楊敏，周陳平，李慶萌，鄺瑞彬，吳夏明，魏岳榮

（廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院果樹研究所/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部南亞熱帶果樹生物學(xué)與遺傳資源利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/廣東省熱帶亞熱帶果樹研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣州 510640）

0 引言

番木瓜(CaricapapayaL.)是世界上種植和消費(fèi)最廣的熱帶水果之一，也是中國(guó)嶺南特色水果，具有很高的營(yíng)養(yǎng)和藥用價(jià)值，被世界衛(wèi)生組織列為最有價(jià)值的十大水果之首，有“百益果王”之美譽(yù)[1-3]。據(jù)《OECDFAO農(nóng)業(yè)展望報(bào)告2020—2029》預(yù)測(cè)，在未來(lái)十年內(nèi)，世界番木瓜產(chǎn)量將以每年2.1%的速度增長(zhǎng)，到2029年可達(dá)1660萬(wàn)t，發(fā)展前景廣闊。然而，番木瓜屬于典型的呼吸躍變型果實(shí)，采后常溫貯藏2～4 d，即可迅速達(dá)到生理成熟，之后果實(shí)腐爛，嚴(yán)重影響果實(shí)品質(zhì)和貨架期[4-7]。番木瓜采后貯藏已成為影響番木瓜產(chǎn)業(yè)發(fā)展的重要因素。針對(duì)這一問(wèn)題，人們開發(fā)出很多理化技術(shù)以延長(zhǎng)番木瓜貯藏時(shí)間。物理保鮮技術(shù)主要包括：熱處理[8-10]、低溫保鮮[8,11]、輻射處理[12-14]和氣調(diào)保鮮技術(shù)[15-16]?；瘜W(xué)保鮮技術(shù)主要包括：1-甲基環(huán)丙烯(1-MCP)處理[17-18]、涂膜保鮮[19-22]、熏蒸保鮮[23-24]、鈣處理[25]、植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑處理[26-27]和防腐殺菌劑處理[28]技術(shù)。鑒于番木瓜是典型的呼吸躍變型水果，具有成熟過(guò)程伴隨乙烯產(chǎn)生高峰，果實(shí)硬度急劇下降，從而使果實(shí)成熟[29]的特點(diǎn)，1-MCP 作為一種新型的高效乙烯抑制劑而備受關(guān)注。1-MCP可通過(guò)阻礙乙烯與受體結(jié)合，抑制果實(shí)生理生化反應(yīng)，從而達(dá)到延緩果實(shí)成熟衰老的目的。但長(zhǎng)期施用1-MCP 或處理不當(dāng)可導(dǎo)致番木瓜果實(shí)成熟障礙，即果實(shí)雖能正常黃變，但不能正常軟化，出現(xiàn)果實(shí)橡膠化、可食性差等弊端[18,30-31]。因此，產(chǎn)業(yè)急需自然延長(zhǎng)貯藏時(shí)間的新品種/系。通常，在果實(shí)成熟過(guò)程中伴隨著果實(shí)硬度的降低，而果實(shí)硬度與果實(shí)開裂、失水和病害防御密切相關(guān)，對(duì)果實(shí)的運(yùn)輸性、貯藏性和貨架期有著重要影響[32]，通常果實(shí)硬度較高的品種會(huì)有更長(zhǎng)的貯藏期。且已有研究表明果實(shí)硬度與乙烯信號(hào)途徑中的乙烯響應(yīng)因子(ERF)和轉(zhuǎn)錄因子(ETN3)密切相關(guān)[32-35]。因此，以延長(zhǎng)采后貯藏時(shí)間為目標(biāo)，利用現(xiàn)有番木瓜資源選育硬度高且品質(zhì)優(yōu)良的番木瓜品種，并進(jìn)行相關(guān)的機(jī)理研究具有重要意義。本團(tuán)隊(duì)前期利用‘泰國(guó)紅’和‘GZ201301301’番木瓜為親本進(jìn)行雜交，在F1代中篩選到‘黃花佑’和‘金錘’兩個(gè)優(yōu)系，兩者在果實(shí)硬度上差異顯著。為理清2 個(gè)遺傳背景完全一致的番木瓜優(yōu)系果實(shí)硬度差異的原因、果實(shí)硬度對(duì)番木瓜貯藏是否存在正面影響等科學(xué)問(wèn)題，本研究對(duì)‘黃花佑’和‘金錘’采后果實(shí)進(jìn)行了貯藏試驗(yàn)，測(cè)定、統(tǒng)計(jì)和分析了2個(gè)優(yōu)系在貯藏期的果實(shí)失水率、可溶性固形物含量、果實(shí)硬度、乙烯含量等指標(biāo)，并對(duì)2個(gè)優(yōu)系不同貯藏期的果實(shí)材料進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序和分析，初步明確了‘黃花佑’和‘金錘’果實(shí)硬度差異形成的原因及果實(shí)硬度對(duì)采后貯藏時(shí)間的影響，為番木瓜采后貯藏、品種選育和品質(zhì)調(diào)控提供了理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

‘黃花佑’和‘金錘’番木瓜為廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院果樹研究所以‘泰國(guó)紅’和‘GZ201301301’為親本，通過(guò)雜交育種獲得的兩個(gè)F1代優(yōu)系，‘黃花佑’和‘金錘’都已申報(bào)國(guó)家植物新品種權(quán)，申請(qǐng)?zhí)柗謩e為：20211000173，20221007022。‘黃花佑’具有品質(zhì)優(yōu)、豐產(chǎn)的特性，‘金錘’則具有果形好、硬度高、耐貯運(yùn)的特性，兩者在采后果實(shí)硬度上差異顯著。‘黃花佑’和‘金錘’番木瓜果實(shí)于商業(yè)成熟度（‘三線黃’）時(shí)采自廣東省廣州市白云區(qū)人和實(shí)驗(yàn)基地，隨即運(yùn)回廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院果樹研究所，用75%乙醇清洗，之后用ddH2O沖洗干凈，晾干后置于25℃室內(nèi)貯藏，并用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2 方法

1.2.1 果實(shí)硬度測(cè)試使用艾德堡數(shù)顯水果硬度計(jì)GY-4。從2個(gè)優(yōu)系中，分別挑選15個(gè)完好無(wú)損傷的果實(shí)進(jìn)行編號(hào)，之后在不同貯藏時(shí)間測(cè)定果實(shí)硬度，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.2 果實(shí)失水率測(cè)定采用稱重法。從2 個(gè)優(yōu)系中，分別挑選15個(gè)完好無(wú)損傷的果實(shí)進(jìn)行編號(hào)，之后稱首重，在采后第1、4、7、10、12 d分別再次稱重，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。失水率的計(jì)算見公式(1)。

1.2.3 果實(shí)可溶性固形物含量測(cè)定使用日本ATAGO PAL-1 數(shù)顯糖度計(jì)測(cè)定。每次測(cè)定10 個(gè)成熟度一致的果實(shí)，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.4 乙烯含量測(cè)定采用便攜式乙烯氣體分析儀-F-900測(cè)定。每個(gè)優(yōu)系每次取30個(gè)果實(shí)測(cè)定，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。計(jì)算見公式(2)。

1.2.5 石蠟切片制備和觀察取采后0、4、7、10 d的2個(gè)優(yōu)系果實(shí)，切取果實(shí)赤道部橫切面，用FAA 固定液固定。石蠟切片樣品制備及觀察參考梁社堅(jiān)等[36]的方法進(jìn)行。

1.2.6 乙烯利處理于商業(yè)熟度‘三線黃’時(shí)采摘‘金錘’果實(shí)，用75%乙醇清洗，之后用ddH2O沖洗干凈，晾干；配置乙烯利溶液，將果實(shí)浸泡3 min后取出，放入袋子中密封24 h后取出，室溫保存，之后觀察和統(tǒng)計(jì)果實(shí)軟化情況。對(duì)照果實(shí)不用乙烯利浸泡，每個(gè)處理選取10個(gè)果實(shí)，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序與分析

以采后0、4、7、10 d的‘黃花佑’和‘金錘’番木瓜果實(shí)為材料，委托美吉生物科技有限公司進(jìn)行高通量轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，測(cè)序平臺(tái)為Illumina HiSeq xten/NovaSeq 6000，每個(gè)樣品設(shè)置3 個(gè)重復(fù)。測(cè)序所得數(shù)據(jù)經(jīng)質(zhì)控后，使用Tophat2 軟件，與番木瓜參考基因組(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/?term=Carica papaya)進(jìn)行比對(duì)分析。以|log2 fold change|≧1、p-adjust<0.05為標(biāo)準(zhǔn)篩選差異表達(dá)基因(differentially expressed genes，DEGs)。對(duì)獲得的差異基因分別用Goatools(https://github.com/tanghaibao/Goatools) 和 KOBAS(http://kobas.cbi.pku.edu.cn/home.do) (http://kobas.cbi.pku.edu.cn/home.do)進(jìn)行KEGG富集通路分析，富集通路選擇前20條進(jìn)行展示。

1.4 乙烯途徑相關(guān)基因定量分析

使用與轉(zhuǎn)錄組實(shí)驗(yàn)相同的RNA，利用DNase I 去除基因組DNA，根據(jù)試劑盒說(shuō)明，用反轉(zhuǎn)錄酶將1 μg RNA 反轉(zhuǎn)錄成cDNA。以cDNA 為模板，用Applied Biosystems 7500 實(shí)時(shí)定量PCR 儀進(jìn)行qRT-PCR 試驗(yàn)。以真核翻譯起始因子4A(EIF4A)為內(nèi)參基因，對(duì)3個(gè)乙烯合成及信號(hào)相關(guān)的基因（CpACO、CpCTR1和CpETR1）進(jìn)行qRT-PCR檢測(cè)。利用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)引物（表1）。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，利用2-ΔΔCt方法計(jì)算基因相對(duì)表達(dá)量。

表1 實(shí)驗(yàn)所用引物

1.5 數(shù)據(jù)分析與圖像處理

利用Excel 2007 軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，利用Photoshop CS2軟件進(jìn)行圖像處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 ‘金錘’和‘黃花佑’番木瓜貯藏過(guò)程中的果實(shí)形態(tài)及內(nèi)部結(jié)構(gòu)變化

貯藏過(guò)程中，兩個(gè)番木瓜優(yōu)系在果實(shí)外觀形態(tài)和內(nèi)部結(jié)構(gòu)上都發(fā)生了一系列的變化。在剛采收時(shí)，‘黃花佑’和‘金錘’果實(shí)顏色較青、硬度較大，不適合食用（圖1-A，表2）。隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)，到第4天時(shí)，果實(shí)轉(zhuǎn)色，在貯藏第7 天時(shí)，‘黃花佑’果實(shí)幾乎全部轉(zhuǎn)黃，‘金錘’果實(shí)大部分轉(zhuǎn)黃，到貯藏第10 天時(shí)，‘黃花佑’果實(shí)全部轉(zhuǎn)黃且顏色加深，開始出現(xiàn)皺縮，而‘金錘’表面仍然光滑，到貯藏第12 天時(shí)，相較‘金錘’，‘黃花佑’出現(xiàn)明顯皺縮（圖1-A）。失水率實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示‘黃花佑’失水率比‘金錘’高，尤其在第7、10、12天更為明顯（圖1-B），與圖1-A 結(jié)果一致。從果肉切片結(jié)構(gòu)來(lái)看，在采后的0和第4天，‘黃花佑’和‘金錘’的果肉細(xì)胞排列緊密，大小均勻，在第7 天時(shí)，‘黃花佑’果肉細(xì)胞開始膨大，果實(shí)已經(jīng)變軟，而‘金錘’果肉細(xì)胞依然比較緊密，到第10 天時(shí)，‘黃花佑’果肉細(xì)胞破損，而‘金錘’果肉細(xì)胞依然完好（圖1-C）。

圖1 兩個(gè)番木瓜優(yōu)系貯藏期間果實(shí)形態(tài)(A)、失水率(B)及內(nèi)部結(jié)構(gòu)的變化(C)

表2 ‘金錘’和‘黃花佑’貯藏期間的果實(shí)硬度和可溶性固形物含量比較

綜上，在采后貯藏尤其是貯藏后期，‘黃花佑’失水率高于‘金錘’番木瓜，出現(xiàn)皺皮的時(shí)間也比‘金錘’早，且‘金錘’的果肉細(xì)胞結(jié)構(gòu)在貯藏后期比‘黃花佑’致密。說(shuō)明番木瓜果實(shí)硬度與果肉細(xì)胞結(jié)構(gòu)密切相關(guān)。

2.2 ‘金錘’和‘黃花佑’貯藏過(guò)程中的果實(shí)硬度及品質(zhì)變化

在整個(gè)貯藏過(guò)程中，‘金錘’和‘黃花佑’果實(shí)的硬度是持續(xù)下降的。但相較‘黃花佑’，‘金錘’在采后始終保持較高的硬度。結(jié)果如表2所示，‘金錘’和‘黃花佑’剛采摘下來(lái)時(shí)的硬度基本一致，約為41 N，果實(shí)硬度大，沒有測(cè)定可溶性固形物含量。在貯藏第4天時(shí)，‘金錘’硬度為34.03 N，而‘黃花佑’硬度僅有其一半，為15.54 N，此時(shí)‘金錘’的可溶性固形物含量為9.35%，而‘黃花佑’的可溶性固形物含量達(dá)到12.10%，‘黃花佑’處于食用較佳時(shí)期。在貯藏第7天時(shí)，‘金錘’硬度為22.89 N，可溶性固形物含量為11.70%，而‘黃花佑’此時(shí)硬度為9.21 N，果實(shí)處于較軟狀態(tài)，可溶性固形物含量為12.80%，‘黃花佑’仍然處于較好的食用時(shí)期。到貯藏第10天時(shí)，‘金錘’硬度為16.13 N，可溶性固形物含量隨著果實(shí)變軟增加到12.14%，比較適合食用。而‘黃花佑’此時(shí)硬度只有3.26 N，可溶性固形物只有10.55%，果實(shí)過(guò)熟，已不太適合食用。到貯藏第12天時(shí)，‘金錘’硬度為10.03 N，可溶性固形物含量增加到12.15%，適合食用。而‘黃花佑’此時(shí)硬度只有2.12 N，可溶性固形物含量只有9.86%，過(guò)熟不適合食用。這一結(jié)果與果肉切片觀察到的果實(shí)細(xì)胞結(jié)構(gòu)變化結(jié)果是一致的（圖1-C）。綜上，‘金錘’在采后貯藏12 d內(nèi)的任何時(shí)間點(diǎn)硬度都比‘黃花佑’高，分別高出2～5倍，在采后貯藏時(shí)間上有明顯優(yōu)勢(shì)。

同時(shí)，由表2可知，‘黃花佑’果實(shí)可溶性固形物在采后第4天即達(dá)到較高水平，在貯藏第7天達(dá)到峰值，而‘金錘’果實(shí)可溶性固形物在采后第10～12天達(dá)到峰值，且兩者的可溶性固形物含量都能達(dá)到12.0%以上，因此本研究認(rèn)為‘金錘’和‘黃花佑’都具有較好的果實(shí)品質(zhì)。

2.3 不同貯藏時(shí)期番木瓜果實(shí)的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析

根據(jù)‘金錘’和‘黃花佑’采后果實(shí)貯藏特點(diǎn)，本研究在‘金錘’和‘黃花佑’采后貯藏0、4、7、10 d果實(shí)的相同部位取樣進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，測(cè)序數(shù)據(jù)經(jīng)過(guò)濾后得到162.25 G 的純凈數(shù)據(jù)，各樣品Clean Data 均達(dá)到6.01 Gb 以上，Q30 堿基百分比在92.58%以上，數(shù)據(jù)質(zhì)量符合轉(zhuǎn)錄組分析的基本要求。通過(guò)分析，發(fā)現(xiàn)‘金錘’和‘黃花佑’相比，在采后0 d時(shí)，共有4163個(gè)差異表達(dá)基因(differentially expressed genes，DEGs)，其中1518 個(gè)上調(diào)表達(dá)，2645 個(gè)下調(diào)表達(dá)，在采后貯藏4 d 時(shí)，共有4977 個(gè)DEGs，其中2026 個(gè)上調(diào)表達(dá)，2951 個(gè)下調(diào)表達(dá)，在貯藏7 d時(shí)，共有2896個(gè)DEGs，其中925個(gè)上調(diào)表達(dá)，1971 個(gè)下調(diào)表達(dá)，在貯藏10 d 時(shí)，共有5795 個(gè)DEGs，其中3021個(gè)上調(diào)表達(dá)，2774個(gè)下調(diào)表達(dá)（表3）。

進(jìn)一步對(duì)DEGs進(jìn)行KEGG通路分析，結(jié)果顯示，‘金錘’和‘黃花佑’果實(shí)的大量差異表達(dá)基因在植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑顯著富集，尤其是在貯藏的第4天（圖2）。乙烯是植物中最重要的激素之一，它推動(dòng)果實(shí)成熟，因此，應(yīng)重點(diǎn)關(guān)注和分析乙烯信號(hào)途徑。分析結(jié)果如圖3所示：在貯藏0 d時(shí)，相較‘金錘’，‘黃花佑’中協(xié)同負(fù)調(diào)控乙烯反應(yīng)的乙烯受體基因ETR(Ethylene receptor)和蛋白激酶基因CTR1(Constitutive triple response 1)的表達(dá)量要低，在貯藏第4 天時(shí)，除ETR和CTR1基因外，‘黃花佑’中負(fù)調(diào)控乙烯下游途徑關(guān)鍵因子EIN3(Ethylene insensitive 3) 穩(wěn)定性的EBF1/2(EIN3-binding F box protein 1/2)基因的表達(dá)量也比‘金錘’低，而‘黃花佑’中乙烯響應(yīng)因子ERF/2的表達(dá)量高于‘金錘’，暗示‘黃花佑’在貯藏4 d時(shí)可能已經(jīng)啟動(dòng)了乙烯反應(yīng)，而‘金錘’中的乙烯信號(hào)被抑制。當(dāng)貯藏時(shí)間為7 d時(shí)，‘黃花佑’中ETR基因的表達(dá)依然低于‘金錘’，而ERF2的表達(dá)量高于‘金錘’，乙烯信號(hào)依然處于激活狀態(tài)。這一結(jié)果與‘黃花佑’果實(shí)硬度和可食用時(shí)間在貯藏的第4～7天是一致的。而當(dāng)貯藏時(shí)間延長(zhǎng)到10 d時(shí)，相較‘黃花佑’，‘金錘’中的ETR和CTR1表達(dá)量變低，EBF1/2表達(dá)量升高，乙烯信號(hào)下游基因ERF1/2表達(dá)量上調(diào)，暗示此時(shí)‘金錘’的乙烯信號(hào)通路打開，果實(shí)成熟，這與‘金錘’硬度和最佳食用時(shí)間在貯藏第10～12天也是相符的（圖3）。

圖2 ‘黃花佑’和‘金錘’番木瓜采后貯藏4 d時(shí)果實(shí)差異表達(dá)基因的KEGG富集分析

圖3 ‘黃花佑’和‘金錘’番木瓜采后果實(shí)乙烯信號(hào)途徑相關(guān)基因的表達(dá)差異

同時(shí)，本研究對(duì)‘黃花佑’和‘金錘’中與乙烯合成及信號(hào)途徑相關(guān)的關(guān)鍵基因進(jìn)行聚類熱圖分析，結(jié)果如圖4 所示，‘黃花佑’和‘金錘’在不同貯藏時(shí)間點(diǎn)的ETR1、CTR1、EBF1/2和ERF2表達(dá)情況與KEGG 分析結(jié)果完全一致。已有研究表明：番木瓜果實(shí)成熟時(shí)，乙烯合成關(guān)鍵基因1-氨基環(huán)丙烷-1-羧酸(ACC)合酶ACS1基因和ACC氧化酶ACO1基因表達(dá)上調(diào)，觸發(fā)乙烯生物合成，乙烯爆發(fā)發(fā)生在收獲后的3～4 d，并誘導(dǎo)果膠酶表達(dá)[7]。因此，本研究也對(duì)‘黃花佑’和‘金錘’果實(shí)中的ACO和ACS進(jìn)行了聚類熱圖分析，結(jié)果顯示其中一個(gè)ACO基因(gene 4917)在‘黃花佑’貯藏第4天時(shí)高表達(dá)，之后下降，而該基因在‘金錘’貯藏第7天時(shí)才高表達(dá)，之后下降。另一個(gè)ACO1(gene 19882)基因在‘黃花佑’貯藏第4天時(shí)高表達(dá)，之后下降，在‘金錘’貯藏的第4 天該基因的表達(dá)量也升高，但是表達(dá)強(qiáng)度低于‘黃花佑’。ACS基因在‘黃花佑’貯藏的0 d 時(shí)就高表達(dá)，之后下降，而‘金錘’在貯藏的第10 天該基因才高表達(dá)。以上結(jié)果暗示‘黃花佑’番木瓜采后果實(shí)乙烯的合成早于‘金錘’，呼吸躍變及信號(hào)的啟動(dòng)也早于‘金錘’，這可能是兩者硬度、貯藏時(shí)間差異的主要原因。

圖4 ‘黃花佑’和‘金錘’番木瓜采后果實(shí)乙烯合成及信號(hào)途徑差異表達(dá)基因的聚類熱圖分析

2.4 ‘黃花佑’和‘金錘’中乙烯信號(hào)途徑關(guān)鍵基因的表達(dá)情況及乙烯含量的測(cè)定分析

為了驗(yàn)證轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的可靠性，本研究利用qRTPCR 檢測(cè)了乙烯合成和信號(hào)途徑中的3 個(gè)關(guān)鍵基因，ACO1、CTR1和ETR1在兩個(gè)番木瓜優(yōu)系貯藏期間的表達(dá)量變化（圖5），結(jié)果與轉(zhuǎn)錄組結(jié)果（圖3、圖4）一致，說(shuō)明轉(zhuǎn)錄組結(jié)果是可靠的，同時(shí)也說(shuō)明‘金錘’番木瓜乙烯合成及信號(hào)啟動(dòng)的時(shí)間要比‘黃花佑’晚。

圖5 qRT-PCR檢測(cè)乙烯合成和信號(hào)途徑3個(gè)關(guān)鍵基因在‘黃花佑’和‘金錘’番木瓜中的表達(dá)情況

為了進(jìn)一步確定以上結(jié)果，對(duì)采后不同貯藏時(shí)間點(diǎn)的‘黃花佑’和‘金錘’番木瓜進(jìn)行了乙烯含量測(cè)定，結(jié)果如圖6所示，‘黃花佑’在采后貯藏第4天時(shí)乙烯釋放量達(dá)到峰值，之后開始迅速下降；而‘金錘’在采后貯藏第8天時(shí)乙烯釋放量達(dá)到峰值，第10天略有下降，但仍然保持較高水平。這一結(jié)果與筆者檢測(cè)的乙烯相關(guān)基因的表達(dá)模式基本一致。

2.5 乙烯對(duì)‘金錘’番木瓜果實(shí)硬度的影響

為了進(jìn)一步明確乙烯的釋放影響了‘金錘’的果實(shí)硬度和貯藏時(shí)間，對(duì)采后‘金錘’果實(shí)進(jìn)行乙烯利處理，結(jié)果發(fā)現(xiàn)乙烯利處理4 d時(shí)，‘金錘’果實(shí)硬度可由剛采摘下時(shí)的40.34 N 降低到11.32 N，此時(shí)‘金錘’的可溶性固形物含量也有10.80，而未經(jīng)乙烯處理的‘金錘’此時(shí)硬度為36.18 N（圖7，表2）。這一結(jié)果表明，人為添加乙烯利可以顯著降低‘金錘’的果實(shí)硬度，促進(jìn)其成熟達(dá)到可食程度。

圖7 乙烯利處理對(duì)‘金錘’果實(shí)硬度的影響

3 討論

果實(shí)硬度在果實(shí)開裂、失水和病害中起著重要作用，對(duì)果實(shí)的運(yùn)輸性、貯藏性和貨架期有著強(qiáng)烈的影響[32]。通常果實(shí)硬度較高的品種會(huì)有更長(zhǎng)的貯藏期。本團(tuán)隊(duì)前期通過(guò)雜交育種，選育出2 個(gè)品質(zhì)較好的番木瓜優(yōu)系：‘黃花佑’和‘金錘’。值得一提的是，‘金錘’在采后成熟過(guò)程中硬度較大、貯藏期長(zhǎng)，是實(shí)現(xiàn)番木瓜長(zhǎng)距離運(yùn)輸?shù)臐摿ζ贩N。

明確同一遺傳背景下兩個(gè)番木瓜優(yōu)系果實(shí)硬度差異的原因，可為其在生產(chǎn)上更好的應(yīng)用提供數(shù)據(jù)支持。因此，本研究對(duì)‘黃花佑’和‘金錘’貯藏期的品質(zhì)、貯藏特性和轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)分別進(jìn)行了觀察、統(tǒng)計(jì)和分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在采后貯藏尤其是貯藏后期，‘黃花佑’失水率高于‘金錘’，出現(xiàn)皺皮的時(shí)間也比‘金錘’早?！疱N’番木瓜果肉細(xì)胞比‘黃花佑’更加致密。之前有研究利用2 個(gè)不同硬度的蘋果品種，進(jìn)行果皮電鏡結(jié)構(gòu)掃描分析，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞結(jié)構(gòu)規(guī)則、排列致密、完整性好的品種，果實(shí)硬度更高[37]。另外也有研究用采后緩慢軟化和快速軟化的蘋果品種進(jìn)行果肉細(xì)胞電鏡掃描分析，也得到類似結(jié)果[38]。本研究與前人的這兩個(gè)研究結(jié)果一致，同時(shí)也說(shuō)明番木瓜果實(shí)硬度與果肉細(xì)胞結(jié)構(gòu)密切相關(guān)。

‘黃花佑’和‘金錘’采后果實(shí)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析顯示，2 個(gè)優(yōu)系在乙烯信號(hào)途徑存在明顯差異。乙烯是植物中最重要的激素之一，它推動(dòng)果實(shí)成熟。呼吸躍變型果實(shí)的成熟過(guò)程伴隨著乙烯峰值的生成，從而導(dǎo)致果實(shí)硬度降低，果實(shí)軟化成熟[29]。已有研究表明果實(shí)硬度與乙烯信號(hào)途徑中的乙烯響應(yīng)因子(ERF1)和轉(zhuǎn)錄因子(ETN3)密切相關(guān)[32-35]。番木瓜作為一種典型的呼吸躍變型水果，它快速成熟也是由乙烯生物合成觸發(fā)的。有研究表明，番木瓜果實(shí)成熟時(shí)，乙烯合成關(guān)鍵基因ACS1和ACO1表達(dá)上調(diào)，觸發(fā)乙烯生物合成。乙烯爆發(fā)發(fā)生在收獲后3～4 d，并誘導(dǎo)果膠酶表達(dá)[7]。本研究利用聚類熱圖分析了ACO基因的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)‘黃花佑’中ACO表達(dá)的峰值出現(xiàn)在采后貯藏第4 天，且此時(shí)的‘黃花佑’果實(shí)也達(dá)到了可食程度，與前人的研究結(jié)果一致。而在果實(shí)軟化緩慢的‘金錘’番木瓜中，ACO基因的表達(dá)峰值在貯藏后第7天，說(shuō)明‘金錘’乙烯釋放的峰值要晚于‘黃花佑’，呼吸躍變的時(shí)間也相應(yīng)的推遲。而ACS基因在‘黃花佑’貯藏的0 d 就高表達(dá)，之后下降，而在‘金錘’貯藏的第10 天才高表達(dá)，雖然這與之前報(bào)道的乙烯爆發(fā)發(fā)生在收獲后3～4 d 不一致，但這可能與番木瓜品種、采收時(shí)的成熟度、貯藏條件等因素差異有關(guān)。同時(shí)，從表達(dá)模式上看，‘金錘’ACS基因高表達(dá)的時(shí)間晚于‘黃花佑’，乙烯達(dá)到峰值的時(shí)間也就晚于‘黃花佑’，這與‘黃花佑’成熟快，‘金錘’軟化慢也是相吻合的。另外，本研究還利用qRT-PCR 檢測(cè)了乙烯途徑中另外兩個(gè)重要的負(fù)調(diào)控因子CTR1和ETR1基因的表達(dá)情況，結(jié)果顯示在采后貯藏4 d時(shí)，‘黃花佑’中這兩個(gè)基因的表達(dá)量要低于‘金錘’，說(shuō)明‘黃花佑’中此時(shí)可能已啟動(dòng)乙烯反應(yīng)。進(jìn)一步的乙烯含量檢測(cè)結(jié)果也顯示‘金錘’番木瓜采后果實(shí)乙烯釋放量達(dá)到峰值的時(shí)間比‘黃花佑’延后，驗(yàn)證了上述結(jié)果。綜上結(jié)果表明：‘金錘’果實(shí)硬度高，軟化慢的原因與乙烯信號(hào)途徑直接相關(guān)。

同時(shí)，為了驗(yàn)證上述結(jié)果，本研究利用乙烯利處理‘金錘’采后果實(shí)，處理4 d后，‘金錘’的果實(shí)軟化，可溶性固形物含量升高，達(dá)到可食狀態(tài)，說(shuō)明‘金錘’的果實(shí)硬度直接與乙烯相關(guān)。綜合以上結(jié)果，筆者認(rèn)為：‘黃花佑’鮮果宜在采后一周內(nèi)完成銷售，‘金錘’可延長(zhǎng)至12 d 以上。有意思的是，‘金錘’番木瓜可通過(guò)施用乙烯利人為控制成熟時(shí)間，具有更好的利用價(jià)值和市場(chǎng)潛力，同時(shí)也可作為品種改良的重要親本資源。在本研究中，使用的貯藏條件為常溫，并沒有設(shè)置溫度梯度、濕度等更多的影響因素，后續(xù)將對(duì)這些條件進(jìn)行細(xì)化，并明確這些條件對(duì)‘黃花佑’和‘金錘’品質(zhì)和貯藏時(shí)間的影響，同時(shí)進(jìn)行更為深入的機(jī)理研究，為在生產(chǎn)上更好的利用這些優(yōu)系提供更多的數(shù)據(jù)支持，為番木瓜采后品質(zhì)調(diào)控、貯藏和保鮮提供新思路。

4 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)得出，‘黃花佑’和‘金錘’果實(shí)可溶性固形物含量都可以達(dá)到12.0以上，兩者均具有較好的果實(shí)品質(zhì)。與‘黃花佑’相比，‘金錘’在貯藏期間果實(shí)硬度高、失水率低、果實(shí)軟化慢、在使用乙烯利處理后能迅速軟化，且品質(zhì)基本不變?！S花佑’和‘金錘’番木瓜果實(shí)硬度的差異與乙烯合成及信號(hào)途徑密切相關(guān)，‘黃花佑’采后果實(shí)乙烯的合成及信號(hào)啟動(dòng)都早于‘金錘’，促使‘黃花佑’果實(shí)軟化、成熟。‘黃花佑’鮮果宜在采后一周內(nèi)完成銷售，‘金錘’可延長(zhǎng)至采后12 d以上。