林良才,梁夢(mèng)帆,杜榮菲,鄭佳,肖冬婷,張煜行,彭志云,張翠英*

1(天津科技大學(xué) 生物工程學(xué)院,天津,300457)2(河北衡水老白干釀酒(集團(tuán))有限公司博士后科研工作站,河北 衡水,053000)3(宜賓五糧液股份有限公司,中國(guó)輕工業(yè)濃香型白酒固態(tài)發(fā)酵重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,四川 宜賓,644000)

白酒是世界六大蒸餾酒之一,是我國(guó)特有的傳統(tǒng)發(fā)酵食品,具有悠久的歷史[1]。與世界上其他蒸餾酒以醇香為主不同,我國(guó)白酒以酯香為主,酯類香氣物質(zhì)是構(gòu)成酒體風(fēng)味的重要成分[2]。其中,短鏈脂肪酸酯(如乙酸乙酯、乳酸乙酯、丁酸乙酯、己酸乙酯)占白酒中酯類物質(zhì)含量90%以上[3]。白酒中短鏈脂肪酸酯主要是由4條途徑共同作用的結(jié)果,一是原料帶入,如小麥中含有少量的乙酸乙酯[4-5];二是發(fā)酵、蒸餾或貯存過(guò)程中酸醇自身酯化反應(yīng)合成[6];三是微生物代謝合成,如醇?；D(zhuǎn)移酶的乙酸酯合成代謝途徑[7-9];四是基于酯化酶的酶促反應(yīng)途徑[10],如窖泥菌群在厭氧條件下代謝合成的己酸和丁酸與酒醅中酵母菌群合成的乙醇在酯化酶的作用下生成已酸乙酯和丁酸乙酯。由此可見,酶促反應(yīng)途徑是濃香型白酒主體香氣成分己酸乙酯的主要來(lái)源。優(yōu)質(zhì)的濃香型白酒通常需要延長(zhǎng)釀造周期來(lái)增加底物(已酸、丁酸、乙醇)和酯化酶的反應(yīng)時(shí)間,從而獲得更多的短鏈脂肪酸酯類物質(zhì)[11]。而在釀造過(guò)程中引入酯化酶,不僅能夠提升白酒品質(zhì),還可提高原料利用率、縮短發(fā)酵周期、增加企業(yè)的利潤(rùn)和市場(chǎng)競(jìng)爭(zhēng)力。

釀造用酯化酶主要是指可以催化有機(jī)酸和醇類物質(zhì)合成酯類的酶,同時(shí)也具有羧酯鍵水解催化活性[12]。在白酒釀造微生態(tài)體系中的酵母、霉菌和細(xì)菌都含有脂肪酶等酯化酶基因,具有一定的酯化能力[13]。然而,白酒偏酸性的釀造微環(huán)境限制了細(xì)菌中中性或堿性酯化酶的應(yīng)用,酵母和霉菌的酯化酶在白酒釀造過(guò)程中發(fā)揮了重要的作用(如南極假絲酵母、紅曲霉、黑曲霉和煙曲霉等)[14]。盡管前期的研究表明,利用紅曲霉等霉菌制備的酯化酶粗制劑可以有效提高釀造體系中短鏈脂肪酸酯的含量[15],但并未闡明是哪一種酯化酶參與其中。隨著組學(xué)技術(shù)的發(fā)展,新型酯化催化元件的挖掘和催化性能表征已成為研究熱點(diǎn)。北京工商大學(xué)孫寶國(guó)院士團(tuán)隊(duì)利用多組學(xué)聯(lián)用技術(shù)從紅曲霉YJX-8中篩選獲得能有效在水相中催化合成脂肪酸乙酯的脂肪酶LIP05,并對(duì)其催化機(jī)制進(jìn)行了解析[16-17]。天津科技大學(xué)王正祥教授團(tuán)隊(duì)對(duì)黑曲霉中35個(gè)脂肪酶基因進(jìn)行了表征,獲得了一個(gè)具有丁酸酯合成偏好的新型脂肪酶[18]。除了脂肪酶之外,角質(zhì)酶也被發(fā)現(xiàn)在酸性條件下具有很好的酯化能力。江南大學(xué)吳敬教授團(tuán)隊(duì)從嗜熱放線菌(Thermobifidafusca)中克隆獲得具有高效短鏈酯合成能力的角質(zhì)酶基因[19]。江正強(qiáng)教授團(tuán)隊(duì)從太瑞斯梭孢殼霉(Thielaviaterrestris)中篩選獲得一個(gè)具有較高合成丁酸酯活性的角質(zhì)酶,而且該蛋白具有良好的耐酸性能,在pH 2.5的條件下,仍能保留80%以上的酶活性[20]。此外,嗜熱霉菌Malbrancheacinnamomea中的角質(zhì)酶McCut可以高效合成丁酸丁酯[21]。角質(zhì)酶在黑曲霉、紅曲霉等釀造用霉菌中普遍存在,由此推斷其可能在風(fēng)味酯的合成反應(yīng)中扮演著極為重要的角色。

目前關(guān)于角質(zhì)酶的研究多集中在非水相體系中,而白酒釀造體系屬于水相體系[22]。往往通過(guò)非水相體系篩選獲得的高效酯化酶制劑在水相條件下催化性能很差,不能滿足生產(chǎn)應(yīng)用的需求。因此,需要特異性的篩選在水相條件下具有較好酯化能力的角質(zhì)酶元件。此外,釀造用酯化酶的研究多以脂肪酶為主,而釀造體系中霉菌角質(zhì)酶在短鏈脂肪酸酯生成中的作用卻鮮有報(bào)道。根據(jù)白酒釀造體系特點(diǎn),本文從白酒發(fā)酵體系中主要霉菌出發(fā),利用大腸桿菌異源表達(dá)9個(gè)具有潛在酯合成能力的角質(zhì)酶基因,并在水相條件下探究它們合成短鏈脂肪酸酯的催化能力和特性,為厘清白酒釀造體系酯化反應(yīng)機(jī)制提供了全新的視角,同時(shí)也為選育適用于白酒體系的具有高效酯化生香能力的菌株提供了新的策略。

1 材料與方法

1.1 菌株與質(zhì)粒

大腸桿菌(Escherichiacoli) DH5α和BL21(DE3)及質(zhì)粒pET22(b)和pET32(a)均為本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 主要試劑

限制性內(nèi)切酶、LA DNA 聚合酶,大連寶生物工程有限公司;同源重組酶、質(zhì)粒小量提取試劑盒、DNA產(chǎn)物純化回收試劑盒,南京諾唯贊生物科技有限公司;異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside,IPTG)、卡那霉素、氨芐霉素、BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒,北京索萊寶科技有限公司;Ni柱,GE公司;10 kDa超濾管,Millipore公司;丁酸、戊酸、己酸、庚酸、辛酸,Aladdin;其他生化試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純,天津市江天化工技術(shù)有限公司。

1.3 重組菌株的構(gòu)建與表達(dá)

根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中角質(zhì)酶基因序列,去掉信號(hào)肽,并根據(jù)大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)進(jìn)行密碼子優(yōu)化。合成后的片段用PCR技術(shù)連接至質(zhì)粒pET22(b)或pET32(a)上,將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至E.coliDH5α中,提取質(zhì)粒,測(cè)序驗(yàn)證正確后,轉(zhuǎn)化至宿主菌BL21(DE3),并進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。將重組菌株在含抗生素(100 mg/mL)的液體LB培養(yǎng)基中37 ℃培養(yǎng)至OD600值為0.6～0.8,加入IPTG至終濃度0.1 mmol/L,在16 ℃、180 r/min條件下誘導(dǎo)20 h,4 ℃離心收集菌體,用適量的100 mmol/L Tris-HCl(pH 8.0)緩沖液重懸菌體,隨后將裝有菌懸液的離心管置于冰水混合物中,利用超聲波破碎儀破碎細(xì)胞[23-24],將離心收集的上清液經(jīng)過(guò)Ni柱洗脫后,用超濾管進(jìn)行脫鹽、濃縮,所得純酶液用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。蛋白濃度用BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒測(cè)定。

1.4 角質(zhì)酶活力的測(cè)定

在酶促反應(yīng)條件下,1 min內(nèi)生成1 μmol丁酸乙酯或己酸乙酯所需的酶量定義為1個(gè)酶活力單位(U)。根據(jù)產(chǎn)物與外標(biāo)峰面積之比計(jì)算產(chǎn)物的含量。

1.5 角質(zhì)酶水相催化生成酯類

水相反應(yīng)體系包含100 μL酶液,10 mmol/L有機(jī)酸(丁酸、戊酸、己酸、庚酸、辛酸)以及終濃度為1 mol/L的乙醇,加入到檸檬酸緩沖液中(50 mmol/L,pH 4.0)至終體積為1 mL,以不加酶液的反應(yīng)體系為對(duì)照組。將上述混合反應(yīng)液在30 ℃以150 r/min的轉(zhuǎn)速反應(yīng)24 h。此后向反應(yīng)混合物中加入1 mL正己烷,劇烈渦旋30 s,10 000 r/min離心2 min,將上層即正己烷層過(guò)濾后進(jìn)行氣相色譜分析。

1.6 氣相色譜的檢測(cè)

氣相色譜檢測(cè)條件:色譜柱Agilent HP-INNOWAX(30 m×320 μm×0.25 μm),載氣為高純N2(>99.999%);柱流速0.8 mL/min;檢測(cè)器溫度150 ℃;進(jìn)樣口溫度200 ℃;程序升溫:起始溫度50 ℃,保持8 min,以5 ℃/min升至150 ℃,保持15 min;進(jìn)樣體積為1 μL;分流進(jìn)樣,分流比為10∶1。

1.7 角質(zhì)酶酶學(xué)特性分析

按照1.5節(jié)的方法,對(duì)角質(zhì)酶進(jìn)行酶學(xué)特性分析,以最高酶活力定義為100%計(jì)算相對(duì)酶活力。

(1)溫度對(duì)角質(zhì)酶酶活力的影響:水相反應(yīng)體系在20～50 ℃反應(yīng)24 h后檢測(cè)生成丁酸乙酯和己酸乙酯的含量,計(jì)算相對(duì)酶活力,每隔10 ℃為檢測(cè)點(diǎn)。

(2)pH對(duì)角質(zhì)酶酶活力的影響:將純酶液添加到不同pH(2～5)的50 mmol/L的檸檬酸鈉緩沖液中反應(yīng)24 h后檢測(cè)生成丁酸乙酯和己酸乙酯的含量,計(jì)算相對(duì)酶活力。

1.8 角質(zhì)酶水相催化合成酯的條件優(yōu)化

按照1.5節(jié)反應(yīng)體系測(cè)定酯含量,計(jì)算相對(duì)酶活力。

1.8.1 最佳反應(yīng)時(shí)間的確定

測(cè)定角質(zhì)酶在水相中催化合成丁酸乙酯和己酸乙酯的含量,反應(yīng)時(shí)間分別為6、12、18、24、30 h。

1.8.2 最佳酸醇比的確定

測(cè)定角質(zhì)酶在水相中催化合成丁酸乙酯和己酸乙酯的含量,乙醇的量保持不變,僅改變丁酸或己酸的含量。丁酸和乙醇的摩爾比分別為0.5∶100、1∶100、1.5∶100、2∶100、2.5∶100和3∶100,己酸和乙醇的摩爾比分別為0.5∶100、1∶100、2∶100、3∶100、4∶100、5∶100、6∶100、7∶100和8∶100。

2 結(jié)果與分析

2.1 霉菌角質(zhì)酶的挖掘

紫紅曲霉、黃曲霉和煙曲霉是白酒釀造體系中常見的霉菌,根據(jù)JGI霉菌數(shù)據(jù)庫(kù)(https://mycocosm.jgi.doe.gov),通過(guò)基因注釋檢索,獲得9個(gè)編碼角質(zhì)酶的基因(表1),并將其作為后續(xù)的研究對(duì)象。

表1 角質(zhì)酶的基本信息Table 1 The basic information of cutinase genes

2.2 角質(zhì)酶重組菌株的構(gòu)建及誘導(dǎo)表達(dá)

以密碼子優(yōu)化后的帶有目的基因的重組質(zhì)粒為模板擴(kuò)增上述9個(gè)角質(zhì)酶基因(圖1),按照1.3節(jié)的方法構(gòu)建質(zhì)粒pET22(b)-cutinase,依次轉(zhuǎn)入E.coli.BL21(DE3)中表達(dá)蛋白,結(jié)果表明只有MPCUT-1能成功表達(dá),蛋白分子質(zhì)量為26.73 kDa,如圖2-a所示。為了獲得可溶性重組蛋白,其余8個(gè)角質(zhì)酶基因插入到載體pET32(a)中,構(gòu)建質(zhì)粒pET32(a)-cutinase。依次轉(zhuǎn)入E.coli.BL21(DE3)中,并進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá),如圖2-b和圖2-c所示,除AFLACUT-3和AFUACUT-3之外,6個(gè)角質(zhì)酶均獲得可溶性表達(dá),重組蛋白條帶大小與其理論分子質(zhì)量相符。這些結(jié)果表明pET32(a)更適合用于表達(dá)霉菌角質(zhì)酶蛋白。

M-Maker;泳道1～9分別為AFUACUT-4、AFUACUT-3、AFUACUT-2、AFUACUT-1、AFLACUT-3、AFLACUT-2、AFLACUT-1、MPCUT-2、MPCUT-1圖1 PCR擴(kuò)增角質(zhì)酶全長(zhǎng)基因Fig.1 PCR amplification of the fungal cutinases gene

圖2 角質(zhì)酶在大腸桿菌中的表達(dá)Fig.2 The expression of fungal cutinases in E.coli

2.3 角質(zhì)酶的分離純化

7個(gè)重組菌株經(jīng)過(guò)IPTG誘導(dǎo)后超聲波破碎,在4 ℃、12 000 r/min條件下離心,將所獲得的含有重組蛋白的上清液過(guò)Ni柱,并用不同咪唑濃度洗脫,洗脫液進(jìn)行SDS-PAGE檢測(cè),進(jìn)而確定最適洗脫濃度。結(jié)果如圖3所示,MPCUT-1和AFUACUT-1的最適咪唑洗脫濃度為500 mmol/L,MPCUT-2、AFLACUT-1、AFLACUT-2和AFUACUT-2的最適咪唑洗脫濃度為200 mmol/L,而AFUACUT-4的最適咪唑洗脫濃度為100 mmol/L。后續(xù)實(shí)驗(yàn)使用最適的咪唑濃度純化目的蛋白,然后利用超濾管進(jìn)行脫鹽、濃縮得到純酶液。

M-Maker;a-MPCUT-1(泳道1～4:破碎后上清液、穿出樣品、20 mmol/L咪唑洗脫液、500 mmol/L咪唑洗脫液);b-MPCUT-2(泳道1～7:破碎后上清液、穿出樣品、20、60、100、200、500 mmol/L咪唑洗脫液);c-AFLACUT-1(泳道1～6:穿出樣品、20、60、100、200、500 mmol/L咪唑洗脫液);d-AFLACUT-2(泳道1～7:破碎后上清液、穿出樣品、20、60、100、200、500 mmol/L咪唑洗脫液);e-AFUACUT-1(泳道1～7:破碎后上清液、穿出樣品、20、60、100、200、500 mmol/L咪唑洗脫液);f-AFUACUT-2(泳道1～6:穿出樣品、20、60、100、200、500 mmol/L咪唑洗脫液); g-AFUACUT-4(泳道1～7:破碎后上清液、穿出樣品、20、60、100、200、500 mmol/L咪唑洗脫液)圖3 不同濃度的咪唑洗脫純化角質(zhì)酶Fig.3 Purification of fungal cutinases with different concentrations of imidazole

2.4 霉菌角質(zhì)酶在水相中合成風(fēng)味酯的研究

為了考察霉菌角質(zhì)酶在水相合成短鏈脂肪酸酯的能力,按1.5節(jié)所述方法,在反應(yīng)體系中只加丁酸、戊酸、己酸、庚酸或辛酸中的一種短鏈脂肪酸,反應(yīng)24 h后,結(jié)果如圖4所示。由于酸和醇存在自發(fā)的化學(xué)反應(yīng),因此,以不加酶液為對(duì)照,與對(duì)照相比,角質(zhì)酶MPCUT-1、AFLACUT-1、AFLACUT-2、AFUACUT-1、AFUACUT-2和AFUACUT-4在酸性水相條件下都具有較好的催化合成短鏈脂肪酸酯的能力,而且催化長(zhǎng)鏈酸與乙醇合成酯的能力都要明顯高于短鏈酸(辛酸>庚酸>己酸>戊酸>丁酸),而角質(zhì)酶MPCUT-2僅可以微量催化合成辛酸乙酯。由此可見,不同霉菌角質(zhì)酶在水相條件下催化合成短鏈脂肪酸酯的能力具有顯著差異。

圖4 不同霉菌角質(zhì)酶在水相中催化風(fēng)味酯能力的比較Fig.4 Synthesis of esters catalyzed by different fungal cutinases in aqueous phase

在實(shí)際白酒發(fā)酵體系中,釀造微環(huán)境中含有多種短鏈脂肪酸(如丁酸、己酸等),因此研究考察了霉菌角質(zhì)酶在混酸條件下對(duì)底物的偏好性。在反應(yīng)體系中同時(shí)加入丁酸、戊酸、己酸、庚酸、辛酸后,在30 ℃條件下反應(yīng)24 h,結(jié)果如圖5所示。

圖5 不同霉菌角質(zhì)酶水相混酸條件下催化合成風(fēng)味酯能力的比較Fig.5 Comparison of catalytic synthesis of flavor esters by different fungal cutinase under aqueous mixed acid conditions

角質(zhì)酶MPCUT-2、AFLCUT-1和AFUACUT-1在混酸條件下催化合成短鏈脂肪酸酯的能力較弱,其酯化能力顯著低于單酸條件,這種現(xiàn)象在AFUACUT-1上表現(xiàn)最為明顯,這意味著這些霉菌角質(zhì)酶耐酸性能較差,其催化性能易受pH波動(dòng)影響,不適用于實(shí)際生產(chǎn)應(yīng)用。除此之外,其他霉菌角質(zhì)酶在混酸條件下都表現(xiàn)出較好的合成短鏈脂肪酸酯的能力,且隨著碳鏈的增長(zhǎng),風(fēng)味酯的含量增高,如AFLACUT-2可在混酸條件下24 h合成68.15 mg/L丁酸乙酯、214.05 mg/L戊酸乙酯、715.3 mg/L己酸乙酯、1 342.65 mg/L庚酸乙酯和1 842.96 mg/L辛酸乙酯,這意味著角質(zhì)酶水相條件下催化合成短鏈脂肪酸酯的偏好性與短鏈脂肪酸的疏水性密切相關(guān)。此外,不同霉菌角質(zhì)酶在混酸條件下催化合成各種短鏈脂肪酸酯的比例不同,如AFUACUT-2和AFUACUT-4在混酸條件下對(duì)不同短鏈脂肪酸的催化能力較為均一,而AFLACUT-2在混酸條件下對(duì)不同短鏈脂肪酸的催化能力差異較大,這暗示著其在混酸條件下對(duì)底物具有明顯的偏好性,有利于定向調(diào)控風(fēng)味酯的合成。綜上所述,選擇角質(zhì)酶AFLACUT-2作為后續(xù)的研究對(duì)象。

2.5 角質(zhì)酶AFLACUT-2酶學(xué)特性分析

按照1.7節(jié)的方法,測(cè)定角質(zhì)酶AFLACUT-2的最適反應(yīng)溫度和最適pH。由圖6-a可知,AFLACUT-2的酶活力隨著溫度的升高而升高,當(dāng)溫度達(dá)到30 ℃時(shí),酶活力達(dá)到最高,之后隨著溫度的升高酶活力降低。值得注意的是,當(dāng)溫度達(dá)到40 ℃時(shí),以丁酸為底物,角質(zhì)酶AFLACUT-2酶活顯著降低,相對(duì)酶活力僅為30 ℃時(shí)酶活力的35.1%,但以已酸為底物時(shí),相對(duì)酶活力為88.9%,僅下降了11.1%。由此推斷,可以通過(guò)調(diào)節(jié)酯化反應(yīng)溫度來(lái)實(shí)現(xiàn)特定短鏈脂肪酸酯的合成,進(jìn)而實(shí)現(xiàn)風(fēng)味酯的定向調(diào)控,對(duì)提升基酒品質(zhì)具有重要的應(yīng)用價(jià)值。由圖6-b可知,在pH 2～4,隨著pH的升高,角質(zhì)酶AFLACUT-2的酶活力升高,pH 4時(shí),酶活力最高,之后隨著pH的升高酶活力降低,在pH 3～5,酶活力保持在60%以上,說(shuō)明角質(zhì)酶AFLACUT-2具有較好的耐酸性能,完全滿足在白酒發(fā)酵體系中應(yīng)用的要求。

a-最適溫度;b-最適pH圖6 AFLACUT-2的最適溫度和最適pHFig.6 The optimum temperature and optimum pH of AFLACUT-2

2.6 角質(zhì)酶AFLACUT-2催化合成酯條件的優(yōu)化

為進(jìn)一步優(yōu)化反應(yīng)體系,通過(guò)測(cè)定角質(zhì)酶AFLACUT-2在水相中催化丁酸和乙醇生成丁酸乙酯的含量,確定反應(yīng)的最佳時(shí)間和最佳酸醇比。以24 h時(shí)的酶活力定為100%,其他條件下的酶活力為相對(duì)酶活力。圖7-a表明角質(zhì)酶AFLACUT-2催化合成丁酸乙酯的最佳反應(yīng)時(shí)間為24 h;以酸醇摩爾比為1∶100時(shí)的酶活力為100%,圖7-b表明隨著酸濃度的升高,相對(duì)酶活力升高,當(dāng)酸與醇的比例為2∶100時(shí),相對(duì)酶活力達(dá)到最高,之后隨著酸濃度的升高,酶活力降低。因此,過(guò)多的丁酸可能會(huì)使反應(yīng)體系的pH降低,導(dǎo)致酶的構(gòu)象發(fā)生變化,從而影響角質(zhì)酶AFLACUT-2的催化活性。

a-最佳反應(yīng)時(shí)間;b-最佳酸醇摩爾比圖7 反應(yīng)時(shí)間和酸醇摩爾比對(duì)AFLACUT-2在水相中催化生成丁酸乙酯的影響Fig.7 Effect of reaction time and molar ratio of acid to alcohol on the catalytic formation of ethyl butyrate by AFLACUT-2 in aqueous phase

通過(guò)測(cè)定角質(zhì)酶AFLACUT-2在水相中催化己酸和乙醇生成己酸乙酯的含量,確定反應(yīng)的最佳時(shí)間和最佳酸醇比。以24 h時(shí)的酶活力為100%,其他條件下的酶活力為相對(duì)酶活力,從圖8-a可知角質(zhì)酶AFLACUT-2催化合成己酸乙酯的最佳反應(yīng)時(shí)間為18 h,相對(duì)酶活力達(dá)到151.23%,這意味著通過(guò)控制酯化反應(yīng)時(shí)間可以調(diào)控混酸條件下風(fēng)味酯合成的比例。以酸醇摩爾比為1∶100時(shí)的酶活力為100%,從圖8-b中可知隨著酸濃度的升高,相對(duì)酶活力升高,當(dāng)酸醇摩爾比為5∶100時(shí),相對(duì)酶活力最高,說(shuō)明增加己酸的濃度有利于角質(zhì)酶AFLACUT-2催化合成己酸,該酶對(duì)己酸的耐受性優(yōu)于丁酸。

a-反應(yīng)最佳時(shí)間;b-最佳酸醇摩爾比圖8 最佳反應(yīng)時(shí)間和酸醇摩爾比對(duì)AFLACUT-2在水相中催化生成己酸乙酯的影響Fig.8 Effect of reaction time and molar ratio of acid to alcohol on the catalytic formation of ethyl caproate by AFLACUT-2 in aqueous phase

3 結(jié)論

短鏈脂肪酸酯是白酒中重要的風(fēng)味物質(zhì),其含量和比例與白酒品質(zhì)密切相關(guān)?？茖W(xué)闡明白酒釀造體系中短鏈脂肪酸酯合成機(jī)制,深度挖掘高效催化元件,對(duì)解析白酒風(fēng)味合成奧秘和品質(zhì)提升具有重要意義?；诖?本文以白酒釀造過(guò)程中常見霉菌中的角質(zhì)酶為研究對(duì)象,利用E.coli表達(dá)體系成功實(shí)現(xiàn)7個(gè)霉菌角質(zhì)酶的可溶性表達(dá),進(jìn)而對(duì)這些角質(zhì)酶在混酸和單酸條件下催化合成短鏈脂肪酸酯的能力進(jìn)行表征。結(jié)果發(fā)現(xiàn)霉菌角質(zhì)酶在水相中催化合成短鏈脂肪酸酯的活力與短鏈脂肪酸酯的疏水性成正相關(guān)。單酸和混酸條件下催化活力分析表明AFLACUT-2更適合用于白酒酯化生香過(guò)程。進(jìn)一步酶學(xué)性質(zhì)分析結(jié)果表明,AFLACUT-2的最適pH值為4,最適反應(yīng)溫度為30 ℃,與白酒酒醅微環(huán)境pH和溫度相一致。此外,反應(yīng)體系優(yōu)化實(shí)驗(yàn)證實(shí)通過(guò)調(diào)控反應(yīng)溫度、反應(yīng)時(shí)間和酸醇比可以實(shí)現(xiàn)短鏈脂肪酸酯合成的定向調(diào)控。這些結(jié)果不僅豐富了對(duì)白酒短鏈脂肪酸酯合成機(jī)制的理解,還為基于酶促反應(yīng)的白酒酯化生香提供了新的策略和思路。