李艷輝，楊蕊西，何靖怡，袁亞宏，岳田利，盛慶林

（西北大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，陜西西安 710069）

三葉木通（Akebia trifolia），俗稱“八月瓜”“八月炸”“野香蕉”等，廣泛分布在我國(guó)19 個(gè)省的山脈中，包括甘肅、陜西、山西、河北、四川等。三葉木通憑借其優(yōu)良的藥用價(jià)值，在中藥成分中占有一席之地，被稱為“預(yù)知子”，用來(lái)治療水腫、舌痛、閉經(jīng)等疾病[1]。三葉木通最大的特點(diǎn)是當(dāng)果實(shí)成熟時(shí)，果皮會(huì)沿著腹部縫合線縱向裂開(kāi)，常發(fā)生在農(nóng)歷8 月，因此三葉木通有了“八月瓜”這個(gè)美名。

近年來(lái)，由于生活水平不斷提高及市場(chǎng)消費(fèi)結(jié)構(gòu)的改變，三葉木通作為一種保健水果越來(lái)越受到大眾的喜愛(ài)，主要是因?yàn)槿~木通富含豐富的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，并且風(fēng)味甘甜、柔軟多汁。三葉木通果皮中富含各種植物化學(xué)成分，這些化學(xué)物質(zhì)已被證明具有抗炎[2]、抗菌[3]和體外抗氧化作用[4]。張孟琴等人[5]采用多種方法測(cè)定了三葉木通果皮的基本理化指標(biāo)。有研究表明，果皮中果膠、蛋白質(zhì)、還原糖、總糖等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和黃酮類、多酚類、皂苷等活性物質(zhì)豐富。在材料研究方面，果皮提取物被用于開(kāi)發(fā)活性包裝膜、制備納米顆粒，甚至作為環(huán)境保護(hù)的緩蝕劑。除此之外，三葉木通果實(shí)的應(yīng)用與專利研究也有很多。例如，發(fā)酵型八月瓜復(fù)合飲料、八月瓜酸奶、復(fù)合酵素、富硒八月瓜飲料等。果皮經(jīng)常被當(dāng)作垃圾丟棄，不但造成了資源的浪費(fèi)，而且在很大程度上污染了環(huán)境。以三葉木通果皮為研究對(duì)象，對(duì)比了80%甲醇、60%乙醇、水3 種溶劑得到的提取物的抗氧化活性能力，同時(shí)采用響應(yīng)面優(yōu)化福林酚法測(cè)定了提取物的多酚含量，為三葉木通果皮的開(kāi)發(fā)利用提供了參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

三葉木通（即八月瓜），購(gòu)自四川涼山，挑選表面光滑、無(wú)蟲(chóng)害、機(jī)械損傷較輕的成熟八月瓜置于陰涼處保存?zhèn)溆谩?/p>

沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)品、福林酚試劑、TPTZ 溶液、Trolox 標(biāo)準(zhǔn)品、1,1 -二苯基-2 -三硝基苯肼（DPPH）、Na2EDTA、啡咯嗪（Ferrozine）、pBR322質(zhì)粒DNA，美國(guó)Sigma 公司提供；瓊脂糖、甲醇、乙醇、碳酸鈉、鹽酸、FeCl3、FeSO4，上海源葉生物科技有限公司提供。

1.2 儀器與設(shè)備

多功能粉碎機(jī)、電子分析天平、LC-10N/12N/18N冷凍干燥機(jī)、超聲波清洗儀、抽濾機(jī)、LC-RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀、凝膠電泳儀、紫外分光光度計(jì)、水浴鍋、凝膠呈像儀等。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 三葉木通果皮提取的工藝流程

三葉木通果皮提取的工藝流程圖見(jiàn)圖1。

圖1 三葉木通果皮提取的工藝流程圖

1.3.2 三葉木通果皮粗提粉的體外抗氧化活性測(cè)定

（1）清除DPPH 自由基能力的測(cè)定。清除DPPH自由基能力的測(cè)定參考R Scherer 等人[6]的方法并加以修改，于波長(zhǎng)517 nm 處測(cè)定吸光度。

（2）FRAP 能力的測(cè)定。FRAP 能力的測(cè)定參考I F F Benzie 等人[7]的方法并加以修改。以Trolox 為標(biāo)準(zhǔn)品，于波長(zhǎng)593 nm 處測(cè)定吸光度。

（3）對(duì)Fe2+絡(luò)合能力的測(cè)定。對(duì)Fe2+絡(luò)合能力的測(cè)定參考N Singh 等人[8]的方法并加以修改。于波長(zhǎng)562 nm 處，以EDTA-2Na 為對(duì)照品進(jìn)行吸光度測(cè)定。

（4）對(duì)·OH 誘導(dǎo)的pBR322 質(zhì)粒DNA 氧化損傷的保護(hù)。對(duì)·OH 誘導(dǎo)的pBR322 質(zhì)粒DNA 氧化損傷的保護(hù)采用瓊脂糖凝膠電泳法，參考B Tepe 等人[9]的方法并加以修改。結(jié)果用凝膠呈像儀拍照，用Quantity One 軟件對(duì)每個(gè)條帶進(jìn)行光密度分析。

瓊脂糖凝膠電泳法各組加樣量見(jiàn)表1。

表1 瓊脂糖凝膠電泳法各組加樣量/μL

1.3.3 三葉木通果皮粗提粉中多酚含量的測(cè)定

多酚含量的測(cè)定采用Folin-ciocalteu 分光光度測(cè)定法，參照J(rèn) Rumpf 等人[10]的方法并加以修改。對(duì)照品選用質(zhì)量濃度為0.2 mg/mL 的沒(méi)食子酸溶液，樣品溶液為1 mg/mL 的果皮粗提粉溶液。

1.3.4 三葉木通果皮粗提粉多酚測(cè)定條件的優(yōu)化

對(duì)Folin-Ciocalteu 分光光度法中福林酚試劑稀釋倍數(shù)（0，2 倍，4 倍，6 倍，8 倍）、20%碳酸鈉用量（0.5，1.0，1.5，2.0，2.5 mL）、反應(yīng)溫度（20，30，40，50，60 ℃）和反應(yīng)時(shí)間（50，70，90，110，130 min）[11]這4 個(gè)因素設(shè)計(jì)單因素試驗(yàn)，測(cè)定三葉木通果皮粗提粉中多酚的含量。

以單因素試驗(yàn)結(jié)果為依據(jù)，將多酚含量作為響應(yīng)值，將福林酚試劑稀釋倍數(shù)、20%碳酸鈉用量、反應(yīng)溫度和反應(yīng)時(shí)間作為四因素，根據(jù)響應(yīng)面設(shè)計(jì)原理對(duì)三葉木通果皮粗提粉中的多酚含量設(shè)計(jì)四因素三水平試驗(yàn)。

響應(yīng)面設(shè)計(jì)的因素與水平設(shè)計(jì)見(jiàn)表2。

表2 響應(yīng)面設(shè)計(jì)的因素與水平設(shè)計(jì)

2 結(jié)果與分析

2.1 三葉木通果皮粗提粉的體外抗氧化活性測(cè)定結(jié)果

2.1.1 清除DPPH 自由基能力的測(cè)定

標(biāo)準(zhǔn)曲線圖見(jiàn)圖2。

圖2 標(biāo)準(zhǔn)曲線圖

DPPH（2,2 -二苯基-1 -三硝基肼基）相對(duì)較安全且便宜，根據(jù)體內(nèi)自由基穩(wěn)定的機(jī)制起作用[12]。3 種方法獲得提取物的清除DPPH 自由基能力的標(biāo)準(zhǔn)曲線（見(jiàn)圖2（a）～（c）），經(jīng)計(jì)算得，80%甲醇、60%乙醇、水提取物對(duì)DPPH 自由基的清除能力分別為（28.33±0.12），（13.21±0.04），（6.02±0.05）mg/mL。

2.1.2 FRAP 能力的測(cè)定

FRAP（Ferric ion reducing antioxidant power）用來(lái)測(cè)定總抗氧化能力，簡(jiǎn)單且直接。Trolox 標(biāo)準(zhǔn)曲線（見(jiàn)圖2（d）），擬合回歸方程為Y=0.054 1X-0.001 3（R2=0.999），計(jì)算得80%甲醇、60%乙醇、水提取物的FRAP 能力分別為（20.51±0.02），（10.15±0.11），（4.25±0.04）mg/g。

2.1.3 對(duì)Fe2+絡(luò)合能力的測(cè)定

絡(luò)合能力測(cè)定抗氧化能力的原理是Fe2+可以催化Fenton 反應(yīng)的進(jìn)行，對(duì)機(jī)體產(chǎn)生氧化應(yīng)激[13]。EDTA-2Na 標(biāo)準(zhǔn)曲線（見(jiàn)圖2（e）），擬合回歸方程為Y=-0.012 9X+0.975 6（R2=0.991），計(jì)算得80%甲醇、60%乙醇、水提取的APPE 對(duì)Fe2+的絡(luò)合能力分別為（23.11±0.14），（11.34±0.21），（4.20±0.01）mgEDTA-2Na/g。

2.1.4 對(duì)·OH 誘導(dǎo)的pBR322 質(zhì)粒DNA 氧化損傷的保護(hù)

Fe2+和H2O2混合會(huì)發(fā)生Fenton 反應(yīng)（Fe2++H2O2→Fe3++·OH+-OH），從而產(chǎn)生羥基自由基，破壞DNA的超螺旋結(jié)構(gòu)[14]。通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳，會(huì)出現(xiàn)2 個(gè)條帶，移動(dòng)快的是超螺旋DNA，移動(dòng)較慢的是開(kāi)鏈和線性形狀DNA[15]。

不同提取方式對(duì)DNA 的保護(hù)作用見(jiàn)圖3，不同提取方式對(duì)DNA 的保護(hù)作用見(jiàn)表3。

表3 不同提取方式對(duì)DNA 的保護(hù)作用/%

圖3 不同提取方式對(duì)DNA 的保護(hù)作用

由圖3 和表3 可知，3 種提取方法得到的提取物對(duì)·OH 誘導(dǎo)的pBR322 質(zhì)粒DNA 的氧化損傷均有保護(hù)作用。其中，80%甲醇組的開(kāi)鏈占比最低，為41.53%；其次是60%乙醇組，為43.34%；水組的開(kāi)鏈占比最高，為46.81%。

2.2 單因素試驗(yàn)結(jié)果分析

20%碳酸鈉用量、反應(yīng)溫度、反應(yīng)時(shí)間及福林酚稀釋倍數(shù)對(duì)多酚測(cè)定結(jié)果的影響見(jiàn)圖4。

圖4 20%碳酸鈉用量、反應(yīng)溫度、反應(yīng)時(shí)間及福林酚稀釋倍數(shù)對(duì)多酚測(cè)定結(jié)果的影響

由圖4 可知，隨著福林酚稀釋倍數(shù)的升高，測(cè)得的三葉木通果皮提取物中的多酚含量逐漸降低。但是，當(dāng)福林酚完全不稀釋時(shí)，由于反應(yīng)后的溶液中有白色沉淀析出，并伴隨著大量氣泡產(chǎn)生，因此根據(jù)試驗(yàn)并結(jié)合前期經(jīng)驗(yàn)，最終決定將福林酚稀釋2 倍使用[16]。

反應(yīng)溫度及20%碳酸鈉用量對(duì)三葉木通果皮提取物的多酚測(cè)定的影響都是先上升后下降。當(dāng)反應(yīng)溫度達(dá)到30 ℃，20%碳酸鈉用量為1 mL 時(shí)，此時(shí)的多酚含量分別達(dá)到（18.25±0.13）mg/g 及（19.20±0.11）mg/g。當(dāng)溫度過(guò)高時(shí)，會(huì)使得結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定的多酚分解，導(dǎo)致測(cè)定結(jié)果降低。碳酸鈉過(guò)多會(huì)導(dǎo)致體系達(dá)到過(guò)堿狀態(tài)，稀釋藍(lán)色絡(luò)合物[17]。

三葉木通果皮提取物的多酚測(cè)定結(jié)果隨著反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)，呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)，當(dāng)反應(yīng)時(shí)間達(dá)到110 min 時(shí)，多酚含量達(dá)到（18.22±0.17）mg/g。當(dāng)反應(yīng)時(shí)間過(guò)短，反應(yīng)未充分進(jìn)行。反應(yīng)時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，可能會(huì)影響藍(lán)色絡(luò)合物，使得測(cè)得結(jié)果偏低[18]。

2.3 響應(yīng)面結(jié)果分析

2.3.1 響應(yīng)模型的建立與分析

利用Design Expert.V8.0.6.1 對(duì)選取的4 個(gè)因素進(jìn)行響應(yīng)面分析。通過(guò)二次多項(xiàng)式回歸擬合，得到多酚含量（Y）。

由表4 可知，F(xiàn)=39.57，p＜0.0001，失擬項(xiàng)p=0.650 9，證明模型是合適的。該模型的R2=0.975 4，說(shuō)明試驗(yàn)誤差比較小，三葉木通果皮提取物的多酚測(cè)定條件結(jié)果和模型預(yù)測(cè)結(jié)果較一致。除此之外，該模型的校正系數(shù)R2Adj=0.950 7，也證明了模型的可靠性。

表4 方差分析

方差分析見(jiàn)表4。

各因素對(duì)多酚測(cè)定結(jié)果的響應(yīng)面圖見(jiàn)圖5。

圖5 各因素對(duì)多酚測(cè)定結(jié)果的響應(yīng)面圖

響應(yīng)面分析圖可以被用來(lái)評(píng)價(jià)設(shè)置的一些試驗(yàn)因素對(duì)三葉木通果皮提取物中總酚測(cè)定結(jié)果的兩兩交互作用[19]。由圖5 可知，響應(yīng)面坡度越陡，說(shuō)明該因素對(duì)吸光度的影響越大，反之影響程度越小[20]。

2.3.2 最優(yōu)條件的確定

根據(jù)響應(yīng)面模型分析，通過(guò)Design Expert.V 8.0.6.1 得到的Folin-ciocalteu 分光光度法測(cè)量三葉木通果皮提取物中多酚含量的最優(yōu)條件為福林酚稀釋倍數(shù)0.63，20%碳酸鈉用量1 mL，反應(yīng)溫度26.47 ℃，反應(yīng)時(shí)間108.29 min，此時(shí)得到多酚含量為19.50 mg/g。參考最佳測(cè)定條件，在實(shí)際測(cè)定中對(duì)條件進(jìn)行微調(diào)：將福林酚稀釋倍數(shù)設(shè)為2 倍，20%碳酸鈉用量設(shè)為1 mL，反應(yīng)溫度設(shè)為27 ℃，反應(yīng)時(shí)間設(shè)為110 min，所得80%甲醇提取物中多酚含量的平均值為（18.91±0.38）mg/g，該結(jié)果略低于最佳條件下的最高值，但與預(yù)估值接近，吻合度達(dá)96.9%，說(shuō)明在該條件下測(cè)三葉木通果皮提取物中的多酚含量較可靠。

3 結(jié)論

通過(guò)80%甲醇、60%乙醇和水3 種溶劑對(duì)三葉木通果皮進(jìn)行超聲提取及體外抗氧化試驗(yàn)證明，80%甲醇提取物的具有最強(qiáng)的FRAP 能力（20.51±0.02）mg/g，清除DPPH 自由基的能力（28.33±0.12）mg/mL，對(duì)Fe2+的絡(luò)合能力（23.11±0.14）mg EDTA-2Na/g 及對(duì)·OH 引起的pBR322 質(zhì)粒DNA 氧化損傷的保護(hù)能力。經(jīng)響應(yīng)面優(yōu)化福林酚檢測(cè)多酚的試驗(yàn)結(jié)果表明，80%甲醇提取物中多酚含量的平均值為（18.91±0.38）mg/g，確定的最優(yōu)檢測(cè)條件為福林酚稀釋倍數(shù)設(shè)為2 倍，20%碳酸鈉用量為1 mL，反應(yīng)溫度27 ℃，反應(yīng)時(shí)間110 min。該研究為三葉木通果皮中多酚的提取與應(yīng)用提供了參考，有利于三葉木通的進(jìn)一步開(kāi)發(fā)與利用。