楊壯,劉怡琳,李隆熙,劉菡,劉旭,馬艷莉*,王頡*

1(河北農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科技學(xué)院,河北 保定,071000)2(南陽(yáng)理工學(xué)院 張仲景國(guó)醫(yī)國(guó)藥學(xué)院,河南 南陽(yáng),473000)

黃精(PolygonatumMill)是一種藥食同源的食物資源,已成為我國(guó)首批列入《按照傳統(tǒng)既是食品又是中藥材物質(zhì)目錄》的天然資源之一[1]。黃精根莖具有補(bǔ)中益氣、滋陰養(yǎng)肺等功效,其主要化學(xué)成分包括多糖、黃酮、甾體皂苷、三萜、生物堿、植物甾醇及揮發(fā)油和微量元素等[2]。多糖是黃精中含量最高(≥7%)的活性物質(zhì),具有抗氧化、抗炎、降血糖血脂、抗癌和調(diào)節(jié)免疫力等功效[3-6]。目前,多糖提取的方法主要有溶劑提取法、酶提取法、超聲波提取法和微生物發(fā)酵法等。其中,微生物發(fā)酵法不僅可以提高黃精多糖的得率,還可以增強(qiáng)黃精多糖的抗氧化活性和降血糖降血脂功能[7-8]。固態(tài)發(fā)酵相比于液態(tài)發(fā)酵成本更低、產(chǎn)物更易分離、多糖轉(zhuǎn)化率更高、發(fā)酵過(guò)程不容易造成污染[9]。當(dāng)前微生物發(fā)酵法中對(duì)多糖的提取多聚焦在液態(tài)發(fā)酵,固態(tài)發(fā)酵提取多糖的研究較少。經(jīng)研究,適宜的菌種是固態(tài)發(fā)酵提取多糖的關(guān)鍵。常用的發(fā)酵菌種包括乳桿菌、酵母菌和芽孢桿菌等,其中使用最廣泛的菌種為乳桿菌,乳桿菌是一類多功能益生菌,具有抗氧化、增強(qiáng)免疫力和調(diào)節(jié)宿主腸道菌群平衡等功效[10]。

本研究以黃精為原料,利用7株乳桿菌進(jìn)行固態(tài)發(fā)酵,篩選出最佳發(fā)酵菌種,然后通過(guò)單因素試驗(yàn)和響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化發(fā)酵條件,最后對(duì)比研究固態(tài)發(fā)酵黃精多糖(solid state fermentationPolygonatumsibiricumpolysaccharide, SF-PSP)和相同條件下未經(jīng)發(fā)酵黃精多糖(P.sibiricumpolysaccharide, PSP)的理化特性和抗氧化活性,以期為發(fā)酵黃精提取多糖的結(jié)構(gòu)及活性研究提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與菌種

黃精(一蒸一制:經(jīng)一次蒸制一次晾曬處理),河南聯(lián)源生物科技股份有限公司。

植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)GDMCC 1.380、植物乳桿菌ATCC 14917、副干酪乳桿菌(Lactobacillusparacasei)ATCC 334、L.plantarumACCC 11095、L.paracaseiCICC 20109、L.paracaseiCICC 20245、短乳桿菌(Lactobacillusbrevis)CMCC 1.288,北京生物保藏中心。

1.2 主要試劑

乙二胺四乙酸二鈉、十二烷基硫酸鈉、FeSO4、無(wú)水乙醇(均為分析純),天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司;菲啰嗪(分析純),上海麥克林生化科技有限公司;MRS液體培養(yǎng)基、MRS固體培養(yǎng)基(生物試劑),北京奧博星生物技術(shù)有限公司;DPPH、ABTS(均為標(biāo)準(zhǔn)品),上海源葉生物科技有限公司。

1.3 儀器與設(shè)備

HH-2型數(shù)顯恒溫水浴鍋,金壇市晶玻實(shí)驗(yàn)儀器廠;UV-752 N紫外可見(jiàn)分光光度計(jì),北京普析通用儀器有限責(zé)任公司;ME-204E電子分析天平,奧斯豪儀器(上海)有限公司;LC-20A高效液相色譜儀,島津儀器有限公司;Xtimate C18柱,月旭科技(上海)股份有限公司;JSM-7900F場(chǎng)發(fā)射掃描電子顯微鏡,日本電子株式會(huì)社。

1.4 試驗(yàn)方法

1.4.1 菌種活化及篩選

將7株菌種分別接種到MRS液體培養(yǎng)基中活化,根據(jù)菌種最適溫度搖床培養(yǎng)48 h[11]。將干燥的黃精粉碎,粉末過(guò)60目篩。采用固態(tài)發(fā)酵的方式,分別將活化后的菌種(1.0×108～1.5×108CFU/mL)以接種量10%、液料比1∶1(mL∶g)接入滅菌的黃精粉末中,依據(jù)各菌種最適的培養(yǎng)溫度發(fā)酵48 h。以黃精多糖的得率為指標(biāo),確定最佳發(fā)酵菌種。

1.4.2 固態(tài)發(fā)酵黃精的單因素優(yōu)化試驗(yàn)

取滅菌后黃精粉末,培養(yǎng)溫度37 ℃,固定條件為:接菌量10%,液料比1∶1(mL∶g),發(fā)酵時(shí)間48 h。設(shè)置各因素梯度分別為:接菌量(5%、10%、15%、20%、25%),液料比(0.75∶1、1∶1、1.25∶1、1.5∶1、1.75∶1,mL∶g),發(fā)酵時(shí)間(12、24、36、48、60 h)。改變以上某種因素,其他條件不發(fā)生改變,考察不同因素對(duì)多糖得率的影響,確定最佳因素水平[12]。

1.4.3 固態(tài)發(fā)酵黃精的響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)

基于上述單因素結(jié)果,進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)。以液料比(A)、接菌量(B)、發(fā)酵時(shí)間(C)為自變量,多糖得率為響應(yīng)值,以得到最佳的提取工藝。響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)因素水平設(shè)計(jì)如表1所示。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)因素與水平Table 1 Factors and levels of response surface test

1.4.4 黃精多糖得率和純度的測(cè)定

黃精多糖得率參考包智影[13]的方法,采用水提醇沉法提取,苯酚-硫酸法測(cè)定;黃精多糖純度參考房雷雷等[14]的方法,采用苯酚-硫酸法測(cè)定吸光度,結(jié)果以葡萄糖含量表示。

1.4.5 柱前衍生法測(cè)定單糖組分

采用柱前衍生法[7],精密稱取3 mg黃精多糖樣品,加入3 mL 2 mol/L三氟乙酸,充氮封管,于120 ℃下酸解4 h。取出后加入甲醇,氮吹干后加3 mL水復(fù)溶,搖勻備用。精確吸取250 μL樣品溶液,加入250 μL 0.6 mol/L NaOH溶液,500 μL 0.4 mol/L PMP-甲醇,70 ℃反應(yīng)1 h。在冷水中冷卻10 min;加入500 μL 0.3 mol/L HCl溶液中和,再加入1 mL氯仿漩渦1 min,3 000 r/min離心10 min,取上清液,萃取3次。色譜條件為:Xtimate C18色譜柱(4.6 mm×200 mm,5 μm),柱溫30 ℃,檢測(cè)波長(zhǎng)250 nm。流動(dòng)相A為乙腈,B為0.05 mol/L KH2PO4溶液(pH 6.70),流速為1.0 mL/min,進(jìn)樣量為20 μL;采用等度洗脫方式。

1.4.6 微觀分析

取適量干燥后SF-PSP和PSP,黏著于附有導(dǎo)電膠帶的樣品臺(tái)上,置于離子濺射儀中鍍一層導(dǎo)電金粉,之后安放在掃描電鏡下觀察,加速電壓2.00 kV,在1 500×和3 000×下進(jìn)行觀察[15]。

1.4.7 熱重分析

稱取SF-PSP和PSP各4 mg,適當(dāng)處理后,使用熱分析儀進(jìn)行熱重掃描,比較兩者結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性的變化。升溫速率10 ℃/min,升溫范圍25～600 ℃,氣氛為N2[16]。

1.4.8 抗氧化活性測(cè)定

1.5 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)分析

采用SPSS 23軟件分析處理數(shù)據(jù),Design-Expert 12進(jìn)行響應(yīng)面設(shè)計(jì)及分析,Origin 2022繪圖,其中P<0.05表示顯著性差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 固態(tài)發(fā)酵黃精菌種的篩選

由圖1可知,與CON組相比,E組多糖得率降低,其他發(fā)酵組多糖得率均顯著提高(P<0.05)。多糖得率低于CON組可能是黃精發(fā)酵體系中代謝產(chǎn)物或其他成分對(duì)菌種的數(shù)量及胞內(nèi)發(fā)生的生化反應(yīng)產(chǎn)生影響,從而出現(xiàn)多糖得率降低的現(xiàn)象[21];多糖得率高于CON組是由于黃精經(jīng)微生物發(fā)酵處理后,使黃精細(xì)胞結(jié)構(gòu)被破壞,胞內(nèi)多糖可以有效溶出,從而提高多糖得率[22]。C組多糖得率最高為6.24%,顯著高于其他組(P<0.05),可能是由于L.paracaseiATCC 334菌種可以很好地適應(yīng)黃精發(fā)酵體系,更適合在發(fā)酵黃精體系中提取多糖。因此,選用L.paracaseiATCC 334作為最佳發(fā)酵菌種,進(jìn)一步探究其發(fā)酵工藝。

圖1 不同菌種發(fā)酵黃精的多糖得率Fig.1 The yield of polysaccharides from P. sibiricum fermented by different strains注:不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)(下同)。

2.2 固態(tài)發(fā)酵黃精單因素試驗(yàn)結(jié)果

由圖2-a可知,當(dāng)接菌量達(dá)到5%時(shí),多糖得率為6.32%,顯著高于其他組(P<0.05),接菌量超過(guò)5%后,多糖得率逐漸下降,可能是由于接菌量過(guò)高,營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)消耗快,不利于菌種生長(zhǎng)繁殖及產(chǎn)生代謝產(chǎn)物;接菌量過(guò)低,菌種生長(zhǎng)緩慢,發(fā)酵時(shí)間延長(zhǎng),易被雜菌污染[23],從而影響多糖得率。由圖2-b可知,液料比為1∶1(mL∶g)時(shí),多糖得率顯著高于其他組(P<0.05),液料比高于1∶1(mL∶g)后,多糖得率開(kāi)始降低,可能是過(guò)多的水分使體系變得黏稠,不利于空氣流通,導(dǎo)致菌種生長(zhǎng)和代謝產(chǎn)物合成緩慢;水分較少,影響菌種的生長(zhǎng)和代謝,影響多糖物質(zhì)溶出[24]。由圖2-c可知,發(fā)酵時(shí)間在12～60 h時(shí),多糖得率先增加后降低,可能是菌種的生長(zhǎng)速率提高,使得合成代謝產(chǎn)物的量也增多;當(dāng)發(fā)酵時(shí)間超過(guò)48 h,推測(cè)是隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng),營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)被消耗,無(wú)法維持菌種的正常生長(zhǎng)代謝,導(dǎo)致產(chǎn)物合成速率下降[25]。因此本研究選擇接菌量1%～10%、液料比0.75∶1～1.25∶1(mL∶g)、36～60 h進(jìn)行后續(xù)固態(tài)發(fā)酵工藝參數(shù)的優(yōu)化。

a-接菌量;b-料液比;c-發(fā)酵時(shí)間圖2 不同發(fā)酵因素對(duì)SF-PSP得率的影響Fig.2 Effect of different fermentation factors on the yield of SF-PSP

2.3 固態(tài)發(fā)酵黃精響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果

2.3.1 響應(yīng)面模型回歸分析

以液料比(A)、接菌量(B)、發(fā)酵時(shí)間(C)為變量,黃精多糖得率為響應(yīng)值,使用Design Expert軟件,Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)果如表2所示。

表2 工藝優(yōu)化Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 2 Process optimization Box-Behnken experimental design and results

試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析后,得出回歸方程為:Y=10.69-0.24A-0.96B+0.65C+0.28AB+0.11AC-0.24BC-1.61A2-3.17B2-1.25C2。

表3 工藝優(yōu)化回歸模型方差分析Table 3 Analysis of variance for process optimization regression model

2.3.2 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

根據(jù)響應(yīng)面預(yù)測(cè)的最優(yōu)參數(shù)為液料比0.98∶1(mL∶g),接菌量4.76%,發(fā)酵時(shí)間51.28 h,考慮到實(shí)驗(yàn)的可操作性,所以將最優(yōu)條件調(diào)整為液料比0.98∶1(mL∶g),接菌量4.80%,發(fā)酵時(shí)間51.30 h,重復(fù)3次實(shí)驗(yàn),得率平均值為(11.14±0.89)%,與預(yù)測(cè)值10.87%相差不大,說(shuō)明通過(guò)該響應(yīng)面優(yōu)化得到的固態(tài)發(fā)酵黃精提取多糖的最佳工藝條件可靠。

2.4 黃精多糖的單糖組成和純度分析

PSP和SF-PSP中單糖變化如圖3所示。

a-PSP單糖組成;b-SF-PSP單糖組成圖3 單糖分析結(jié)果Fig.3 Results of monosaccharide composition

由圖3和表4中可知,PSP和SF-PSP的單糖種類沒(méi)有變化,但單糖含量發(fā)生了較大變化,且SF-PSP中總糖含量增加到(10.225±0.007)%,高于PSP含量[7]。PSP和SF-PSP中甘露糖、半乳糖醛酸、半乳糖和葡萄糖含量較多,核糖、鼠李糖、葡萄糖醛酸、木糖、阿拉伯糖和巖藻糖含量較少。相比于PSP,SF-PSP中核糖、巖藻糖、木糖及葡萄糖含量降低,而鼠李糖、半乳糖醛酸和半乳糖含量分別為(0.119±0.001)%、(0.708±0.001)%、(1.859±0.05)%,均高于PSP含量的4倍。已有研究表明,植物多糖經(jīng)微生物發(fā)酵后,單糖含量會(huì)發(fā)生變化[26]。發(fā)酵后黃精的主要單糖含量變化可能是由于在微生物發(fā)酵的作用下,黃精的葡萄糖和其他含碳物質(zhì)被微生物的生長(zhǎng)代謝所利用,產(chǎn)生其他種類的單糖物質(zhì)[27]。

表4 PSP和SF-PSP中單糖成分含量 單位:%Table 4 Content of monosaccharide components in PSP and SF-PSP

黃精多糖純度采用苯酚-硫酸法測(cè)定,以葡萄糖的質(zhì)量為橫坐標(biāo),以吸光度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程y=0.112x+0.006 4,R2=0.991 8,由此計(jì)算得SF-PSP和PSP純度分別為(85.50±0.99)%和(88.20±0.99)%。

2.5 掃描電子顯微鏡分析

由圖4中可知,PSP和SF-PSP的微觀形態(tài)不均勻,這可能歸因于多糖較強(qiáng)的交聯(lián)聚集。PSP具有清晰可見(jiàn)的聚集塊,表面凹凸不平,結(jié)構(gòu)較為緊密,孔徑不規(guī)則且稀疏。而SF-PSP呈細(xì)碎顆粒狀,表面粗糙不光滑,分布著致密的小孔,結(jié)構(gòu)疏松,該結(jié)構(gòu)使得SF-PSP吸水能力更強(qiáng)。兩種多糖形貌存在差異,推測(cè)是由于發(fā)酵后改變了多糖物質(zhì)的結(jié)構(gòu)分布,這種差異可能會(huì)使多糖的理化特性發(fā)生改變[15]。

a-PSP(1 500×);b-PSP(3 000×);c-SF-PSP(1 500×);d-SF-PSP(3 000×)圖4 多糖的掃描電鏡圖譜Fig.4 Scanning electron microscopy atlas of polysaccharides

2.6 熱重分析

如圖5所示,根據(jù)熱重分析曲線,PSP的熱重曲線分為3個(gè)階段。第一階段從25～172 ℃,樣品損失的質(zhì)量百分比為7.2%,在這一階段中,發(fā)生脫水,去除組分中自由水的含量。從DTG曲線可以看出,多糖的含水量和雜質(zhì)含量較低[28]。該階段損失越少,說(shuō)明多糖保水性能越好[29]。第二階段在172～249 ℃,失重率為28.6%。第三階段在249～600 ℃,失重率為44.3%。后兩個(gè)階段失重是由于多糖組分結(jié)構(gòu)的解聚和熱分解[16]。

a-PSP熱重分析圖;b-SF-PSP熱重分析圖圖5 多糖的熱特性Fig.5 Thermal properties of polysaccharides

SF-PSP與PSP整體趨勢(shì)基本一致,除溫度節(jié)點(diǎn)不同外,可分為4個(gè)階段。第一階段在25～124 ℃,失重率為5.4%,主要是自由水的消失,損失少于PSP,保水性能較好。第二階段和第三階段的溫度分別為124～248 ℃和248～400 ℃,失重率分別為24.76%和34.84%,第四階段溫度為400～600 ℃,失重率在8.06%呈平緩下降趨勢(shì)。后3個(gè)階段失重都是與多糖組分結(jié)構(gòu)的解聚和熱分解有關(guān)[30]。與PSP不同的是,SF-PSP失重率的快速下降分為2個(gè)階段,可能與發(fā)酵后結(jié)構(gòu)的改變有關(guān)。

2.7 體外抗氧化活性

如表5所示,陽(yáng)性對(duì)照品質(zhì)量濃度為2～6 mg/mL時(shí),DPPH自由基清除率、ABTS陽(yáng)離子自由基清除率和亞鐵離子螯合能力均顯著高于兩種多糖的抗氧化效果。SF-PSP的DPPH自由基清除率、ABTS陽(yáng)離子自由基清除率、亞鐵離子螯合能力、總抗氧化性均高于PSP。在2～6 mg/mL時(shí),兩種多糖的抗氧化能力與多糖濃度均呈劑量依賴性。可以看出,SF-PSP在4 mg/mL時(shí),DPPH自由基清除率、亞鐵離子螯合能力及總抗氧化性均高于PSP在6 mg/mL時(shí),SF-PSP的抗氧化效果在濃度較低條件下可以達(dá)到PSP在較高濃度時(shí)候的效果。通過(guò)SPSS 23計(jì)算,PSP對(duì)DPPH自由基和亞鐵離子螯合能力的IC50值分別為15.29 mg/mL和10.55 mg/mL,而SF-PSP的值分別為7.65 mg/mL和4.61 mg/mL,均低于PSP,說(shuō)明SF-PSP在這兩種抗氧化試驗(yàn)之中顯著性高于PSP(P<0.05)。發(fā)酵后多糖的抗氧化能力得到提高,與王若男等[8]研究結(jié)果一致。

表5 不同濃度PSP和SF-PSP的抗氧化能力Table 5 Antioxidant capacity of different concentrations of PSP and SF-PSP

3 結(jié)論

本研究利用7株乳桿菌對(duì)黃精進(jìn)行固態(tài)發(fā)酵,篩選出最佳發(fā)酵菌種為L(zhǎng).paracaseiATCC 334。最佳發(fā)酵工藝為:液料比0.98∶1(mL∶g)、接菌量4.80%、發(fā)酵時(shí)間51.30 h,此條件下多糖得率為(11.14±0.89)%。單糖組成分析發(fā)現(xiàn),PSP和SF-PSP中甘露糖、半乳糖醛酸、半乳糖和葡萄糖含量均較多,發(fā)酵前后單糖組分占比發(fā)生改變。掃描電鏡結(jié)果表明,SF-PSP相比于PSP結(jié)構(gòu)更加疏松,小孔更加致密。熱重分析結(jié)果表明,SF-PSP相比于PSP保水能力更強(qiáng)。體外抗氧化活性表明,SF-PSP抗氧化性能顯著高于PSP。本試驗(yàn)對(duì)微生物固態(tài)發(fā)酵法提取黃精多糖進(jìn)行了工藝優(yōu)化,對(duì)黃精多糖的理化特性表征以及抗氧化活性進(jìn)行分析,以期為黃精資源的綜合開(kāi)發(fā)利用提供理論參考。