李金星,古治容,吳 柳,鐘淋莉,黃 敏

炎癥性腸病(IBD)是一組非特異性慢性胃腸道炎癥性疾病,包括潰瘍性結(jié)腸炎(UC)、克羅恩病(CD)[1-2]。近年來,IBD的發(fā)病率在新興工業(yè)化國家不斷上升[3],嚴(yán)重?fù)p傷了人類健康,造成了巨大的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。IBD被公認(rèn)為是遺傳、環(huán)境及免疫等多種因素綜合作用的結(jié)果[4-5]。而食物攝入是影響IBD發(fā)展的重要環(huán)境因素[6]。遺傳易感個(gè)體的腸道微生態(tài)失調(diào)與異常免疫反應(yīng)相結(jié)合[7],這一過程可能由包括飲食在內(nèi)的環(huán)境因素的變化引發(fā)并維持[8]。地中海飲食是一種以富含不飽和脂肪酸的橄欖油為主要脂肪攝入的可持續(xù)健康飲食模式,富含抗氧化劑、維生素,有利于炎癥標(biāo)志物的減少,被認(rèn)為有助于預(yù)防和管理腸道疾病[9-10]。有流行病學(xué)研究報(bào)道稱,其含有大量酚類化合物,能提供天然的抗氧化劑和維生素[11-12],降低代謝綜合征的發(fā)病率[13]。之前的研究已經(jīng)探索了部分食物與IBD之間的關(guān)系,但由于大多數(shù)證據(jù)來自于觀察性研究,其結(jié)果可能會(huì)受到混淆因素的影響,難以推斷飲食與IBD的因果關(guān)系[14-15]。

孟德爾隨機(jī)化(MR)是一種遺傳流行病學(xué)方法,能夠克服觀察性研究的方法學(xué)局限性,目前已被廣泛應(yīng)用于因果推論。它利用單核苷酸多態(tài)性(SNPs)作為工具變量,來調(diào)查暴露和結(jié)局是否具有因果關(guān)系,并排除混淆因素的影響[16-17]。探究地中海飲食模式對于IBD的影響,對于開發(fā)非藥物干預(yù)手段具有重要意義。本研究使用兩樣本MR法,旨在探索地中海飲食與發(fā)生IBD風(fēng)險(xiǎn)的因果關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 研究設(shè)計(jì)

本研究將地中海飲食作為暴露因素,潰瘍性結(jié)腸炎或(和)克羅恩病作為結(jié)局。使用與地中海飲食強(qiáng)相關(guān)的SNPs作為工具變量(instrumental variables,IVs)。MR滿足以下3 個(gè)重要假設(shè)[18]:1)工具變量與暴露因素強(qiáng)相關(guān);2)工具變量僅通過暴露因素影響結(jié)局;3)工具變量與混雜因素相互獨(dú)立。見圖1。

圖1 兩樣本MR模型

1.2 資料來源

暴露共包括23種變量,分別是烘焙培豆、蠶豆、綠豆、全麥面包、其他谷物、谷物、熟蔬菜、生蔬菜、干果、混合水果、藍(lán)紋奶酪、奶酪、油性魚類、咸味花生、單不飽和脂肪酸、多不飽和脂肪酸、周平均葡萄酒、周平均紅酒、肉類消費(fèi)、甜品、隨餐飲酒、低脂橄欖油、全脂牛奶。上述變量通過https://gwas.mrcieu.ac.uk/和http://www.nealelab.is/uk-biobank的全基因組關(guān)聯(lián)研究(genome-wide association study,GWAS)獲取數(shù)據(jù),均為歐洲人口。結(jié)局共包括2種變量,分別是克羅恩病,潰瘍性結(jié)腸炎。通過https://www.ebi.ac.uk/gwas/downloads/summary-statistics獲取數(shù)據(jù),均為混合人口。

1.3 遺傳工具變量篩選

對23種食物采用了統(tǒng)一的入選標(biāo)準(zhǔn)。選擇具有全基因組意義的標(biāo)準(zhǔn)閾值(P<510-8)作為入選條件,若SNPs幾乎為0則放寬閾值(P=110-6)[19],并設(shè)置參數(shù)r2為0.001,距離為10 000 kb,以避免SNP存在連鎖不平衡(linkage disequilibrium,LD)。此外,使用F值統(tǒng)計(jì)量用于評價(jià)工具變量的強(qiáng)度,F>10說明無弱工具偏倚[20]。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析

本MR研究主要采用3種MR分析方法,包括逆方差加權(quán)(IVW),MR-Egger和加權(quán)中位數(shù)[21](Weighted median)。使用比值比法獲取個(gè)體SNP的估計(jì)值,隨后使用IVW法匯總比率估計(jì)值,并得出IVW效應(yīng)估計(jì)值[22]。以IVW為主要分析方法,其余兩種方法作為輔助補(bǔ)充,當(dāng)所得結(jié)果出現(xiàn)矛盾時(shí),以IVW結(jié)果為標(biāo)準(zhǔn)[23]。使用MRPESSO[24]進(jìn)行離群值檢驗(yàn),若出現(xiàn)離群值則剔除相應(yīng)SNP并重新進(jìn)行MR分析。隨后使用Cochran′s Q值進(jìn)行異質(zhì)性檢驗(yàn)(P<0.05),當(dāng)檢測到異常值時(shí),同樣進(jìn)行剔除[25]。采用MR-Egger檢驗(yàn)評估工具變量水平多效性。最后,使用了留一法(Leave-one-out sensitivity test)用于逐個(gè)剔除IV后計(jì)算剩下IV的MR結(jié)果,并繪制了森林圖。所有統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)分析均在R(4.2.1)完成,均使用R軟件包“TwoSampleMR”和“MRPRESSO”。顯著性閾值為P<0.05。

2 結(jié)果

2.1 工具變量

根據(jù)篩選標(biāo)準(zhǔn),共納入502個(gè)工具變量。納入研究的工具變量F值為19～91,表明結(jié)果不太可能受到弱工具變量的影響。表1展示了部分地中海食物SNPs的具體信息。

表1 地中海食物對應(yīng)工具變量信息

2.2 地中海食物與IBD因果關(guān)系的兩樣本孟德爾隨機(jī)化結(jié)果

表2總結(jié)了在兩樣本MR分析中使用3種不同的MR方法估計(jì)地中海食物與IBD之間的關(guān)系。分析結(jié)果以IVW法為準(zhǔn)。IVW法分析表明CD風(fēng)險(xiǎn)與谷物[OR=2.226,95%CI(1.003,4.940),P=0.049]、全脂牛奶[OR=0.015,95%CI(2.664,0.865),P=0.042],以及甜品攝入[OR=0.511,95%CI(0.278,0.942),P=0.031]存在因果關(guān)系。但未在其余兩種MR方法中找到類似結(jié)果。此外,在MRE法中發(fā)現(xiàn)干燥水果、全脂牛奶對UC起著保護(hù)作用。在WM法中,多不飽和脂肪酸,奶酪對CD有著類似作用。

表2 地中海食物3種MR分析方法部分回歸結(jié)果

2.3 敏感性分析

使用MRE回歸檢測水平多效性,驗(yàn)證單個(gè)基因是否影響多種表型。結(jié)果顯示截距接近0(P=0.777,egger-intercept=0.007),表明水平多效性不會(huì)對MR分析結(jié)果造成影響(見圖2)。通過MR-PRESSO全局檢驗(yàn),進(jìn)行離群值檢測得到了類似的結(jié)果(見圖3)。異質(zhì)性檢驗(yàn)采用MRE和IVW法,并使用Cochran′s Q檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)標(biāo)準(zhǔn)化,結(jié)果顯示所納入的IV具有異質(zhì)性(均P<0.05)。此外,利用“留一法”進(jìn)行敏感性分析,通過逐個(gè)剔除非特異性SNPs,對結(jié)果重新分析來檢驗(yàn)結(jié)果的穩(wěn)定性,并繪制為森林圖進(jìn)行直觀判斷。結(jié)果顯示MR分析較為穩(wěn)健(見圖4)。

圖2 地中海食物與IBD之間MR分析散點(diǎn)圖

圖3 地中海食物與IBD之間MR分析漏斗圖

圖4 地中海食物與IBD之間MR分析森林圖

3 討論

環(huán)境因素,尤其是飲食在IBD的發(fā)展中起著重要作用。堅(jiān)持地中海飲食會(huì)對腸道微生物生態(tài)系統(tǒng)產(chǎn)生積極影響,并在免疫和代謝穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮作用[11]。飲食和腸道微生物群之間的雙向相互作用可能作為治療和預(yù)防因素參與IBD。本研究采用MR分析,探究了23種地中海食物與IBD之間的因果關(guān)系,確定谷物,全脂牛奶,甜品攝入與CD具有潛在的因果關(guān)系。

Zhang等[26]設(shè)計(jì)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?其發(fā)現(xiàn)經(jīng)小米喂養(yǎng)的小鼠中,降低了其促炎細(xì)胞因子IL-17、IL-6和TNF-α的水平。也有前瞻性研究表明,谷物攝入與UC發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)無關(guān)[27]。谷物對于IBD病人是否有益處是具有爭議的。研究發(fā)現(xiàn),谷物攝入是IBD的危險(xiǎn)性因素,這與Chen等[28]研究結(jié)果一致。谷物為個(gè)別病人最常見的不耐受飲食,會(huì)擾亂Atopobiaceae菌屬的豐度,而Atopobiaceae作為放線菌屬參與了丁酸的生產(chǎn)[29-30]。丁酸為一種短鏈脂肪酸(SCFA)能促進(jìn)雙歧桿菌和乳酸桿菌在腸道中的生長[31]。NF-κB在炎癥反應(yīng)中有著重要作用,MAPK為NF-KB的上游調(diào)控因子,而丁酸則能抑制NF-KB和MAPK通路[32]。也有證據(jù)表明丁酸可能通過NRF2信號通路,調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激,從而減少腸道中性粒細(xì)胞或(和)巨噬細(xì)胞產(chǎn)生的活性氧[33]。此外,MacDermott[34]發(fā)現(xiàn)食用谷物面包可誘發(fā)病人出現(xiàn)腸易激綜合征。這表明丁酸具有抗炎特性,對炎癥因子及通路有著抑制作用,而食用谷物可能會(huì)減少丁酸,從而加速炎癥進(jìn)程。

全脂牛奶中的成分可能參與了促炎細(xì)胞因子的下調(diào)。牛奶中含有短鏈和中鏈脂肪酸,能調(diào)節(jié)脂肪組織因子。而脂肪在炎癥調(diào)節(jié)中起著主要作用,抑制炎癥細(xì)胞因子包括TNF-α、IL-1β、IL-6[35]。此外,乳鐵蛋白也可通過調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞的募集和激活而發(fā)揮抗炎作用,并通過乳制品中的生物活性肽抑制血管緊張Ⅱ的產(chǎn)生,從而減少炎癥細(xì)胞因子[36]。綜上所述,全脂牛奶富含脂肪酸,有助于其適應(yīng)性免疫反應(yīng)的調(diào)節(jié)[37]。

此外,我們的MR分析表明,甜品攝入是CD的保護(hù)性因素。這可能是因?yàn)樘鹌分泻腥斯ぬ鹞秳?而人工甜味劑被認(rèn)為是IBD病人的健康飲食習(xí)慣[38]。食物消費(fèi)還被認(rèn)為是一種文化和社會(huì)活動(dòng),IBD病人可能會(huì)改變這些關(guān)鍵的心理社會(huì)作用[39]。而食用甜品能在短期內(nèi)產(chǎn)生積極愉悅的感覺,幫助病人減少其因所患疾病所帶來的食物限制缺失感。

4 結(jié)論與限制

總之,這項(xiàng)MR研究發(fā)現(xiàn)全脂牛奶、甜品、谷物與CD具有因果關(guān)系。因此,我們建議每天食用全脂牛奶以及甜品來降低病人所患CD的風(fēng)險(xiǎn)并適當(dāng)控制谷物攝入,但仍需要進(jìn)一步的隨機(jī)對照試驗(yàn)以及大規(guī)模前瞻性研究來闡明全脂牛奶、甜品對CD的保護(hù)作用及其保護(hù)機(jī)制。

本研究也存在一定的局限性:1)GAWS數(shù)據(jù)均來源于歐洲人群,可能會(huì)導(dǎo)致結(jié)果外推受限。2)盡管已經(jīng)采用了較大規(guī)模的GAWS數(shù)據(jù),但工具變量仍然有可能不足。因此,本研究的某些關(guān)聯(lián)的無效性發(fā)現(xiàn)并不代表此類食物對IBD沒有影響。3)受GAWS數(shù)據(jù)影響,本文95%CI存在過大或過小的情況。另外,本文選取的食物有限,未來還需擴(kuò)大食物群體來確定特定食物攝入與IBD的確切因果關(guān)系和機(jī)制。