鄧玉群,邱小燕,孫媛媛,田玉橋,陳三春

1(湖南食品藥品職業(yè)學(xué)院,湖南 長(zhǎng)沙, 410205)2(懷化學(xué)院 生物與食品工程學(xué)院,湖南 懷化,418000)3(湖南省博世康中醫(yī)藥有限公司,湖南 懷化,418000)

發(fā)酵全混合日糧(total mixed ration, TMR)是在厭氧條件下通過(guò)乳酸發(fā)酵生產(chǎn)的營(yíng)養(yǎng)相對(duì)均衡的飼料,不僅能解決粗精料分開(kāi)飼喂的問(wèn)題,而且可以提高飼料利用率和生產(chǎn)性能[1]。近年來(lái),大量的農(nóng)業(yè)、食品副產(chǎn)物被調(diào)配成發(fā)酵TMR,包括啤酒糟、綠茶渣和土豆皮等[2],并獲得了發(fā)酵品質(zhì)較好的飼料。中國(guó)每年都會(huì)產(chǎn)生大量的水稻秸稈[3]、四棱豆藤和甜茶渣,如果將這些農(nóng)副產(chǎn)物混合作為發(fā)酵TMR的原料,不僅可以擴(kuò)大飼料來(lái)源,還能有效地利用農(nóng)副產(chǎn)物。水稻秸稈和甜茶渣都含有豐富的粗纖維,缺乏水溶性碳水化合物(water soluble carbohydrate,WSC)和粗蛋白,未加工的水稻秸稈和甜茶渣是適口性差、采食率低的劣質(zhì)飼料,而四棱豆藤富含WSC和粗蛋白,可以彌補(bǔ)水稻秸稈和甜茶渣蛋白質(zhì)含量不足、適口性差的缺點(diǎn)。

發(fā)酵TMR在開(kāi)袋后和長(zhǎng)距離運(yùn)輸過(guò)程中容易發(fā)生有氧變質(zhì),降低品質(zhì)。因此,提高發(fā)酵TMR的品質(zhì)是非常重要的。雙乙酸鈉是一種用于飼料、食品領(lǐng)域的防霉保鮮劑,有較強(qiáng)的抑菌、殺菌作用,使用相對(duì)安全[4],近年來(lái),雙乙酸鈉作為添加劑在反芻動(dòng)物飼料中得到了廣泛的應(yīng)用。張新慧等[5]研究發(fā)現(xiàn)雙乙酸鈉并沒(méi)有改善青貯飼料的發(fā)酵品質(zhì),但能提高青貯飼料的有氧穩(wěn)定性。綠汁發(fā)酵液(fermented juice of epiphytic lactic acid bacteria, FJLB)是指將植物勻漿后,利用其表面附生的乳酸菌在厭氧環(huán)境中利用植物綠汁發(fā)酵富集乳酸菌的一種青貯添加劑,可以促進(jìn)乳酸發(fā)酵,通常用于提高青貯飼料的發(fā)酵品質(zhì)[6]。

本研究以水稻秸稈、四棱豆藤和甜茶渣為原料制備發(fā)酵TMR,探究雙乙酸鈉和FJLB對(duì)TMR發(fā)酵品質(zhì)和有氧穩(wěn)定性的影響,為更好的開(kāi)發(fā)和利用當(dāng)?shù)氐霓r(nóng)副產(chǎn)物,調(diào)制優(yōu)質(zhì)的發(fā)酵TMR提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 發(fā)酵TMR的制備

TMR由水稻(OryzasativaL.)秸稈、四棱豆[Psophocarpustetragonolobus(L.) DC.]藤、甜茶[Lithcarpuslitseifolius(Hance) Chun]渣和精料混合而成,水分含量約為50%。甜茶渣是甜茶提取后的濕殘留物。精料由玉米粉、豆粕、菜籽粕、棉粕、麥麩、預(yù)混料、酒糟蛋白飼料(distillers dried grains with solubles, DDGS)和食鹽組成,發(fā)酵TMR的調(diào)配均以干物質(zhì)(dry matter,DM)為基礎(chǔ)將原料進(jìn)行混合,參照當(dāng)?shù)啬膛?chǎng)采用的配方,奶牛處于泌乳中期,蛋白需要量維持在14%左右,發(fā)酵TMR配方中原料的化學(xué)成分如表1所示。將50 g四棱豆鮮葉榨汁過(guò)濾,濾液中加入2%蔗糖,調(diào)節(jié)發(fā)酵pH值至4.2,在30 ℃恒溫培養(yǎng)箱中厭氧培養(yǎng)48 h,獲得FJLB。用切割機(jī)將水稻秸稈、四季豆藤和甜茶渣切成1～2 cm長(zhǎng)。實(shí)驗(yàn)分為4組:對(duì)照組(C,不添加)、雙乙酸鈉組[S,0.5%鮮重(fresh weight,FW)]、FJLB組(L,2.0 mL/kg FW)、雙乙酸鈉+FJLB組(SL,0.5%+2.0 mL/kg FW)。每個(gè)聚乙烯青貯袋裝入8 kg TMR,每個(gè)處理設(shè)5個(gè)重復(fù),抽真空密封。TMR在25 ℃的厭氧條件下發(fā)酵35 d,獲得發(fā)酵TMR。

表1 發(fā)酵TMR原材料化學(xué)成分Table 1 Chemical composition of raw materials used in fermented TMR

1.2 化學(xué)成分和微生物分析

將樣品放入65 ℃烘箱中烘48 h,恒重測(cè)定DM含量。用PHS-3C型雷諾pH計(jì)測(cè)定pH值。乳酸和揮發(fā)性脂肪酸的含量用GC-2014氣相色譜儀測(cè)定[7]。采用硫酸-蒽酮比色法測(cè)定WSC的含量。氨態(tài)氮含量的測(cè)定采用苯酚-次氯酸鈉比色法[8]。粗蛋白用KjeltecTM2300全自動(dòng)氮分析儀測(cè)定。采用高溫燃燒法測(cè)定粗灰分。用Van-Soest法測(cè)定中性洗滌纖維和酸性洗滌纖維。緩沖能用鹽酸-氫氧化鈉法測(cè)定。乳酸菌用瓊脂培養(yǎng)基培養(yǎng),好氧微生物用營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基培養(yǎng),酵母菌用馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基培養(yǎng)。乳酸菌在37 ℃厭氧條件下培養(yǎng)。在37 ℃生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)好氧性微生物和酵母菌[9]。

1.3 有氧穩(wěn)定性試驗(yàn)

有氧穩(wěn)定性由熱電偶測(cè)定[10]。同時(shí),檢測(cè)發(fā)酵TMR的化學(xué)成分變化和微生物數(shù)量,這些指標(biāo)可以反映發(fā)酵TMR在有氧條件下的腐敗程度。

1.4 體外消化率

采用體外兩步法測(cè)定發(fā)酵TMR的消化率。瘤胃液采集自具有永久性瘤胃瘺的西門(mén)塔爾雜交公牛。中性洗滌纖維消化率和DM消化率分別為在體外消化過(guò)程中中性洗滌纖維和DM的損失[11]。

1.5 統(tǒng)計(jì)分析

用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)測(cè)試數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,用平均值和標(biāo)準(zhǔn)差表示測(cè)試結(jié)果。采用Duncan法進(jìn)行多因素比較。P<0.05表示差異顯著有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)酵TMR的化學(xué)成分

3種粗飼料中,四棱豆藤的粗蛋白和WSC含量最高,甜茶渣和水稻秸稈的中性洗滌纖維含量相近,均高于四棱豆藤。水稻秸稈的酸性洗滌纖維含量最高(表1)。TMR的DM含量為507.16 g/kg FW。粗蛋白質(zhì)含量為134.35 g/kg DM。乳酸菌和酵母菌數(shù)量約為5 lg CFU/g FW(表2)。

表2 發(fā)酵前TMR組成、化學(xué)成分及微生物數(shù)量Table 2 Ingredients and chemical composition and microbial populations of total mixed ration before fermentation

2.2 發(fā)酵TMR的發(fā)酵品質(zhì)

如表3所示,L和SL組發(fā)酵TMR的pH值均低于對(duì)照組和S組(P<0.05),L組的乳酸含量最高(P<0.05),對(duì)照組、S組和SL組的乳酸含量無(wú)顯著性差異(P>0.05)。與對(duì)照組相比,添加雙乙酸鈉、雙乙酸鈉+FJLB顯著提高了乙酸濃度(P<0.05)。L組和SL組的酵母菌和好氧性微生物數(shù)量顯著低于對(duì)照組和S組(P<0.05)。4種發(fā)酵TMR之間的緩沖能、丁酸濃度和乳酸菌數(shù)量差異均不顯著(P>0.05)。L組的WSC和粗灰分含量最低(P<0.05),SL組的WSC含量顯著高于對(duì)照組(P<0.05)。S組中性洗滌纖維顯著高于對(duì)照組(P<0.05),L組中性洗滌纖維顯著低于對(duì)照組(P<0.05)。添加劑對(duì)DM、粗蛋白、酸性洗滌纖維含量及DM消化率、中性洗滌纖維消化率影響較小(P>0.05)。

表3 青貯35 d后TMR的發(fā)酵品質(zhì)Table 3 Fermentation quality of TMR silages of different treatments after 35 days of ensiling

2.3 發(fā)酵TMR的有氧穩(wěn)定性

如圖1所示,S組的有氧穩(wěn)定性達(dá)到312 h,顯著高于L組和對(duì)照組(P<0.05),L組最先變質(zhì),對(duì)照組次之,S組和SL組之間無(wú)顯著差異(P>0.05)。

圖1 添加劑對(duì)發(fā)酵全混合日糧有氧穩(wěn)定性的影響Fig.1 Effect of each additive on the aerobic stability of fermented total mixed ration注:不同小寫(xiě)字母表示差異顯著。

如表4所示,除丙酸和丁酸含量外,其他添加劑對(duì)發(fā)酵TMR在有氧穩(wěn)定過(guò)程中的化學(xué)成分含量均有顯著影響(P<0.05)。除氨態(tài)氮、乙酸和丁酸含量外,有氧暴露時(shí)間對(duì)發(fā)酵TMR的有氧穩(wěn)定性也有顯著影響(P<0.05)。處理與有氧暴露時(shí)間的交互作用顯著影響pH值、乳酸、WSC含量和微生物數(shù)量(P<0.05)。有氧暴露0～15 d,對(duì)照組和L組pH值呈上升趨勢(shì),第15天分別上升至6.98和8.14,顯著高于S組和SL組(P<0.05)。對(duì)照組、S組和SL組在有氧暴露后第9、6、15天乳酸含量分別顯著下降(P<0.05),而S組乳酸含量呈先下降后上升再下降的趨勢(shì)。各組WSC含量均呈下降趨勢(shì)。各組在有氧暴露期間氨態(tài)氮含量均呈上升趨勢(shì),在有氧暴露第15天,對(duì)照組和L組的氨態(tài)氮含量顯著高于S組和SL組(P<0.05)。在整個(gè)有氧暴露過(guò)程中,S組的丁酸含量顯著高于其他3組(P<0.05)。在有氧暴露的第3天,對(duì)照組、L組和SL組的好氧菌數(shù)顯著增加(P<0.05)。在整個(gè)有氧暴露過(guò)程中,S組和SL組的酵母菌數(shù)無(wú)顯著變化(P>0.05)。在整個(gè)有氧暴露過(guò)程中,各組乳酸菌數(shù)量均呈下降趨勢(shì)。

表4 開(kāi)窖后發(fā)酵TMR的品質(zhì)Table 4 Quality of total mixed ration silages during exposed to air

3 討論

發(fā)酵TMR原料是發(fā)酵成功的關(guān)鍵,充足的發(fā)酵底物和乳酸菌會(huì)促進(jìn)乳酸發(fā)酵,從而迅速降低pH值,抑制不良微生物的生長(zhǎng)[12]。一般認(rèn)為,當(dāng)乳酸菌超過(guò)5 lg CFU/g FW,WSC含量超過(guò)25～35 g/kg DM時(shí),可以獲得高質(zhì)量的青貯飼料[13]。本試驗(yàn)青貯前TMR中乳酸菌數(shù)量接近5 lg CFU/g FW,WSC含量為54.92 g/kg DM,滿足青貯發(fā)酵成功的條件。青貯35 d后,各試驗(yàn)組僅檢出少量丁酸(0.43～0.53 g/kg DM),氨態(tài)氮也低于100 g/kg TN。各組TMR均獲得了較好的發(fā)酵品質(zhì)。各處理組的pH值均在4.2以上,可能與發(fā)酵TMR原料中DM含量較高有關(guān)。YUAN等[14]的研究表明,當(dāng)青貯原料的DM含量較高時(shí),pH值在4.5左右,也可以使飼料保存良好。本試驗(yàn)中添加FJLB明顯降低了發(fā)酵TMR的pH值,提高乳酸含量,這是因?yàn)槿樗峋诎l(fā)酵初期以乳酸菌的增殖為主,加速了pH值的下降,從而抑制了不良菌的影響,減少了蛋白質(zhì)的水解,提高了發(fā)酵TMR的品質(zhì)。這一結(jié)果與BUREENOK等[15]的研究一致。氨態(tài)氮/總氮主要體現(xiàn)蛋白質(zhì)和氨基酸的降解程度,數(shù)值越低,發(fā)酵品質(zhì)越好[16]。S組和SL組的氨態(tài)氮/總氮值明顯低于非雙乙酸鈉組,可能是雙乙酸鈉抑制了丁酸菌等有害微生物的生長(zhǎng),從而減少了蛋白質(zhì)和氨基酸的分解。國(guó)衛(wèi)杰等[17]還報(bào)道了添加雙乙酸鈉可以抑制有害細(xì)菌的生長(zhǎng),延長(zhǎng)儲(chǔ)藏時(shí)間。本研究中在青貯35 d后,添加雙乙酸鈉與組合添加雙乙酸鈉組的乳酸含量與乳酸菌數(shù)量與對(duì)照組相比均沒(méi)有顯著性差異,這可能是雙乙酸鈉對(duì)乳酸菌發(fā)酵過(guò)程沒(méi)有影響,雙乙酸鈉主要靠分解的分子態(tài)乙酸起抗菌作用,對(duì)霉菌、酵母和細(xì)菌等有害微生物有良好的抑制能力。張新慧等[5]的研究也表明雙乙酸鈉(0.4%,質(zhì)量分?jǐn)?shù))對(duì)乳酸菌發(fā)酵可溶性糖產(chǎn)生乳酸的過(guò)程沒(méi)有影響。劉振陽(yáng)等[18]的研究則表明,雙乙酸鈉有降低了青貯飼料pH值,減少了青貯飼料的營(yíng)養(yǎng)損失,但是較高的雙乙酸鈉添加量會(huì)抑制青貯飼料乳酸菌的活性。

在青貯35 d后,添加FJLB顯著降低了NDF的含量,這種降低可能歸因于細(xì)胞壁組分的酸解[19],L組和SL組較高的乳酸含量可以準(zhǔn)確地解釋這一點(diǎn)。同樣,YUAN等[14]也報(bào)道了青貯飼料中較高的乳酸含量會(huì)導(dǎo)致酸解,從而減少中性洗滌纖維的含量。本研究中,青貯35 d后,L和SL組的中性洗滌纖維低于對(duì)照組,而L和SL組的酸性洗滌纖維與對(duì)照組相比無(wú)明顯差異,綠汁發(fā)酵液對(duì)中性洗滌纖維來(lái)源材料的影響較大,對(duì)酸性洗滌纖維影響較小,中性洗滌纖維比酸性洗滌纖維多含半纖維素,因此對(duì)發(fā)酵的影響更大。在本研究中,添加劑不影響中性洗滌纖維消化率和DM消化率。也有研究者發(fā)現(xiàn),添加微生物不會(huì)影響用象草制成的青貯飼料的DM消化率[20]。

當(dāng)青貯飼料處于有氧暴露階段時(shí),乳酸、蛋白質(zhì)和WSC被好氧微生物分解和利用,產(chǎn)生氨、CO2和水等產(chǎn)物并釋放熱量,導(dǎo)致有氧變質(zhì)[7]。有氧穩(wěn)定性通常用青貯飼料核心溫度比外部溫度高出2 ℃所需的時(shí)間來(lái)表示[21]。pH值在有氧暴露階段的變化也是發(fā)酵TMR腐爛程度的指標(biāo)之一,本研究中,S和SL組發(fā)酵TMR在有氧暴露12 d后的pH值保持在4.5左右,添加雙乙酸鈉增強(qiáng)了發(fā)酵TMR的有氧穩(wěn)定性,這可歸因于雙乙酸鈉中含有兩個(gè)乙酸根,可以緩慢分解并釋放單分子物質(zhì)乙酸,而乙酸類(lèi)似于脂類(lèi),可以穿透霉菌和酵母的細(xì)胞壁,干擾細(xì)胞間酶的識(shí)別、傳遞和轉(zhuǎn)化,促進(jìn)蛋白質(zhì)變性,改變細(xì)胞通透性,起到殺菌作用。乙酸還可以通過(guò)降低物質(zhì)的pH值來(lái)抑制細(xì)菌和殺滅細(xì)菌[14]。因此,乙酸也是預(yù)測(cè)發(fā)酵TMR有氧穩(wěn)定性的主要指標(biāo)之一,乙酸的濃度越高,有氧腐爛的時(shí)間就越長(zhǎng)[18]。在本試驗(yàn)中,S和SL組發(fā)酵TMR的乳酸含量高于對(duì)照和L組,而氨態(tài)氮含量低于對(duì)照和L組發(fā)酵TMR,這與雙乙酸鈉改善有氧穩(wěn)定性的效果是一致的。JOHNSON等[22]報(bào)道,WSC和乳酸可以為好氧微生物、酵母和霉菌的生長(zhǎng)和增殖提供底物,導(dǎo)致青貯飼料中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的損失。在本試驗(yàn)中,對(duì)照組和L組發(fā)酵TMR在發(fā)酵35 d后的WSC含量較高,而有氧穩(wěn)定性低于雙乙酸鈉組。

4 結(jié)論

各組發(fā)酵TMR均具有良好的發(fā)酵品質(zhì)。添加雙乙酸鈉可使發(fā)酵TMR保存12 d以上,提高發(fā)酵TMR的有氧穩(wěn)定性。因此,添加0.5%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))雙乙酸鈉可在不影響發(fā)酵品質(zhì)的前提下提高發(fā)酵TMR的有氧穩(wěn)定性,可用于生產(chǎn)。