木質纖維素含量Tab.1 Lignocellulosic content in Lentinus edodes culture material during different growth periods %

2.2 不同生長期香菇培養(yǎng)料的纖維素結晶度

纖維素結晶度是指纖維素結晶區(qū)占纖維素整體（包括結晶區(qū)和無定形區(qū)）的百分率，結晶度高則纖維的彈性模量、抗拉強度及尺寸穩(wěn)定性也高[21]。采用X 射線衍射研究了不同生長期香菇培養(yǎng)料纖維素的結晶特性（圖1和表2）。從圖1可以看出，原料S0在2θ為14.915°、22.740°、24.392°、38.184°處的衍射峰顯示出典型的木質纖維素結晶圖譜；經(jīng)過香菇生長后，14.915°及22.740°處的衍射峰強度明顯地持續(xù)降低，說明香菇生長對培養(yǎng)料的結晶度影響較大，其結晶區(qū)在一定程度上被破壞。其中，纖維素X 射線衍射典型特征002 晶面的結晶度如表2 所示，002 晶面衍射峰的位置介于22.287°～22.857°，香菇生長后無明顯改變；菌絲滿袋（S1）、菌袋轉色（S2）、一茬菇（S3）、二茬菇（S4）的結晶度與原料（S0）相比，其結晶度分別降低22.39%、29.02%、46.91%、61.86%，呈現(xiàn)出原料S0 的纖維素結晶度持續(xù)不同程度地減少的變化趨勢，說明香菇在生長過程中一直存在對培養(yǎng)料中纖維素晶胞的持續(xù)降解作用，該結果與表1中纖維素含量的變化結果一致。此外，不同生長期香菇培養(yǎng)料的衍射曲線均出現(xiàn)一些其余衍射峰，估計跟香菇生長后生成了其他物質如菌絲多糖等有關。

圖1 不同生長期香菇培養(yǎng)料的X射線衍射Fig.1 X-ray diffraction of Lentinus edodes culture material during different growth periods

表2 不同生長期香菇培養(yǎng)料的纖維素結晶度Tab.2 Cellulose crystallinity in Lentinus edodes culture material during different growth periods

2.3 不同生長期香菇培養(yǎng)料的木質纖維素紅外光譜

利用傅里葉紅外光譜分析儀對不同生長期香菇培養(yǎng)料中纖維結構和化學組分進行表征，F(xiàn)TIR 圖譜結果見圖2。通過參照相關文獻[22-26]，確定該圖譜中特征峰及歸屬，分析結果見表3。圖2、表3結果表明，香菇不同生長期培養(yǎng)料的傅里葉紅外光譜類似，主要吸收峰的位置未發(fā)生改變，在波數(shù)為1 800～800 cm-1范圍內(nèi)均可以觀察到木質纖維素各組分的特征官能團的振動，說明香菇不同生長期培養(yǎng)料中均含有大量的木質纖維素，但特征吸收峰在1 723、1 640、1 510、1 459、1 423、1 383、1 319、1 263、1 157、1 105、1 055、897 cm-1處的振動強度總體呈現(xiàn)減弱趨勢，表明隨著香菇生長進程的推進，培養(yǎng)料中木質纖維素各組分被降解，對應的紅外光譜吸收峰強度隨之改變。這與表1中香菇栽培過程對木質纖維素的降解利用規(guī)律一致。本研究中，1 510 cm-1處苯環(huán)芳香骨架振動是木質素的特征吸收峰；1 723 cm-1處乙酰基和羧基C=O 伸縮振動是半纖維素區(qū)別于其他組分的特異吸收峰；1 383、1 157 cm-1處是纖維素和半纖維素特定官能團振動引起；897 cm-1處C-H變形振動是纖維素的特征吸收峰。

圖2 不同生長期香菇培養(yǎng)料的FTIR圖譜Fig.2 FTIR spectra of Lentinus edodes culture material during different growth periods

表3 不同生長期香菇培養(yǎng)料的紅外圖譜特征峰Tab.3 FTIR absorption peak location and assignment of Lentinus edodes culture material during different growth periods

纖維素、半纖維素與木質素的特征峰相對強度值可用來判定木質纖維素相對含量的高低[22]。為了進一步明確香菇栽培過程中培養(yǎng)料木質纖維素相對含量的變化，表4列出了纖維素、半纖維素與木質素的特征峰相對強度值。由表4可知，I1723/I1510、I1383/I1510、I1157/I1510、I897/I1510 特征峰比值在香菇不同生長期間存在顯著差異?？傮w來看，隨著香菇生長進程的推進，I1723/I1510、I1383/I1510、I1157/I1510 呈現(xiàn)不斷減少的趨勢，這與纖維素、半纖維素含量的減少有關；而比值I897/I1510 在轉色（S2）和一茬菇（S3）呈增大趨勢，同時纖維素特征峰峰高卻呈降低趨勢，表明該生長期香菇木質素相比纖維素有著更快的降解速率。這一結果說明香菇對木質纖維素各組分的降解程度不同，與表1 中不同生長期香菇培養(yǎng)料中木質纖維素各組分的降解利用規(guī)律一致。

表4 不同生長期香菇培養(yǎng)料的紅外圖譜特征峰相對強度Tab.4 Relative intensity of FTIR spectra characteristic peak in Lentinus edodes culture material during different growth periods

2.4 不同生長期香菇培養(yǎng)料的纖維形態(tài)

形態(tài)特征（纖維長度、纖維寬度等）與培養(yǎng)料中木屑的物理力學性能關系密切[27]，纖維寬度大，纖維間的接觸面積就大，木質強度就高。香菇不同生長期的纖維形態(tài)如表5 所示，隨著香菇生長進程的推進，纖維長度及寬度總體上呈現(xiàn)降低趨勢，二茬菇（S4）纖維長度和纖維寬度最小，與其他生長期存在顯著性差異；滿袋（S1）、轉色（S2）的纖維長度與原料（S0）無顯著差異，滿袋（S1）、轉色（S2）、一茬菇（S3）的纖維寬度與原料（S0）無顯著差異。這表明香菇栽培過程中對纖維的降解利用是緩慢推進的，栽培料中木質的強度、力學性能隨著纖維的降解逐漸下降，最終逐漸失去其固有的形態(tài)支撐。

表5 不同生長期香菇培養(yǎng)料的纖維形態(tài)特征Tab.5 Fiber morphological characteristics of Lentinus edodes culture material during different growth periods μm

為進一步呈現(xiàn)纖維形態(tài)變化，將具有顯著差異的二茬菇（S4）與原料（S0）進行光學顯微成像分析（×10），結果見圖3。經(jīng)顯微鏡觀察，原料（S0）的纖維壁及內(nèi)腔表面較為光滑平整，結構致密規(guī)整，呈直線形狀態(tài)；二茬菇（S4）經(jīng)過香菇生長后纖維壁及內(nèi)腔遭到破壞，出現(xiàn)較多孔洞、裂紋、粗糙、斷裂的現(xiàn)象，及少量膨松狀態(tài)片狀結構。這進一步表明了纖維的降解使得其結構形態(tài)發(fā)生了變化，與前人[28-29]對秸稈類木質纖維素降解研究的結果相一致。

圖3 2種培養(yǎng)料纖維的顯微形態(tài)Fig.3 Fiber microscopic morphology of two kinds of culture materials

3 結論與討論

香菇是典型的木腐菌代表，木質纖維素是香菇生長過程中大部分營養(yǎng)的提供源，因此，本研究以不同生長期香菇培養(yǎng)料中木質纖維素的變化特征為切入點，闡明香菇利用基質中木質纖維素的生物降解規(guī)律。結果表明，香菇培養(yǎng)料中木質纖維素的含量在不同生長期之間存在顯著差異，總體上呈現(xiàn)一直下降的趨勢；纖維素在生殖生長階段（S2、S3和S4）降解較多，半纖維素、木質素、綜纖維素的降解具有明顯的階段性，進入轉色階段（S2）后降解速度加快，潘迎捷等[30]、倪新江等[31]的研究中也有相似的結果。木質素很難被直接降解利用，LEATHAM[32]的研究認為，香菇分解木質素的能力較低，其分解木質素需要外源較易利用的碳源；本試驗中木質素在菌絲生長階段降解速度較慢，也佐證了這一點，并與吳學謙等[33]香菇節(jié)木栽培基質木質素發(fā)菌階段的降解率較低這一結果相同。有研究報道[34]，纖維素和半纖維素降解最快的時期出現(xiàn)在出菇階段，而木質素在降解過程中會被優(yōu)先利用，可能是由于木質素包裹著纖維素同時與半纖維素具有共價關系的結構特點。本試驗中，木質素在轉色階段（S2）降解百分比達到23.77%，之后纖維素、半纖維素、綜纖維素最快降解時期出現(xiàn)在一茬菇（S3），與前人報道[34]基本一致。二茬菇（S4）與原料（S0）相比，纖維素降解34.73%，半纖維素降解61.58%、木質素降解57.15%、綜纖維素降解42.33%，說明半纖維素、木質素在香菇碳素利用中居主要地位，且木質纖維素各組分降解程度高于前人[35]對相同培養(yǎng)料配方及茬數(shù)下的F 型菌株的研究報道，這估計是由不同香菇菌株的木質纖維素降解酶體系存在一定差異引起的。

X-射線衍射、紅外光譜和纖維形態(tài)變化是木質纖維素成分變化的良好反映，可以進一步多角度地反映出木質纖維素的結構變化特征，香菇的栽培過程還缺乏這樣的研究。本研究結果顯示，不同生長期的香菇培養(yǎng)料均具有典型的纖維素X 射線衍射典型特征及木質纖維素的紅外光譜特征官能團的振動。隨著香菇生長進程的推進，纖維素典型衍射峰的結晶度持續(xù)減少，說明香菇在生長過程中一直存在對培養(yǎng)料中纖維素晶胞的持續(xù)降解作用；紅外光譜主要吸收峰的位置未發(fā)生改變，木質纖維素各組分的特征官能團的振動強度總體呈現(xiàn)減弱趨勢，與木質纖維素各組分的降解利用規(guī)律一致；特征峰比值I1723/I1510、I1383/I1510、I1157/I1510 不斷減少，而I897/I1510 在轉色（S2）和一茬菇（S3）呈增大趨勢，同時纖維素特征峰峰高卻呈降低趨勢，表明該生長期香菇木質素相比纖維素有著更快的降解速率。纖維長度及寬度總體上呈現(xiàn)降低趨勢，二茬菇（S4）纖維長度及寬度最小，與其他生長期存在顯著性差異。經(jīng)顯微鏡觀察，二茬菇（S4）時，經(jīng)過香菇生長后，培養(yǎng)料纖維壁及內(nèi)腔遭到破壞，出現(xiàn)較多孔洞、裂紋、粗糙、斷裂的現(xiàn)象，及少量膨松狀態(tài)片狀結構，明顯區(qū)別于原料（S0）的光滑平整、結構致密規(guī)整，這進一步表明了纖維的降解使得其結構發(fā)生變化。經(jīng)過二茬菇生長后香菇培養(yǎng)料中木質纖維素仍處于較高水平，生物質資源利用并不徹底，對其更高程度的轉化利用方式還有待于進一步深入研究。

綜上，栽培過程中香菇對培養(yǎng)料木質纖維素具有較強的持續(xù)的降解作用，可顯著降低木質纖維素含量，破壞纖維素結晶區(qū)，使得紅外光譜吸收峰及纖維形態(tài)發(fā)生改變。