沈智俊，沈 駿

（1.貴州中醫(yī)藥大學(xué)，貴州 貴陽 550002；2.貴州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，貴州 貴陽 550001）

激素性股骨頭壞死（SONFH）是骨科常見的難治性骨病之一。流行病學(xué)調(diào)查發(fā)現(xiàn)，近年來股骨頭壞死的發(fā)病率逐年上升，但其具體發(fā)病機(jī)制仍在探索中，且尚未研發(fā)出特效藥來延緩疾病的進(jìn)展，臨床治療以緩解疼痛為主[1]。中醫(yī)以整體觀念、辨證論治的治療理念為指導(dǎo)，治療股骨頭壞死療效較好[2]。本研究通過建立SONFH 大鼠模型，觀察化瘀活骨湯對股骨頭壞死相關(guān)細(xì)胞因子的影響，進(jìn)一步深入研究該方的治療機(jī)制，使化瘀活骨湯在原有基礎(chǔ)上得到更多應(yīng)用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物

健康成年雄性SD 大鼠35 只，體重約200 g，每籠4 只，標(biāo)準(zhǔn)飼料、自由飲水?dāng)z食喂養(yǎng)，室溫控制在21 ℃～24 ℃，濕度維持在40%～70%，光照晝夜交替12 h。貴州醫(yī)科大學(xué)動物實(shí)驗(yàn)倫理審查表編號：2305073。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑

注射用甲潑尼龍琥珀酸鈉（500 mg/瓶，國藥集團(tuán)容生制藥有限公司，國藥準(zhǔn)字H20040844，500mg/瓶）；注射用青霉素鈉（山東二葉制藥有限公司，國藥準(zhǔn)字H32021308，0.48g:80 萬單位）；大腸桿菌內(nèi)毒素（美國Sigma 公司）；大鼠腫瘤壞死因子-α（TNF-α）酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）試劑盒（酶免，貨號：MM-0180R2）；大鼠白細(xì)胞介素-1β（IL-1β）ELISA 試劑盒（酶免）；大鼠白細(xì)胞介素-6（IL-6）ELISA 試劑盒（酶免）。

1.3 實(shí)驗(yàn)儀器

臺式高速冷凍離心機(jī)（湖南可成儀器設(shè)備有限公司）；電熱恒溫培養(yǎng)箱（日本ASONE）；酶標(biāo)儀（Thermo Scientific）；全自動洗板機(jī)（杭州米歐儀器有限公司）；多樣品組織研磨儀（上海凈信實(shí)業(yè)發(fā)展有限公司）。

1.4 藥物

化瘀活骨湯由當(dāng)歸、川芎、桃仁、紅花、赤芍、莪術(shù)、骨碎補(bǔ)、續(xù)斷、丹參、仙靈脾等中藥組成，由貴州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院中藥房提供，制成1.76 g/mL 的母液，藥液冷卻，低溫儲存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 實(shí)驗(yàn)方法

（1）分組及造模方法。大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1 周后，按照隨機(jī)數(shù)表法分為NC 組、Model 組、化瘀活骨湯組（基礎(chǔ)劑量組、雙倍劑量組），每組各4 只。Model 組及化瘀活骨湯組參考文獻(xiàn)[3-4]建立SONFH 模型：大腸桿菌內(nèi)毒素20 μg/kg 腹腔注射2 次，每次間隔24 h；末次注射內(nèi)毒素24 h 后，給予甲潑尼龍琥珀酸鈉40 mg/kg 肌內(nèi)注射3 次，每次間隔24 h。注射激素后給予腹腔注射青霉素鈉80 U 預(yù)防感染，1 次/d。NC 組僅注射等量生理鹽水。造模結(jié)束后，行MRI 觀察大鼠骨髓細(xì)胞缺血及病理特征改變（T1WI 上軟骨下局限性的帶狀低信號以及T2WI 上的“雙線征”，即外緣為低信號，內(nèi)緣為高信號，通過MRI 的特征性表現(xiàn)可診斷早期股骨頭缺血性壞死[5]），判定是否造模成功。在造模成功的基礎(chǔ)上，基礎(chǔ)劑量組每天灌胃1.76 g/mL 化瘀活骨湯[根據(jù)人與動物體表面積換算公式D 鼠=D 人×R 鼠/R 人（D 為給藥劑量，R 為動物與人體表面積比值系數(shù)）及以人每天服用化瘀活骨湯治療SONFH 所用的劑量為參照[6-7]，計算出每只大鼠每天所需化瘀活骨湯的劑量，計為基礎(chǔ)劑量，同時設(shè)置雙倍劑量，分別灌胃給兩組大鼠，各自標(biāo)記為基礎(chǔ)劑量組和雙倍劑量組]，基礎(chǔ)灌胃量為1.76 g/d，Model 組和NC 組每天灌胃等量生理鹽水，4 組均連續(xù)灌胃4 周。實(shí)驗(yàn)過程中觀察各組大鼠運(yùn)動、飲食等一般情況。

（2）樣本采集。灌胃4 周后，使用10 mL 注射器抽取大鼠腹主動脈血，4℃下以3000 r/min 轉(zhuǎn)速離心15 min，分離血清備用。

1.6 觀察指標(biāo)

比較各種大鼠的血清IL-1β、IL-6、TNF-α 水平，觀察化瘀活骨湯對各組SONFH 大鼠血清IL-1β、IL-6和TNF-α 表達(dá)水平的影響。

1.7 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 20.0 軟件處理數(shù)據(jù)，計量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，行t檢驗(yàn)，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

相較于NC 組，Model 組大鼠血清中IL-1β、IL-6、TNF-α 的表達(dá)水平均顯著增高（P＜0.05），表明模型成功建立并引發(fā)了相應(yīng)的炎癥反應(yīng)。與Model 組相比，基礎(chǔ)劑量組和雙倍劑量組大鼠血清中IL-1β、IL-6、TNF-α的表達(dá)水平均有所下降（P＜0.05），特別是雙倍劑量組降低更顯著（P＜0.01）。詳見表1、圖1。

圖1 ELISA 檢測化瘀活骨湯對各組SONFH 大鼠血清IL-1β、IL-6 和TNF-α 表達(dá)水平的影響

表1 化瘀活骨湯對各組SONFH 大鼠血清IL-1β、IL-6 和TNF-α 表達(dá)水平的影響（±s）

表1 化瘀活骨湯對各組SONFH 大鼠血清IL-1β、IL-6 和TNF-α 表達(dá)水平的影響（±s）

組別劑量（g/d）IL-1β（ng/L）IL-6（pg/mL）TNF-α（pg/mL）NC 組-12.65±0.9541.43±11.6887.00±13.58 Model 組-54.93±3.32182.01±7.62339.71±15.26基礎(chǔ)劑量組1.7638.90±3.12124.75±9.39219.01±11.43雙倍劑量組3.5220.71±2.0171.36±7.73171.74±12.57

3 討論

3.1 中西醫(yī)對股骨頭壞死的認(rèn)識

（1）現(xiàn)代醫(yī)學(xué)對股骨頭壞死的認(rèn)識。當(dāng)前廣泛的學(xué)術(shù)共識是，股骨頭壞死的病理生理學(xué)機(jī)制主要與激素的過度使用等因素有關(guān)[8]。Griffith 等[9]研究發(fā)現(xiàn)，每天使用超過2 g 的潑尼松龍或等效劑量的氫化可的松，持續(xù)3個月，可以迅速誘發(fā)股骨頭壞死。飲酒過量也是股骨頭壞死的高危因素之一。Matsuo 等人[10]進(jìn)行的一項(xiàng)前瞻性研究表明，股骨頭壞死與乙醇的攝入量呈現(xiàn)顯著的劑量依賴性關(guān)系。同時，吸煙也被確認(rèn)是股骨頭壞死的風(fēng)險因素[11]。

針對股骨頭壞死的患者，現(xiàn)代醫(yī)學(xué)建議遵醫(yī)囑服用抗凝、降脂或滋養(yǎng)關(guān)節(jié)的藥物，并接受理療，包括體外沖擊波、脈沖電磁場或高壓氧治療。當(dāng)疾病進(jìn)一步發(fā)展時，可以實(shí)施髓心減壓術(shù)，以降低股骨頭局部壓力，清除壞死骨組織，改善循環(huán)障礙，促進(jìn)新骨生長。此外，還有干細(xì)胞移植術(shù)、骨移植術(shù)、截骨術(shù)等保髖手術(shù)，而對于重度股骨頭壞死來說，可能需要開展髖關(guān)節(jié)置換術(shù)[12]。

（2）中醫(yī)對股骨頭壞死的認(rèn)識。在我國傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)中，股骨頭壞死通常被歸類為“骨蝕”和“骨痿”等疾病。根據(jù)我國傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)理解，股骨頭壞死的形成與發(fā)展，其根源在于肝腎虧損、氣血兩虛。這種狀態(tài)導(dǎo)致痰、濕、瘀等有形物質(zhì)在經(jīng)脈中積聚，阻礙氣血正常流通，最終造成氣滯血瘀和氣血虧虛，缺乏充足的血液滋養(yǎng)，股骨頭最終發(fā)生壞死[13]。股骨頭壞死的原因既包括內(nèi)在的生理失衡，如五臟六腑功能失調(diào)，也包括外在因素。這兩大類因素相互作用、相互影響，共同推動疾病的發(fā)生發(fā)展。臟腑功能紊亂和氣血不和之間存在因果關(guān)系。正存于內(nèi)而邪不可干，一旦正氣虛衰，氣血便會失去平衡，導(dǎo)致衛(wèi)外功能不足，營衛(wèi)失調(diào)。這種情況下，外邪容易侵入體內(nèi)，引起陰陽失衡和氣血不調(diào)[14]。腎主骨，肝主筋，肝腎的虛衰會導(dǎo)致筋骨缺乏營養(yǎng)，這也是誘發(fā)股骨頭壞死的重要內(nèi)因。此外，外邪侵襲人體后，可導(dǎo)致痰濕、瘀血等病理產(chǎn)物在體內(nèi)積聚，干擾正常的氣血循環(huán)和脈絡(luò)通暢，造成氣血不足，由于股骨頭得不到充分的營養(yǎng)和血液供應(yīng)，最終發(fā)生壞死[15]。因此中醫(yī)在治療股骨頭壞死時，應(yīng)重視補(bǔ)腎強(qiáng)骨、活血化瘀。

《素問·陰陽應(yīng)象大論》中的敘述強(qiáng)調(diào)了腎與骨之間的緊密關(guān)系[16]?！澳I生骨髓”，腎臟是骨髓生長的基礎(chǔ)，骨髓存儲于骨腔內(nèi)，對骨骼的營養(yǎng)和健康起著至關(guān)重要的作用?！澳I充則髓實(shí)”，意味著腎功能強(qiáng)健時，骨髓能得到充分的滋養(yǎng)，從而保證了骨骼的健康。此外，中醫(yī)學(xué)認(rèn)為，肝與腎同源，因此肝功能障礙會影響氣血的正常運(yùn)行，進(jìn)而導(dǎo)致骨骼缺乏血液供應(yīng)，發(fā)生壞死。脾臟負(fù)責(zé)食物的吸收和轉(zhuǎn)化，是產(chǎn)生氣血的基礎(chǔ)，被稱為“后天之本”。脾功能障礙不僅會影響氣血的生成和輸送，還可能導(dǎo)致其他臟器功能下降。這種狀態(tài)下，骨髓得不到充足的營養(yǎng)，可能誘發(fā)股骨頭壞死等疾病。因此，從中醫(yī)的角度來看，維持腎、肝、脾的健康是預(yù)防和治療股骨頭壞死的關(guān)鍵。

3.2 化瘀活骨湯對大鼠血清炎癥因子的影響

在骨修復(fù)和重建過程中，監(jiān)測血清中的炎癥因子（如IL-1β、IL-6、TNF-α）和其他骨代謝相關(guān)指標(biāo)是評估早期股骨頭壞死的關(guān)鍵。這些炎癥因子在骨骼的生理病理中起著至關(guān)重要的作用。IL-1β 通過激活軟骨細(xì)胞和滑膜細(xì)胞，促使前列腺素E2（PGE2）和膠原酶的產(chǎn)生，這些物質(zhì)可抑制軟骨細(xì)胞的增殖和蛋白多糖的合成，導(dǎo)致軟骨基質(zhì)的分解加劇。這一作用機(jī)制說明了IL-1β 如何促進(jìn)軟骨退化及加重關(guān)節(jié)疾病的病理過程[17]。IL-6既是促炎因子，也是調(diào)節(jié)破骨細(xì)胞（OC）的主要因子之一，可刺激OC 的分化、成熟和功能表達(dá)，從而介導(dǎo)骨內(nèi)炎癥反應(yīng)，并調(diào)節(jié)骨代謝。這表明IL-6 在早期股骨頭壞死的修復(fù)及預(yù)防骨骼塌陷中起到關(guān)鍵作用，影響骨骼的健康和疾病狀態(tài)[18-19]。TNF-α 是一種強(qiáng)效的炎癥因子，通過促進(jìn)其他細(xì)胞因子的表達(dá)，調(diào)節(jié)機(jī)體的炎癥反應(yīng)和免疫反應(yīng)。在股骨頭炎癥侵蝕的過程中，TNF-α 的高表達(dá)可抑制成骨細(xì)胞（OB）功能并刺激OC 生成，進(jìn)而促進(jìn)IL-6、IL-3 等細(xì)胞因子的合成與釋放[20-21]。這些細(xì)胞因子在股骨頭壞死的發(fā)展中扮演著重要角色，不僅影響炎癥過程，還直接參與了骨代謝和破骨與成骨平衡的調(diào)節(jié)。因此，在早期股骨頭壞死的治療和管理中，了解這些炎癥因子的變化對于制定有效的治療策略至關(guān)重要。

本實(shí)驗(yàn)采用ELISA 檢測大鼠血清中IL-1β、IL-6 及TNF-α 的表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)相較于NC 組，Model 組大鼠血清中這些炎癥因子的表達(dá)水平均顯著增高（P＜0.005），這表明模型成功地模擬了SONFH 的炎癥狀態(tài)。與Model組相比，基礎(chǔ)劑量組和雙倍劑量組大鼠血清中IL-1β、IL-6 和TNF-α 的表達(dá)水平均降低，這說明化瘀活骨湯對于抑制早期SONFH 大鼠模型中這些關(guān)鍵炎癥因子的表達(dá)具有顯著作用。提示化瘀活骨湯可抑制IL-1β、IL-6、TNF-α 的表達(dá)，考慮與抑制OC 活性并促進(jìn)OB 形成有關(guān)，從而改善骨代謝，起到防治SONFH 的作用。

綜上所述，本研究進(jìn)一步揭示了化瘀活骨湯治療SONFH 的作用機(jī)制，為本病的防治提供了新的見解。