布鑫榮, 楊雪, 王守軍, 王玉嬌, 王文星, 張麗*

1(甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院,甘肅 蘭州,730070)2(臨洮縣畜牧獸醫(yī)技術(shù)服務(wù)中心,甘肅 定西,730500)

牦牛是高寒缺氧地區(qū)的特有畜種,其肉質(zhì)營(yíng)養(yǎng)豐富,具有高蛋白、低脂肪等特點(diǎn)。然而,牦牛肉肌纖維較粗,嫩度較差,導(dǎo)致其食用及加工受限[1]。宰后成熟過程肌肉內(nèi)部發(fā)生各種復(fù)雜生理生化反應(yīng)(如糖酵解[2]、肌肉收縮[3]、細(xì)胞凋亡[1]、蛋白質(zhì)降解[4])導(dǎo)致肌肉品質(zhì)(嫩度[5]、保水性和顏色[6])發(fā)生改變,動(dòng)物胴體逐漸由肌肉轉(zhuǎn)變成肉,有效改善了肌肉品質(zhì)[7]。

在這個(gè)生化過程中,活性氧(reactive oxygen species, ROS)自由基引發(fā)的蛋白質(zhì)氧化所形成的羰基及衍生物與肌肉品質(zhì)高度相關(guān)[8],活性氮(reactive nitrogen species,RNS)自由基同樣可以與ROS自由基、蛋白質(zhì)和其他物質(zhì)的巰基反應(yīng),并參與肌肉品質(zhì)調(diào)節(jié)[9]。研究表明,動(dòng)物屠宰后,缺氧、缺血的環(huán)境導(dǎo)致肌肉內(nèi)部ROS含量增加,從而加速蛋白氧化[7];此外,宰后動(dòng)物體內(nèi)的抗氧化能力下降,無法及時(shí)清除外界氧化應(yīng)激因子,肌肉氧化應(yīng)激水平逐漸升高,最終影響肌肉品質(zhì)[10]。ROS是細(xì)胞代謝過程中由氧直接或間接轉(zhuǎn)變而成的氧自由基(單線態(tài)氧、超氧陰離子和羥自由基等)和具有反應(yīng)氧功能的基團(tuán)(H2O2、HClO4、氫過氧化物等)[6]。ROS通過影響蛋白質(zhì)氨基酸殘基、肽鍵,使蛋白質(zhì)氧化,導(dǎo)致其結(jié)構(gòu)和功能特性改變,最終影響肌肉品質(zhì)[11]。已有研究表明,蛋白氧化會(huì)影響肉類質(zhì)構(gòu)特性,例如二硫鍵和席夫堿的產(chǎn)生會(huì)增加肉的硬度[12];氧化也會(huì)導(dǎo)致部分疏水性殘基的暴露,降低蛋白質(zhì)水合力,導(dǎo)致肌肉保水性降低[13];同時(shí)肌紅蛋白的氧化還會(huì)造成肌肉肉色改變[6]。除ROS自由基外,在肉類加工和貯藏過程中RNS也可以誘發(fā)蛋白氧化[14]。其中,NO是RNS的主要組成物質(zhì)[15],它通過一氧化氮合酶(nitric oxide synthase,NOS)的激活來應(yīng)對(duì)缺氧/缺血引起的不良反應(yīng),通過與蛋白質(zhì)、鐵離子、ROS自由基和其他物質(zhì)的巰基反應(yīng),調(diào)節(jié)許多生化過程(如碳代謝、肌肉收縮和細(xì)胞凋亡)[9]。值得注意的是,蛋白質(zhì)亞硝化,即NO與蛋白質(zhì)半胱氨酸的巰基的共價(jià)鍵形成S-亞硝硫醇(S-nitrosothiols,SNO),已被證明參與了肌肉到肉類的轉(zhuǎn)化過程[16]。據(jù)報(bào)道,使用NO供體和NOS抑制劑調(diào)節(jié)屠宰前和屠宰后肌肉細(xì)胞中NO水平,可影響牛肉、雞肉、豬肉和羊肉等動(dòng)物的嫩度、顏色和保水性等品質(zhì)屬性[5, 17]。盡管在低氧損傷過程中ROS和NO介導(dǎo)的肌肉品質(zhì)調(diào)控機(jī)制已知,但支持氧化應(yīng)激兩個(gè)下游事件之間的串?dāng)_與肌肉品質(zhì)調(diào)控之間的關(guān)系的研究仍較有限,即關(guān)于蛋白質(zhì)氧化(由羰基引起;CO自由基)和蛋白質(zhì)亞硝基化(由NO/過氧亞硝酸根引起;ONOO自由基)在調(diào)控牦牛肉品質(zhì)特性的相互作用的研究尚未見報(bào)道。

本實(shí)驗(yàn)通過使用ROS促進(jìn)劑(H2O2)和ROS抑制劑[N-乙酰半胱氨酸(N-acetylcysteine,NAC)]與NO供體[S-亞硝基-L-谷胱甘肽(S-nitroso-L-glutathione, GSNO)]和NO抑制劑[N-硝基-L-精氨酸甲酯鹽酸鹽(N-nitro-L-arginine methyl ester hydrochloride,L-NAME)]分組組合對(duì)宰后牦牛肉進(jìn)行處理,模擬牦牛宰后自然成熟過程,評(píng)估蛋白質(zhì)氧化和亞硝化之間的串?dāng)_影響牦牛肉食用品質(zhì)的可能機(jī)制,為牦牛肉品質(zhì)提高提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

本試驗(yàn)選用甘肅省天祝藏族自治州3～4歲[體重約(300±50) kg]、健康無病的公牦牛6頭。在商業(yè)屠宰廠屠宰后,于30 min內(nèi)取背最長(zhǎng)肌(第12胸椎至第5腰椎),剔除表面筋膜、脂肪,切成100 g大小的肉塊。隨機(jī)分為6份。W:對(duì)照組1(切割后立即用液氮速凍);A:對(duì)照組2[0.9%(質(zhì)量分?jǐn)?shù),下同)NaCl];B:ROS促進(jìn)組+RNS促進(jìn)組(0.9% NaCl、20 mmol/L H2O2);C:ROS促進(jìn)組+RNS抑制組(20 mmol/L H2O2、0.1 mol/L L-NAME、0.9% NaCl);D:ROS抑制組+RNS促進(jìn)組[20 mmol/L NAC、200 μmol/L GSNO,0.9% NaCl]; E:ROS抑制組+RNS抑制組(20 mmol/L NAC、0.1 mol/LL-NAME、0.9% NaCl],注射比例為1∶1(g∶mL),4 ℃成熟12、24、72、120、168 h后取樣,測(cè)定相關(guān)品質(zhì)指標(biāo),剩余肉樣用鋁箔紙包裹,-80 ℃保存待用。

GSNO、L-NAME,上海源葉生物科技有限公司;H2O2、NAC,北京索萊寶科技有限公司;K2HPO4、KH2PO4、NaCl均為分析純,天津市光復(fù)科技發(fā)展有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

TGL-16PC臺(tái)式高速冷凍離心機(jī),湖南湘儀集團(tuán);PHS-3 C型pH計(jì),上海虹益儀器儀表有限公司;SP-756P紫外-可見分光光度計(jì),上海美譜達(dá)儀器有限公司;C-LM4數(shù)顯式肌肉嫩度儀,東北農(nóng)業(yè)大學(xué)工程學(xué)院;TA.XT Express質(zhì)構(gòu)儀,英國(guó)Stable Micro Systems公司;JEM-1400FLASH透射電子顯微鏡,日本日立公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 食用品質(zhì)的測(cè)定

1)pH值:參考陳煉紅等[7]的方法并稍作修改。采用pH計(jì)測(cè)定。

2)肉色:參照劉佳東[18]的方法,利用色差儀測(cè)定。在每個(gè)處理組肉樣中隨機(jī)選取3個(gè)不同位置,測(cè)定亮度(L*)值、紅度(a*)值、黃度(b*)值。結(jié)果以3組的平均數(shù)計(jì)。

3)蒸煮損失:參照張朝陽[19]的方法并稍作修改,將肉切成約6 cm×3 cm×3 cm的肉塊(約100 g)。取上述肉樣稱重,記作m1,置于蒸煮袋中,水浴加熱,待肉樣中心溫度達(dá)75 ℃時(shí),持續(xù)加熱30 min后取出肉樣,冷卻至室溫再次稱重,記作m2。按公式(1)計(jì)算:

(1)

4)剪切力:參照NY/T 1180—2006《肉嫩度的測(cè)定 剪切力測(cè)定法》,利用嫩度儀進(jìn)行測(cè)定。取蒸煮損失試驗(yàn)中煮熟的肉樣,濾紙吸去表面水分后冷卻至室溫,取樣器(直徑1.27 cm)沿著肌纖維方向鉆取3個(gè)肉柱,使用嫩度儀對(duì)每個(gè)樣品進(jìn)行剪切,肌纖維的長(zhǎng)軸與刀片垂直。

5)質(zhì)構(gòu)特性:參考HERRERO等[20]的方法,采用物性測(cè)試儀進(jìn)行分析。測(cè)試條件為測(cè)前速度4.0 mm/s,測(cè)試速度6.0 mm/s,測(cè)后速度6.0 mm/s,目標(biāo)模式strain,壓縮比例40%,停留時(shí)間5.0 s,觸發(fā)力5 g,探頭類型:P/50探頭。將肉樣切成 1 cm×1 cm×1 cm,選擇硬度、彈性、膠著性、黏聚性、咀嚼性和回復(fù)性為分析指標(biāo)。進(jìn)行6次平行測(cè)定,結(jié)果用平均值表示。

1.3.2 肌肉微觀結(jié)構(gòu)的測(cè)定

1)肌原纖維小片化指數(shù)(myofibril fragmentation index,MFI):參照王琳琳[1]的方法進(jìn)行測(cè)定。

2)微觀結(jié)構(gòu):參照HOU等[5]的方法,將肉樣沿肌纖維方向切成0.5 mm×0.5 mm× 0.5 mm的小塊,用體積分?jǐn)?shù)為3%的戊二醛溶液固定7 d(每隔1 d更換1次固定液),再用體積分?jǐn)?shù)為2%鋨酸固定,之后依次用體積分?jǐn)?shù)為50%、70%、80%、90%和100%乙醇脫水,然后用1∶1(g∶mL)丙酮樹脂包埋,4～5 h后將樣品轉(zhuǎn)移至純包埋液中,室溫可過夜。然后修整包埋塊,超薄切片,之后在透射電子顯微鏡下觀察肌纖維,放大倍數(shù)為12 000倍。

1.4 數(shù)據(jù)分析

利用Excel 2019對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行平均值和標(biāo)準(zhǔn)差分析,采用SPSS 21.0進(jìn)行Duncan’s多重檢驗(yàn)(P<0.05),數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示,并運(yùn)用Origin 2021進(jìn)行相關(guān)性和主成分分析及作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 pH值

如圖1所示,各處理組pH值均呈先降低后增大的趨勢(shì),且均在成熟的第72 h達(dá)到極限值,這可能是因?yàn)樵缀? h動(dòng)物體內(nèi)的高度缺氧導(dǎo)致糖原進(jìn)行無氧糖酵解產(chǎn)生乳酸及ATP分解產(chǎn)生磷酸而導(dǎo)致肌肉pH的下降[7],而隨著成熟的進(jìn)行,當(dāng)肉樣pH值達(dá)到極限值時(shí),肌質(zhì)網(wǎng)釋放Ca2+,激活鈣蛋白酶,分解肌間蛋白質(zhì),這一過程中產(chǎn)生的堿性物質(zhì)使肉的pH值增大[18]。此外,同一成熟時(shí)間(除0 h),不同處理組之間pH值差異顯著(P<0.05)。在成熟的第12～168 h時(shí),各處理組的pH值大小依次為:ROS抑制組+RNS促進(jìn)組>ROS抑制組+RNS抑制組>對(duì)照組2>ROS促進(jìn)組+RNS促進(jìn)組>ROS促進(jìn)組+RNS抑制組。即抑制ROS的同時(shí)激活或抑制RNS能夠增加牦牛肉的pH值,而激活ROS的同時(shí)促進(jìn)或抑制RNS可降低pH值,說明與對(duì)照組相比,抑制ROS的同時(shí)激活或抑制RNS均有利于pH值的增大;而在激活ROS的同時(shí)促進(jìn)或抑制RNS,pH值顯著降低;同時(shí)結(jié)果也顯示高/低RNS條件下激活ROS,pH值降低;高/低氧條件下,激活RNS可使pH值顯著增大。以上結(jié)果表明,減少NO或增加ROS的產(chǎn)生能夠降低樣品最終pH值,張朝陽[19]和WANG等[21]研究也發(fā)現(xiàn),抑制NO的生成可顯著降低牛肉pH值(P<0.05),這與本試驗(yàn)結(jié)果相一致。

2.2 肉色

由圖2-a可知,各處理組牦牛肉的L*值基本呈先升高后降低的趨勢(shì),這可能是由于宰后成熟期間,肌肉內(nèi)的水分大量流出,并聚集在肉表面,增強(qiáng)光反射能力,使L*值增加[18],而成熟后期,肌肉中的肌紅蛋白被氧化為高鐵肌紅蛋白,導(dǎo)致脫氧肌紅蛋白數(shù)量減少,進(jìn)而導(dǎo)致亮度值維持一個(gè)較低的水平[6]。此外,同一成熟時(shí)間不同處理組之間牦牛肉L*值也存在顯著差異(P<0.05),在成熟的第12～168 h,ROS促進(jìn)組+RNS抑制組的L*值顯著低于對(duì)照組2(P<0.05),表明與對(duì)照組相比,在促進(jìn)ROS的同時(shí)抑制RNS可使牦牛肉L*值降低;此外,ROS促進(jìn)組+RNS促進(jìn)組的L*值顯著高于ROS促進(jìn)組+RNS抑制組,該結(jié)果表明,高氧條件下抑制RNS可使L*值顯著降低(P<0.05),這可能是因?yàn)橐种芅O或促進(jìn)ROS的生成導(dǎo)致氧化肌紅蛋白含量減少[6]。此外,整個(gè)成熟期間,各處理組L*值變化不一致,推測(cè)可能與ROS、RNS的串?dāng)_作用和肌肉pH值有關(guān)[6,18]。

a-L*;b-a*;c-b*圖2 宰后RNS與ROS串?dāng)_對(duì)牦牛肉L*、a*和b*的影響Fig.2 Effect of crosstalk of RNS and ROS on L*, a*, and b* values of yak meat during postmortem

由圖2-b可知,各處理組牦牛肉的a*值均顯著下降(P<0.05),這可能是因?yàn)樵缀蟪墒炱陂g肌紅蛋白逐漸被氧化為高鐵肌紅蛋白,積累的高鐵肌紅蛋白使a*值顯著下降[22]。同一成熟時(shí)間不同處理組間牦牛肉a*值也存在顯著差異(P<0.05),在成熟的第12～168 h,各處理組a*值大小依次為:ROS促進(jìn)組+RNS促進(jìn)組>對(duì)照組2>ROS抑制組+RNS促進(jìn)組>ROS促進(jìn)組+RNS抑制組>ROS抑制組+RNS抑制組,結(jié)果表明與對(duì)照組相比,同時(shí)激活ROS和RNS,a*值顯著增加,而在激活或抑制ROS的同時(shí)抑制RNS,a*值顯著降低;此外,結(jié)果也表明,高/低氧條件下,激活RNS可使a*值顯著再增加,這可能是由于宰后氧化程度越高,則易生成鮮紅色的氧合肌紅蛋白,肉的色澤越好;反之,肉的色澤越差[18]。

由圖2-c可知,在成熟的第12～168 h,不同處理組牦牛肉的b*值整體呈升高的趨勢(shì),且b*值在成熟期間各處理組未呈現(xiàn)出一定的規(guī)律。

綜上,與對(duì)照組相比,在促進(jìn)ROS的同時(shí)抑制RNS可使牦牛肉L*值、a*值顯著降低,而同時(shí)激活ROS和RNS,a*值顯著增加;此外,高氧/低氧條件下激活RNS,a*值顯著增加,高氧條件下抑制RNS可顯著降低L*值。

2.3 蒸煮損失

由圖3可知,隨成熟時(shí)間的延長(zhǎng),各處理組牦牛肉的蒸煮損失基本上呈先增加后降低的趨勢(shì),且在成熟的第72 h時(shí),蒸煮損失達(dá)到最大值。這可能是因?yàn)樵缀蟪跗?肌肉迅速進(jìn)入缺氧狀態(tài),導(dǎo)致肌肉內(nèi)部糖原進(jìn)行無氧糖酵解產(chǎn)生大量乳酸而降低pH值,pH下降至接近于蛋白質(zhì)等電點(diǎn)時(shí),蛋白質(zhì)之間相互作用產(chǎn)生沉淀,從而減弱對(duì)水分的結(jié)合力,造成肌肉水分流失,使保水性降低,蒸煮損失增加[23];而隨著成熟時(shí)間的延長(zhǎng),肌肉中肌原纖維及骨架蛋白被逐漸分解,吸收K+、釋放Ca2+導(dǎo)致離子凈電荷增加,滲透壓增加,結(jié)合水的能力增加,蒸煮損失逐漸降低[24]。此外,同一成熟時(shí)間(除0 h),不同處理組之間蒸煮損失也存在顯著差異,其中,在成熟的第24～120 h時(shí),ROS促進(jìn)組+RNS促進(jìn)組的蒸煮損失顯著高于ROS促進(jìn)組+RNS抑制組和對(duì)照組2(空白)(P<0.05);同時(shí),對(duì)照組蒸煮損失也顯著高于ROS抑制組+RNS促進(jìn)組和ROS抑制組+RNS抑制組(P<0.05),說明促進(jìn)ROS可加重肌肉的蒸煮損失,原因可能是ROS誘導(dǎo)的蛋白氧化引起蛋白質(zhì)的降解與變性,導(dǎo)致其對(duì)水分結(jié)合能力降低,肌肉蒸煮損失逐漸增加[7]。以上結(jié)果表明,與對(duì)照組相比,激活ROS的同時(shí)激活/抑制RNS,蒸煮損失顯著增加,而抑制ROS的同時(shí)激活或抑制RNS,蒸煮損失顯著降低;此外,結(jié)果還表明高氧/低氧條件下,激活RNS可顯著提高肌肉的蒸煮損失(P<0.05),推測(cè)可能是由宰后ROS與RNS串?dāng)_對(duì)牦牛肉的蛋白質(zhì)降解程度、蛋白質(zhì)氧化、蛋白質(zhì)亞硝基化和pH值不同所致[25-26]。

圖3 宰后RNS與ROS串?dāng)_對(duì)牦牛肉蒸煮損失的影響Fig.3 Effect of crosstalk between RNS and ROS on steaming losses of yak meat during postmortem

2.4 剪切力

由圖4可知,各處理組剪切力基本上呈先上升后下降的趨勢(shì),且在成熟的第72 h達(dá)到最大值。這可能是因?yàn)樵谠缀蟪墒煸缙?由于肌節(jié)的收縮而導(dǎo)致肌肉進(jìn)入僵直狀態(tài),剪切力增大;而隨著成熟的進(jìn)行,當(dāng)達(dá)到最大僵直后,在肌肉中一些內(nèi)源酶和肌漿Ca2+等激活因子的作用下,將肌肉結(jié)構(gòu)破壞,使肉的嫩度增加,剪切力值降低[27]。此外,牦牛肉宰后成熟過程中,同一成熟時(shí)間,不同處理組之間剪切力也存在顯著差異(除0 h),在成熟的第24 h,剪切力由大到小依次為:ROS抑制組+RNS促進(jìn)組>對(duì)照組>ROS促進(jìn)組+RNS促進(jìn)組>ROS促進(jìn)組+RNS抑制組>ROS抑制組+RNS抑制組,表明宰后成熟第24 h時(shí),增加ROS或抑制RNS的產(chǎn)生能夠使肌肉剪切力減小,嫩度降低,這與王琳琳[1]的研究結(jié)果一致。隨著成熟的進(jìn)行,在72～168 h,ROS促進(jìn)組+RNS促進(jìn)組剪切力顯著高于ROS促進(jìn)組+RNS抑制組(P<0.05),而顯著低于ROS抑制組+RNS抑制組。張朝陽[19]研究也發(fā)現(xiàn),與對(duì)照組相比,NO供體處理提高了成熟第7天的剪切力值,NO抑制劑處理降低了牛肉成熟第4天和第7天的剪切力值,這與本試驗(yàn)結(jié)果相一致,即當(dāng)宰后肌肉細(xì)胞中的NO含量增加時(shí),會(huì)增加牛肉的剪切力,即降低牛肉的嫩度。以上結(jié)果表明,在成熟的第72～168 h,與對(duì)照組相比,激活ROS的同時(shí)激活/抑制RNS,剪切力值顯著降低,而抑制ROS的同時(shí)激活或抑制RNS,剪切力值顯著增大;此外,結(jié)果還發(fā)現(xiàn),高氧條件下抑制RNS可降低剪切力值,而低氧條件下抑制RNS可使剪切力值增大。引起上述結(jié)果變化的原因,一方面這可能由于H2O2處理后ROS含量增加,積累的ROS誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡級(jí)聯(lián)反應(yīng)的發(fā)生,從而對(duì)肌原纖維蛋白進(jìn)行降解,破壞了肌纖維的結(jié)構(gòu),導(dǎo)致剪切力值減小[1];另一方面可能是因?yàn)镹O及其介導(dǎo)的蛋白質(zhì)亞硝基化通過抑制鈣蛋白酶的自溶,降低鈣蛋白酶的水解活性,從而抑制肌原纖維蛋白和細(xì)胞骨架蛋白降解,使肌肉嫩度降低,剪切力增大[19]。

圖4 宰后RNS與ROS串?dāng)_對(duì)牦牛肉剪切力的影響Fig.4 Effect of crosstalk between RNS and ROS on shear force of yak meat during postmortem

2.5 質(zhì)構(gòu)特性

由圖5-a可知,隨著成熟時(shí)間的延長(zhǎng),各處理組牦牛肉硬度均呈先增加后降低的趨勢(shì)。同一成熟時(shí)間(除0 h外)不同處理間牦牛肉的硬度也存在顯著差異,且在成熟的第24～72 h,硬度大小依次為ROS抑制組+RNS促進(jìn)組>ROS抑制組+RNS抑制組>對(duì)照組>ROS促進(jìn)組+RNS促進(jìn)組>ROS促進(jìn)組+RNS抑制組,說明在激活ROS的同時(shí)促進(jìn)或抑制RNS可使肌肉硬度降低,利于肌肉嫩化,這與剪切力的變化規(guī)律相一致,推測(cè)可能是由于在成熟間RNS引起的蛋白亞硝基化對(duì)蛋白氧化有負(fù)向調(diào)控作用[28]。結(jié)果表明增加RNS肌肉嫩度變差,而增加ROS可改善肌肉嫩度。

a-硬度;b-彈性;c-回復(fù)性;d-黏聚性;e-咀嚼性圖5 宰后RNS與ROS串?dāng)_對(duì)牦牛肉硬度、彈性、回復(fù)性、黏聚性、咀嚼性的影響Fig.5 Effect of crosstalk between RNS and ROS on hardness, elasticity, recovery, cohesiveness, and chewiness of yak meat during postmortem

由圖5-b～圖5-d可知,牦牛肉宰后成熟過程中,各處理組彈性和回復(fù)性均呈下降趨勢(shì)(P<0.05);且成熟24～168 h,各處理組牦牛肉黏聚性均呈先下降后上升的趨勢(shì)。此外,同一成熟時(shí)間,不同處理組之間肌肉彈性、回復(fù)性及黏聚性也存在一定的變化。

咀嚼性與硬度、黏聚性和彈性的大小有關(guān)[28]。由圖5-e可知,在成熟的第0～120 h,對(duì)照組、ROS促進(jìn)組+RNS促進(jìn)組/ROS抑制組、ROS抑制組+RNS促進(jìn)組的咀嚼性呈先下降后上升的趨勢(shì)。此外,同一成熟時(shí)間不同處理間牦牛肉的咀嚼性也存在顯著差異,且在成熟的第24 h,咀嚼性大小依次為ROS抑制組+RNS促進(jìn)組>對(duì)照組2>ROS促進(jìn)組+RNS促進(jìn)組>ROS促進(jìn)組+RNS抑制組>ROS抑制組+RNS抑制組,這與剪切力的結(jié)果相一致,表明宰后成熟第24 h時(shí),增加ROS或抑制RNS的產(chǎn)生能夠使肌肉咀嚼性減小,嫩度降低;而在成熟的第72～168 h,咀嚼性大小依次為:ROS抑制組+RNS抑制組>對(duì)照組2>ROS促進(jìn)組+RNS促進(jìn)組>ROS促進(jìn)組+RNS抑制組(P<0.05)。綜上,結(jié)果表明增加ROS的同時(shí)激活或抑制RNS可降低肌肉咀嚼性,改善肌肉嫩度。

綜上所述,與對(duì)照組相比,激活ROS的同時(shí)激活/抑制RNS,硬度和咀嚼性顯著降低,而抑制ROS的同時(shí)促進(jìn)或抑制RNS,硬度和咀嚼性顯著增大;此外,結(jié)果也表明,高氧條件下抑制RNS,牦牛肉的硬度和咀嚼性顯著降低,可有效改善肌肉嫩度。

2.6 肌原纖維蛋白微觀結(jié)構(gòu)

2.6.1 MFI

MFI與肉的嫩度顯著相關(guān),是反映肌原纖維內(nèi)部結(jié)構(gòu)完整性破壞程度的指標(biāo)。由圖6-a可知,成熟時(shí)間和不同處理對(duì)牦牛肉MFI具有顯著影響(P<0.05)。隨成熟時(shí)間的延長(zhǎng),各處理組MFI均顯著增大(P<0.05),這可能是由于在整個(gè)成熟過程中牦牛肉骨架蛋白發(fā)生一定程度的降解[1]。此外,同一成熟時(shí)間(除0 h外),各處理組MFI由大到小依次為:ROS促進(jìn)組+RNS抑制組>ROS促進(jìn)組+RNS促進(jìn)組>對(duì)照組1=對(duì)照組2>ROS抑制組+RNS促進(jìn)組>ROS抑制組+RNS抑制組,說明H2O2處理顯著增大了MFI,這可能由于H2O2處理后ROS含量增加,積累的ROS誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡級(jí)聯(lián)反應(yīng)的發(fā)生,從而對(duì)肌原纖維蛋白進(jìn)行降解,破壞了肌纖維的結(jié)構(gòu),導(dǎo)致MFI升高[1]。另外,該結(jié)果表明,與對(duì)照組相比,激活ROS的同時(shí)激活或抑制RNS使MFI顯著增大,而抑制ROS的同時(shí)激活或抑制RNS使MFI顯著降低;此外,結(jié)果還表明高氧條件下抑制RNS或低氧條件下激活RNS,MFI顯著增大,利于肉的嫩化,這與張朝陽[19]的結(jié)果一致。此外,我們的結(jié)果也表明,同時(shí)激活ROS和RNS有利于宰后肌肉的嫩化,這可能與ROS和ROS分子結(jié)合生成更高氧化活性的過氧亞硝酸鹽有關(guān)[29]。

a-肌原纖維小片化指數(shù);b-肌原纖維微觀結(jié)構(gòu)(×12 000)圖6 宰后RNS與ROS串?dāng)_對(duì)牦牛肉肌原纖維小片化指數(shù)和肌原纖維微觀結(jié)構(gòu)的影響Fig.6 Effect of crosstalk between RNS and ROS on myogenic fiber miniaturization index and myogenic fiber protein histology of yak meat during postmortem

2.6.2 肌纖維微觀結(jié)構(gòu)的變化

不同處理組的牦牛肉樣品的微觀結(jié)構(gòu)變化如圖6-b所示。宰后0～12 h,牦牛肉肌纖維排列整齊有序,暗帶(A帶)、明帶(I帶)、Z線和M線均清晰可見;隨著成熟的進(jìn)行,肌原纖維的微觀結(jié)構(gòu)惡化,肌原纖維的正常排列被破壞。宰后24 h,ROS抑制組+RNS促進(jìn)組/RNS抑制組的Z線和M線相對(duì)完整,I帶和A帶清晰可見;然而ROS促進(jìn)組+RNS促進(jìn)組/RNS抑制組的M線和Z線較對(duì)照組變得模糊。成熟72 h時(shí),各處理組的Z 線扭曲、肌纖維出現(xiàn)明顯的收縮帶,其中,ROS促進(jìn)組+RNS抑制組的某些區(qū)域的肌原纖維I帶和Z線斷裂程度明顯加重,肌原纖維結(jié)構(gòu)較對(duì)照組更差。成熟120 h時(shí),ROS促進(jìn)組+RNS促進(jìn)組/RNS抑制組的Z線斷裂,M線已無法辨認(rèn),A帶和I帶不易被發(fā)現(xiàn),肌節(jié)間有縫隙。宰后的第168 h牦牛肉肌原纖維結(jié)構(gòu)完全消失,Z 線斷裂、崩解,M 線消失,且各處理組中均出現(xiàn)大量可見的肌原纖維碎片,且ROS促進(jìn)組+RNS抑制組的肌原纖維結(jié)構(gòu)的損傷程度明顯重于對(duì)照組。這些結(jié)果表明,與對(duì)照組相比,激活ROS的同時(shí)促進(jìn)或抑制RNS加速了肌纖維結(jié)構(gòu)遭的破壞,而抑制ROS的同時(shí)激活或抑制RNS可減緩牛肉肌纖維的斷裂程度,這可能是因?yàn)镚SNO和L-NAME調(diào)控的NO通過影響氧化應(yīng)激、肌原纖維的降解、細(xì)胞凋亡而在肌肉嫩化過程中發(fā)揮重要做用[16, 21]。另外,NO可能是通過調(diào)控ROS并參與細(xì)胞凋亡途徑參與改善肉類嫩度[17,21]。此外,肌原纖維的弱化有助于提高肉類的嫩度[17]。因此,肌原纖維結(jié)構(gòu)的變化部分原因可能是在牦牛肉成熟過程中由RNS引起的亞硝基化通過抑制蛋白氧化、降低肌原纖維的降解程度改善牛肉嫩度。

2.7 相關(guān)性和主成分分析

如圖7-a所示,pH值與L*值、b*值、蒸煮損失和MFI呈顯著負(fù)相關(guān),相關(guān)性系數(shù)分別為-0.48、-0.56、-0.77和-0.77;蒸煮損失與L*值和b*值顯著正相關(guān),而與a*值呈負(fù)相關(guān);剪切力與硬度呈正相關(guān),與MFI呈負(fù)相關(guān),相關(guān)系數(shù)分別為0.63和-0.30;硬度與彈性、回復(fù)性、黏聚性和咀嚼性呈正相關(guān)。

a-相關(guān)性;b-主成分分析圖7 宰后RNS與ROS串?dāng)_下牦牛肉食用品質(zhì)間的相關(guān)性和主成分分析Fig.7 Correlation and principal component analysis between the crosstalk of RNS and ROS on the edible quality of yak meat during postmortem

圖7-b采用主成分分析方法對(duì)宰后成熟過程中RNS與ROS串?dāng)_作用下牦牛肉pH值、肉色、蒸煮損失、質(zhì)構(gòu)特性、MFI進(jìn)行了區(qū)分,并研究他們?cè)谠缀蟪墒爝^程中的關(guān)系。前兩個(gè)主成分(PC1和PC2)共解釋了68%的變異,第一主成分解釋了53.3%的方差貢獻(xiàn)率,它可明確區(qū)分成熟0～24 h與72～120 h,且pH、剪切力、硬度、a*值、咀嚼性、黏聚性、回復(fù)性和彈性與成熟0～24 h呈正相關(guān),而與L*值、b*值、蒸煮損失和MFI呈負(fù)相關(guān)。第二主成分PC2解釋了14.7%的方差貢獻(xiàn)率,它可作為成熟時(shí)間的區(qū)分因子,明確區(qū)分ROS促進(jìn)組+RNS抑制組在成熟的第24 h和72～168 h,以及除ROS促進(jìn)組+RNS抑制組外的其他組在成熟的第24～72 h與168 h時(shí),時(shí)間對(duì)牦牛肉品質(zhì)的影響。說明在成熟的24～72 h時(shí),其他處理組中蒸煮損失、b*值、L*值的變化明顯增加,而剪切力、硬度、彈性、a*值、黏聚性、回復(fù)性和pH值明顯降低;而在成熟的72～168 h,MFI、回復(fù)性、黏聚性、pH值剪切力、硬度和彈性變化明顯,且易受ROS促進(jìn)組+RNS抑制組的影響,該結(jié)果與圖1～圖5、圖6-a結(jié)果相一致。

3 結(jié)論

H2O2誘導(dǎo)ROS的增加可顯著降低牦牛肌肉的剪切力、硬度和咀嚼性,增加肉樣蒸煮損失和MFI,改善肌肉嫩度;宰后牦牛肉因促進(jìn)ROS而引發(fā)蛋白氧化所形成的高氧條件中,抑制RNS也可降低牦牛肉的最終pH、L*值、a*值、蒸煮損失、硬度、咀嚼性和剪切力,而增加MFI,對(duì)肉的成熟嫩化具有一定的積極作用;此外,因抑制ROS誘發(fā)蛋白氧化的發(fā)生所形成的低氧條件中,GSNO引起的RNS誘導(dǎo)的蛋白質(zhì)亞硝化,可增加牦牛肉pH值、a*值、蒸煮損失和MFI,而使剪切力降低,也可有效改善肉類嫩度。綜上,宰后成熟過程中,抑制ROS誘導(dǎo)的蛋白氧化發(fā)生的同時(shí)激活或抑制蛋白質(zhì)亞硝基化可阻礙肌肉的嫩化,而ROS誘導(dǎo)蛋白氧化發(fā)生的同時(shí)激活或抑制蛋白質(zhì)亞硝基化程度可有效改善牦牛肉的嫩度。