吳宗杰 歐曉西 林宏政 余欣茹 程守悅 吳晴陽 李鑫磊 孫云

收稿日期：2023-11-06 ????????????修訂日期：2023-11-24

基金項(xiàng)目：國家茶葉產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系（CARS-19）、福建農(nóng)林大學(xué)茶產(chǎn)業(yè)鏈科技創(chuàng)新與服務(wù)體系建設(shè)項(xiàng)目（K1520005A06）、福建張?zhí)旄２枞~發(fā)展基金會科技創(chuàng)新基金（FJZTF01）

作者簡介：吳宗杰，男，碩士研究生，主要從事茶葉加工與品質(zhì)方面的研究，793232119@qq.com。*通信作者：sunyun1125@126.com

摘要：肉桂是武夷巖茶主栽品種，具有馥郁的花果香和辛銳的桂皮味特征。為明確武夷肉桂關(guān)鍵呈香物質(zhì)和揮發(fā)性成分糖苷結(jié)合物（GBVs）對香氣的貢獻(xiàn)，采用超高效液相色譜四極桿/靜電場軌道阱質(zhì)譜儀系統(tǒng)（UHPLC-Q-Exactive/MS）和頂空固相微萃取-氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（HS-SPME-GC-MS）技術(shù)對武夷肉桂加工過程GBVs和香氣物質(zhì)動態(tài)變化進(jìn)行研究。結(jié)果表明，共檢測到武夷肉桂11個不同加工階段的276種香氣物質(zhì)，這些香氣物質(zhì)包括酯類、醇類、雜環(huán)化合物類、酮類、醛類、萜類等多種組分，其中雜環(huán)化合物類、酯類、萜類和醇類香氣組分含量較高。正交偏最小二乘法判別分析（OPLS-DA）發(fā)現(xiàn)，武夷肉桂中30種特征香氣物質(zhì)變量重投影要性值和香氣活度值均大于1，其中具有青味的（Z）-3-己烯醇和（E）-2-己烯醛含量在加工過程中下降，呈花香或果香的芳樟醇、苯甲醇、苯乙醛、香葉醇和β-羅勒烯含量在加工過程中上升，脫氫芳樟醇和α-石竹烯具有辛香的特征，可能是肉桂品種特征香氣桂皮辛香的主要貢獻(xiàn)物。在武夷肉桂毛茶中芳樟醇、苯乙醛、苯甲醇、2-乙氧基-3-甲基吡嗪和（E，E）-3，5-辛二烯-2-酮等物質(zhì)香氣特征影響值大于1，說明這些物質(zhì)是武夷肉桂加工過程中關(guān)鍵呈香物質(zhì)。在武夷肉桂中鑒定到10種GBVs，在加工過程中，葡萄糖苷的含量呈上升趨勢，而櫻草糖苷的含量呈下降趨勢，GBVs總含量上保持相對穩(wěn)定。在做青后期，葡萄糖苷和櫻草糖苷的含量都呈現(xiàn)下降趨勢，特別是苯甲基櫻草糖苷、2-苯乙基櫻草糖苷、香葉基櫻草糖苷、芳樟基櫻草糖苷和香葉基葡萄糖苷顯著下降，結(jié)果表明GBVs參與了武夷肉桂花果香和甜香的形成。研究結(jié)果闡明武夷肉桂特征香氣成分以及GBVs在武夷肉桂香氣形成中的作用，有利于更好地提升武夷肉桂香氣品質(zhì)，提質(zhì)增效。

關(guān)鍵詞：武夷肉桂；代謝組學(xué)；加工過程；香氣；揮發(fā)性成分糖苷結(jié)合物

中圖分類號：S571.1；TS272.5+9? ? ? ? ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A? ? ? ? ? ? 文章編號：1000-369X（2024）01-084-17

Study on the Glycosidically Bound Volatiles and Aroma Constituents in the Processing of Wuyi Rougui

WU Zongjie1，2， OU Xiaoxi1，2， LIN Hongzheng1，2， YU Xinru1，2， CHEN Shouyue1，2，

WU Qingyang1，2， LI Xinlei3， SUN Yun1，2*

1. College of Horticulture， Fujian Agriculture and Forestry University， Fuzhou 350002， China; 2. Key Laboratory of Tea Science of Fujian Universities， Fuzhou 350002， China; 3. Tea Research Institute of Fujian Academy of Agricultural Sciences， Fuzhou 350012， China

Abstract： ‘Rougui， the main cultivar of Wuyi rock tea， is characterized by a rich floral and pungent cinnamon aroma. To elucidate the contribution of key aroma constituents and glycosidically bound volatiles （GBVs） to Wuyi Rougui rock tea， this study employed ultra-high-performance liquid chromatography quadrupole time-of-flight mass spectrometry （UHPLC-Q-TOF/MS） and headspace solid-phase microextraction-gas chromatography-mass spectrometry （HS-SPME-GC-MS） to investigate the dynamic changes of GBVs and aroma constituents during the processing of Wuyi Rougui rock tea. The results reveal that a total of 276 aroma constituents were identified from 11 different processing stages of Wuyi Rougui rock tea. These aroma constituents belong to various chemical classes， including esters， alcohols， heterocyclic constituents， ketones， aldehydes and terpenes， with heterocyclic constituents， esters， terpenes and alcohols being the predominant aroma components. Orthogonal partial least squares-discriminant analysis （OPLS-DA） identified 35 characteristic aroma constituents in Wuyi Rougui rock tea， as indicated by their Variable Importance in Projection （VIP） values and Odor Activity Values （OAV） greater than 1. Notably， the contents of constituents associated with green and grassy flavor， such as （Z）-3-hexen-1-ol， （E）-2-nonenal and hexanal， exhibited decreasing trends during the processing， while aroma constituents associated with floral or fruity aromas， like linalool， benzyl alcohol， benzaldehyde， eugenol and β-ocimene， displayed increasing trends. Furthermore， in fresh leaves of Wuyi Rougui rock tea， aroma constituents including linalool， benzyl alcohol， benzaldehyde， 2-ethoxy-3-methylpyrazine and （E，E）-3，5-octadien-2-one exhibited ACI values greater than 1， suggesting they are key aroma constituents during the processing of Wuyi Rougui rock tea. Constituents such as dehydrocinnamyl alcohol and α-ionone contributed to the characteristic cinnamon aroma of Wuyi Rougui rock tea. In addition， ten GBVs were identified. During the processing， the contents of glucosides showed an upward trend， while primeveroside showed trend. The total contents of GBVs remained relatively stable. During the late stages of fermentation， both GBVs demonstrated declining trends， particularly constituents like benzyl primeveroside， 2-phenylethyl primeveroside， geranyl glucoside， linayl primeveroside and benzyl glucoside. The results indicate that GBVs were involved in the development of the faint scent and floral-fruity notes of Wuyi Rougui rock tea. This study clarified the role of characteristic aroma constituents and GBVs in the aroma formation of Wuyi Rougui rock tea， in order to better improve the aroma quality of Wuyi Rougui rock tea.

Keywords： Wuyi Rougui rock tea， metabolomics， processing procedure， aroma， glycosidically bound volatiles

烏龍茶屬于中國六大茶類之一，可分為四大類，包括閩南烏龍、閩北烏龍、廣東烏龍和臺灣烏龍[1]。武夷巖茶是閩北烏龍茶的代表之一，起源于福建武夷山，肉桂作為其主要栽培品種，帶有濃郁的花果香氣和獨(dú)特的辛銳的桂皮味，滋味醇厚甘爽，具有獨(dú)特的巖韻，因此深受大眾喜愛[2-4]。

香氣是影響茶葉品質(zhì)和經(jīng)濟(jì)價值的關(guān)鍵因素之一[5-6]，在烏龍茶的加工過程中，香氣的形成至關(guān)重要。武夷巖茶的制作包括萎凋、做青、殺青、揉捻和干燥等步驟，而其中做青是關(guān)鍵工藝，采用了搖青和靜置（或晾青）的方式交替進(jìn)行，以促使花果香物質(zhì)生成[7]，Ma等[8]通過固相微萃取和氣相色譜-質(zhì)譜（SPME-GC-MS）技術(shù)，鑒定出24種香氣物質(zhì)在烏龍茶加工的不同工序中表現(xiàn)出顯著差異，并表明在烏龍茶特征香氣的形成中，做青和殺青工藝可能比萎凋工藝更重要。烏龍茶做青過程中，會在受到機(jī)械損傷和失水脅迫等多重脅迫下，發(fā)生次生代謝物的合成和分解現(xiàn)象，從而使茶葉的香氣物質(zhì)含量和組分不斷發(fā)生變化[8-10]。對于干燥工藝，Ho等[11]認(rèn)為在高溫下會發(fā)生各種反應(yīng)，如美拉德反應(yīng)和脂質(zhì)降解，提供獨(dú)特的風(fēng)味物質(zhì)。干燥和烘焙也有助于香氣物質(zhì)的形成，而某些關(guān)鍵的花香揮發(fā)物，包括芳樟醇、香葉醇、己醛和異戊酸苯乙酯，在干燥和烘焙后含量降低[12-15]。

茶葉中的糖苷類化合物是茶葉的重要成分之一，分為非揮發(fā)性成分糖苷結(jié)合物（Glycosidically bound non-volatiles，GBNVs）和揮發(fā)性成分糖苷結(jié)合物（Glycosidically bound volatiles，GBVs），具有不同的性質(zhì)和作用機(jī)制[16]，GBVs直接影響茶葉的香氣。目前，針對茶葉中的糖苷類化合物進(jìn)行的研究主要集中在紅茶、綠茶和烏龍茶等茶類上[16-21]。大量的研究結(jié)果表明，在紅茶的加工過程中，GBVs的變化非常顯著，對于紅茶香氣的形成發(fā)揮著關(guān)鍵作用[17，20]。而在綠茶的加工過程中，GBVs對香氣的貢獻(xiàn)很小或者沒有明顯作用[21]。在烏龍茶的加工過程中，GBVs的變化與香氣品質(zhì)之間的關(guān)聯(lián)存在不同觀點(diǎn)。謝運(yùn)海等[19]認(rèn)為，在漳平水仙茶加工中，GBVs的含量在曬青階段增加，而在做青階段呈現(xiàn)出合成和水解的動態(tài)平衡；路欣等[18]研究結(jié)果表明，對于鳳凰單樅烏龍茶，GBVs的含量在殺青之前增加，最終的茶葉香氣主要不是由糖苷前體的水解產(chǎn)生，而在加工過程中存在一定程度的GBVs合成。有研究發(fā)現(xiàn)，烏龍茶的香氣與GBVs之間的關(guān)聯(lián)并不顯著，甚至在加工過程中GBVs的含量可能會增加[17，20，22]，Gui等[17]研究指出，在烏龍茶的加工過程中，GBVs沒有受到酶促水解的影響，進(jìn)一步的基因和蛋白質(zhì)研究也表明在加工過程中相關(guān)的糖苷酶基因未被激活?？偟膩砜?，就烏龍茶加工過程中GBVs的變化規(guī)律以及對香氣品質(zhì)的貢獻(xiàn)，尚未達(dá)成一致的結(jié)論。同時，對于武夷巖茶的加工過程中GBVs的變化規(guī)律的研究鮮見報(bào)道。

在生物代謝物修飾領(lǐng)域，Dai等[23]提出了基于源內(nèi)碰撞誘導(dǎo)裂解（ISCID）的修飾代謝組學(xué)新方法。該方法通過在離子源內(nèi)調(diào)整ISCID電壓進(jìn)行LC-MS分析，相較于傳統(tǒng)方法，提供更高分辨率和特異性。研究流程包括常規(guī)代謝組學(xué)分析、糖苷類化合物代謝組學(xué)分析以及茶葉常規(guī)代謝組學(xué)分析。目前，該方法已成功應(yīng)用于高通量、大規(guī)模和特異性檢測人體尿液中的常見修飾代謝物，該方法適用于茶葉中糖苷類成分，如葡萄糖苷、半乳糖苷、阿拉伯糖苷和芹菜糖苷等的大規(guī)模和特異性檢測，有助于系統(tǒng)研究它們對茶葉品質(zhì)的潛在影響，以及為新糖苷類化合物的發(fā)現(xiàn)提供理論依據(jù)。Li等[21]已應(yīng)用該方法研究了綠茶加工過程中的糖苷類物質(zhì)，包括47種非揮發(fā)性成分糖苷結(jié)合物（GBNVs）和17種揮發(fā)性成分糖苷結(jié)合物（GBVs）。

本研究利用超高效液相色譜四極桿/靜電場軌道阱質(zhì)譜儀系統(tǒng)（UHPLC-Q-Exactive/MS）和頂空固相微萃取和氣質(zhì)聯(lián)用（HS- SPME-

GC-MS）技術(shù)，對不同加工階段的武夷肉桂GBVs和香氣物質(zhì)進(jìn)行檢測。本研究旨在揭示武夷肉桂特征香氣成分及GBVs在香氣形成中的作用，以期提升其香氣品質(zhì)，提質(zhì)增效。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

試驗(yàn)選用肉桂茶樹品種，于2022年5月在福建省武夷山市風(fēng)景名勝區(qū)寶國巖茶園采集鮮葉，根據(jù)加工流程（鮮葉→萎凋→做青→晾青→殺青→揉捻→烘干），制作閩北烏龍茶。選取開面的第二葉，采集了11個加工階段的樣品，包括鮮葉（XY）、萎凋葉（WD）、第一次至第六次搖青葉（1Y至6Y）、殺青葉（SQ）、揉捻葉（RN）和毛茶（MC）。樣品在液氮中固定后，經(jīng)過真空冷凍干燥處理，磨碎并通過40目篩進(jìn)行篩選，存放在–80 ℃的冰箱中備用。

試劑：正己烷（色譜純）購自德國Meker公司，HPLC級甲醇、甲酸（FA）和乙腈（ACN）國產(chǎn)分析純的有機(jī)溶劑作為分離用溶劑。碘乙酰胺（IAA）、1，4-二硫蘇糖醇（DTT）、三氟乙酸（TFA）、胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶等化學(xué)試劑，以及芳樟醇、2-苯乙醇、橙花叔醇、乙酸香葉酯、萜品油烯和苯乙醛等香氣組分標(biāo)準(zhǔn)品（純度≥98%）均購自美國Sigma Aldrich公司；苯甲基葡萄糖苷和2-苯乙基葡萄糖苷標(biāo)準(zhǔn)品購自加拿大TRC公司；苯甲基櫻草糖苷、2-苯乙基櫻草糖苷、香葉基葡萄糖苷、香葉基櫻草糖苷、芳樟基葡萄糖苷、芳樟基櫻草糖苷、（Z）-3-己烯基葡萄糖苷和（Z）-3-己烯基櫻草糖苷（純度≥95%）購自山東大學(xué)國家糖工程技術(shù)研究中心。

1.2 儀器與設(shè)備

7890B-7000D氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀器（GC-MS）、DB-5MS色譜柱（30 m×0.25 mm×

0.25 μm）、120 μm DVB/CWR/PDMS萃取頭，美國Agilent公司；UHPLC-Q-Exactive/MS系統(tǒng)，美國Thermo Fisher Scientific公司；SPME Arrow固相微萃取裝置、Fiber Conditioning Station老化裝置、Agitator樣品加熱箱，瑞士CTC Analytics AG公司；MS105DU電子天平，瑞士METTLER TOLEDO公司；MM400球磨儀，德國Retsch公司；Milli-Q水凈化系統(tǒng)，美國Millipore公司。

Oasis HLB濾筒，每個濾筒含有10 mg吸附劑，顆粒為30 μm，購自Waters公司。采用Milli-Q水凈化系統(tǒng)生產(chǎn)去離子水。其他未特別提及的試劑均為分析級[24]。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 樣品中香氣物質(zhì)的分析方法

樣品提取流程：從–80 ℃冰箱中取出樣品進(jìn)行液氮研磨，渦旋混合均勻，每個樣本稱取約500 mg于頂空瓶中，分別加入飽和NaCl溶液，10 ?L（50 ?g·mL-1）3-己酮內(nèi)標(biāo)溶液，全自動頂空固相微萃取HS-SPME進(jìn)行樣本萃取，以供GC-MS分析。

HS-SPME萃取條件：在60 ℃恒溫條件下，振蕩5 min，120 μm DVB/CWR/PDMS萃取頭插入樣品頂空瓶，頂空萃取15 min，于250 ℃下解析5 min，然后進(jìn)行GC-MS分離鑒定。采樣前萃取頭在Fiber ConditioningStation中250 ℃下反應(yīng)5 min。

色譜條件：DB-5MS毛細(xì)管柱（30 m×

0.25 mm×0.25 ?m），載氣為高純氦氣（純度不小于99.999%），恒流流速1.2 mL·min-1，進(jìn)樣口溫度250 ℃，不分流進(jìn)樣，溶劑延遲3.5 min。程序升溫：40 ℃保持3.5 min，以10 ℃·min-1升至100 ℃，再以7 ℃·min-1升至180 ℃，最后以25 ℃·min-1升至280 ℃，保持5 min。

質(zhì)譜條件：電子轟擊離子源（EI），離子源溫度230 ℃，四極桿溫度150 ℃，質(zhì)譜接口溫度280 ℃，電子能量70 eV，掃描方式為選擇離子檢測模式（SIM），定性定量離子精準(zhǔn)掃描（GB 23200.8—2016）。

香氣物質(zhì)的定性分析：參考Yuan等[25]的研究，使用MassHunter軟件（安捷倫定性系統(tǒng)），設(shè)置解卷積參數(shù)峰寬設(shè)為20，分辨率、靈敏度及色譜峰形的要求均設(shè)為中等，匹配因子最小值設(shè)置為70。根據(jù)得到的質(zhì)譜數(shù)據(jù)與NIST（2020）譜庫提供的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的質(zhì)譜圖進(jìn)行物質(zhì)鑒定，再計(jì)算各揮發(fā)物的保留指數(shù)（Rentention index，RI），以正構(gòu)烷烴混合物（C7～C40）為標(biāo)準(zhǔn)，在相同色譜條件下進(jìn)行氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用分析并根據(jù)下式進(jìn)行化合物的計(jì)算，計(jì)算公式為RI=100z＋100[TR（x）－TR（z）]/[TR（z＋1）－TR（z）]，其中TR（x）、TR（z）和TR（z+1）分別代表組分及碳原子數(shù)為z和z+1正構(gòu)烷的保留溫度，且TR（z）

1.3.2 樣品中糖苷類化合物的分析方法

稱取100 mg茶粉倒入50 mL樣品瓶中，加入20 mL 70%甲醇溶解，70 ℃提取30 min，再將樣品瓶置于冷水中冷卻至室溫，在4 ℃、8 000 g下離心10 min，上清液經(jīng)0.22 ?m尼龍膜過濾。每個樣品3份重復(fù)。將獲得的溶液進(jìn)行LC-MS的代謝組學(xué)分析[23]。

代謝組學(xué)分析的LC-MS條件：通過UHPLC-Q-Exactive/MS對茶葉樣品進(jìn)行檢測。采用Acquity UPLC HSS T3色譜柱（2.1 mm×

100 mm，1.8 ?m，Waters，UK）。采用流動相A（含0.1%甲酸的水溶液）和流動相B（含0.1%甲酸的乙腈溶液）梯度洗脫。色譜洗脫設(shè)置為：0 min，2% B；0.5 min，2% B；10 min，15% B；18 min，40% B；20 min，90% B；20.9 min，90% B；21 min，2% B；25 min，2% B，流速0.4 mL·min-1。進(jìn)樣量為3 ?L。在正電噴霧電離（ESI）模式下獲得全掃描數(shù)據(jù)，質(zhì)量范圍為m/z 100～1 200。毛細(xì)管電壓為3.5 kV，毛細(xì)管溫度為300 ℃；保持干燥氣體流量為10 L·min-1，干燥氣體溫度為350 ℃。具體參數(shù)條件參考文獻(xiàn)[23]。

UHPLC-Q-Exactive/MS獲得的原始數(shù)據(jù)使用Compound Discoverer 3.2軟件進(jìn)行選峰和對峰。質(zhì)量寬度設(shè)置為0.005 Da，保留時間寬度設(shè)置為0.3 min。結(jié)果以μg·g-1為單位表示GBVs的含量。

1.3.3 氣味活度值（OAV）分析

參照文獻(xiàn)[14]進(jìn)行氣味活度值（Odor activity value，OAV）計(jì)算，OAV及香氣特征影響值（Aroma character impact value，ACI）分別根據(jù)公式（1）及（2）計(jì)算。

···························（1）

ACI=×100%···················（2）

式中，OAV為香氣活性值；Cx為香氣物質(zhì)x的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，μg·kg-1；OTx為香氣物質(zhì)x在水中的香氣閾值，μg·kg-1；Ox為香氣物質(zhì)x的香氣活性值。

1.3.4 數(shù)據(jù)分析

使用SIMCA 14.1進(jìn)行主成分分析（PCA）和正交偏最小二乘判別分析（OPLS-DA）。通過變量投影重要性值（VIP）大于1.0，使用Office Excel 2019軟件制作圖表，Graphpad Prism 8.0.2軟件繪制柱狀圖，SPSS 26.0用于進(jìn)行顯著性分析（P＜0.05）。

2 結(jié)果與分析

2.1 武夷肉桂加工過程中香氣物質(zhì)種類和變化

從武夷肉桂加工過程樣品中共檢測鑒定到276個已知香氣物質(zhì)，包括67種萜類、45種酯類、39種醇類、37種雜環(huán)化合物類、31種醛類、14種酮類、12種烴類、11種芳烴類、11種酸類、3種含氮化合物和6種其他物質(zhì)。

武夷肉桂加工過程中香氣物質(zhì)的總含量呈先升后降的趨勢。在鮮葉中，香氣物質(zhì)含量較少，隨著萎凋和做青工藝的不斷進(jìn)行，香氣物質(zhì)含量不斷增加，在做青結(jié)束后達(dá)到峰值，在殺青、揉捻、干燥加工階段香氣物質(zhì)含量呈下降趨勢。由圖1可知，11個樣品的香氣物質(zhì)在組成上存在一致性，萜類、酯類、雜環(huán)化合物類、醇類物質(zhì)的含量最高，這四類香氣物質(zhì)的含量占總含量的66.20%～88.78%，是武夷肉桂加工過程中主要香氣物質(zhì)的類型，其中萜類物質(zhì)已被認(rèn)為是烏龍茶花香和果香的關(guān)鍵香氣物質(zhì)[26-29]，其含量從鮮葉到做青結(jié)束顯著增加。

武夷肉桂加工過程中，萜類、酯類、醇類、烴類、醛類、酮類和酸類物質(zhì)的含量總體呈先上升后下降趨勢，毛茶較鮮葉增加13.2～17.56倍。在萎凋葉中，所有類型的香氣物質(zhì)含量均有不同程度的上升，其中酯類、萜類和醇類物質(zhì)的含量上升趨勢較為明顯，分別增加了80.07%、146.58%和93.73%；做青過程中所有類型的香氣物質(zhì)含量均呈上升趨勢，其中萜類、酯類、醇類、雜環(huán)化合物類、醛類和其他化合物增加較為顯著，分別增加了162.58%、90.91%、93.34%、83.44%、326.57%和919.02%?？偟膩砜矗銮嗪笃谒膿u至六搖的香氣物質(zhì)增加總量大于做青前期一搖至三搖，說明后期加強(qiáng)搖青時間與力度的做法對香氣的形成具有較大貢獻(xiàn)。殺青后，所有類型的香氣物質(zhì)除萜類外都呈下降趨勢，酯類、醇類、雜環(huán)化合物類、醛類和其他化合物的含量分別減少了17.12%、50.02%、39.46%、27.79%、27.57%，說明做青和殺青工藝對武夷肉桂香氣品質(zhì)影響顯著。隨后的揉捻和干燥過程中，除了烴類物質(zhì)在揉捻后含量上升了3.72%外，其他類型的香氣物質(zhì)含量都有不同程度的損失或轉(zhuǎn)化。這表明做青激發(fā)了香氣物質(zhì)的生物轉(zhuǎn)化，為烏龍茶的最終香氣形成奠定了物質(zhì)基礎(chǔ)，殺青則通過熱化學(xué)轉(zhuǎn)化進(jìn)一步穩(wěn)定了香氣物質(zhì)[30]。在毛茶中，各類型香氣物質(zhì)的含量都高于鮮葉中的含量。

綜上所述，武夷肉桂加工工序?qū)е虏煌悇e的香氣物質(zhì)含量和占比發(fā)生變化，萎凋工序促進(jìn)不同類型香氣物質(zhì)形成和積累。做青對武夷巖茶香氣物質(zhì)產(chǎn)生重要影響，所有香氣物質(zhì)含量均有不同程度的上升。殺青工藝有助于酸類和酯類物質(zhì)的積累，而揉捻過程中的機(jī)械力幾乎不影響香氣物質(zhì)的含量變化。高溫干燥階段會導(dǎo)致萜類和酯類物質(zhì)含量的下降，最終形成了武夷肉桂中各類豐富的香氣物質(zhì)。做青工序被視為武夷巖茶香氣積累的關(guān)鍵工藝。

2.2 武夷肉桂加工過程中香氣物質(zhì)主成分分析

基于276種香氣物質(zhì)的含量進(jìn)行主成分

分析（PCA），如圖2A所示，第一主成分（PC1）和第二主成分（PC2）分別為60.50%和28.80%，累計(jì)貢獻(xiàn)率為89.30%，圖中11個樣品被較好地區(qū)分開，說明在加工過程中其代謝物含量與組成發(fā)生了明顯的變化。PCA結(jié)果能夠較好地反映出武夷巖茶加工過程中11組樣品之間的香氣物質(zhì)差異。此外，11個樣品被進(jìn)一步分成2類，鮮葉、萎凋葉和做青葉代表烏龍茶加工的酶促反應(yīng)階段，烘干葉殺青葉和揉捻葉代表烏龍茶加工的非酶促反應(yīng)階段。綜上說明，武夷肉桂的不同工藝樣品香氣物質(zhì)含量區(qū)別較明顯，主成分分析能顯著區(qū)分各加工工藝的樣品。

如圖2B所示，香氣物質(zhì)在圖中的分布情況與樣品分布對應(yīng)，萎凋和一搖至三搖樣品位于第一主成分負(fù)軸對應(yīng)載荷圖上的2-環(huán)戊基乙醇、反式-3-己烯基乙酸酯和（Z）-3-己烯醇；四搖至六搖樣品位于第二主成分正軸，分布芳樟醇、香葉醇和吲哚，這些物質(zhì)是武夷肉桂搖青后期葉的優(yōu)勢組分；第二主成分負(fù)半軸聚集和分布了大量物質(zhì)，如2-苯乙醇、脫氫芳樟醇和己酸己酯等，這些物質(zhì)是武夷肉桂殺青葉和揉捻葉中的優(yōu)勢組分。

2.3 武夷肉桂加工過程中關(guān)鍵香氣物質(zhì)篩選

VIP可以量化OPLS-DA模型中每個變量對分類的貢獻(xiàn)度，VIP值越高，表示香氣物質(zhì)在不同加工工藝中的貢獻(xiàn)越顯著[6]。

通過OPLS-DA對武夷肉桂不同加工過程樣品進(jìn)行兩兩判別分析，如圖3B所示，以VIP＞1為篩選條件，共篩選出50種主要特征香氣物質(zhì)，包括13種萜類、10種醇類、9種酯類、6種雜環(huán)化合物類、6種醛類、2種酸類、2種酮類和2種其他類化合物。圖3C是OPLS-DA驗(yàn)證模型，置換檢驗(yàn)得到R2=0.147，Q2=–0.486，且回歸線在Y軸的截距為負(fù)，所以該模型可信度高，不存在過擬合現(xiàn)象[31]。

與鮮葉相比，武夷肉桂毛茶中萜類物質(zhì)α-石竹烯（辛香）[12]和乙酸香葉酯的含量分別增加了2.55倍和8.10倍；醇類物質(zhì)中的脫氫芳樟醇、2-苯乙醇和苯甲醇含量分別增加了20.02倍、11.30倍和2.30倍，2-環(huán)戊基乙醇和（Z）-3-己烯醇分別下降了96.58%、92.76%；酯類物質(zhì)中的丁酸香葉酯、δ-癸內(nèi)酯和己酸己酯含量分別增加了15.94倍、58.69倍和67倍，反式-3-己烯基乙酸酯和丙烯酸甲氧基乙酯分別下降了97.59%、88.91%；醛類物質(zhì)中苯乙醛和苯甲醛的含量分別增加了86倍和4.27倍，（E）-2-己烯醛減少了87.05%；含氮化合物中吲哚的含量增加了14.13倍。這些香氣物質(zhì)顯著的變化可能對武夷肉桂的香氣品質(zhì)產(chǎn)生了重要的影響。

聚類分析顯示（圖4），50種主要香氣物質(zhì)大致可分為兩大類。第一類物質(zhì)包括芳樟醇、（Z）-3-己烯醇、β-羅勒烯和（E）-2-己烯醛等，受到高溫殺青影響較為明顯，這些香氣物質(zhì)在殺青后的含量迅速減少，其中（Z）-3-己烯醇和（E）-2-己烯醛屬于帶有青味的香氣物質(zhì)[32]，表明殺青是導(dǎo)致武夷巖茶青味褪去的關(guān)鍵工藝。第二類物質(zhì)包括脫氫芳樟醇、吲哚、δ-癸內(nèi)酯、己酸己酯、α-石竹烯、苯甲醛和乙酸香葉酯等，受殺青工藝影響較小，其含量在做青過程中逐漸上升，而在殺青后沒有明顯的變化，這些香氣物質(zhì)大多屬于花果香和辛香類物質(zhì)[12]，與肉桂茶品種特征相符，因此它們可能是影響肉桂茶關(guān)鍵香氣物質(zhì)之一。在干燥工藝后，武夷肉桂的香氣成分發(fā)生了顯著的變化，隨著水分的蒸發(fā)，部分香氣物質(zhì)消失，（Z）-3-己烯醇和（E）-2-己烯醛的含量減少，而脫氫芳樟醇和苯甲醛的含量增加，這一變化導(dǎo)致了原本的青氣被甜香、杏仁香和花香所替代，這種轉(zhuǎn)變可能是由茶葉中的α-亞麻酸、亞油酸和油酸等不飽和脂肪酸分解引起的[33]。

2.4 關(guān)鍵香氣物質(zhì)OAV和ACI分析

OAV是用來評估不同香氣物質(zhì)對樣品風(fēng)味貢獻(xiàn)度的一種方法，它結(jié)合了香氣物質(zhì)的濃度和香氣閾值，OAV＞1通常被認(rèn)為對茶葉的整體香氣特征具有貢獻(xiàn)，OAV＞100表明貢獻(xiàn)顯著[11]。

通過對不同加工階段的香氣物質(zhì)進(jìn)行OAV計(jì)算分析，共篩選鑒定出30種OAV＞1的香氣物質(zhì)，包括脫氫芳樟醇、苯乙醛、2-苯乙醇、（Z）-3-己烯醇、香葉醇、β-羅勒烯、己酸己酯、（E）-2-己烯醛、苯甲醛、苯甲醇、壬醇、吲哚和δ-癸內(nèi)酯等（表1）。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，OAV＞10的香氣物質(zhì)有15種，其中芳樟醇、苯乙醛、香葉醇、苯甲醇、2-乙氧基-3-甲基吡嗪和（E，E）-3，5-辛二烯-2-酮的OAV＞100。值得關(guān)注的是，在毛茶中脫氫芳樟醇（OAV=324.91）和α-石竹烯（OAV=30.94）具有辛香的特征，可能是肉桂品種特征香氣桂皮辛香的主要貢獻(xiàn)物。

由表2可知，武夷肉桂毛茶中ACI值大于1%的香氣物質(zhì)有（E，E）-3，5-辛二烯-2-酮、2-乙氧基-3-甲基吡嗪、苯乙醛、芳樟醇、苯甲醇、吲哚、2-苯乙醇、脫氫芳樟醇、香葉醇和（E）-6，10-二甲基-5，9-十一碳烯-2-酮，推測這10個香氣物質(zhì)是武夷肉桂高香特征的物質(zhì)基礎(chǔ)。其中（E，E）-3，5-辛二烯-2-酮、芳樟醇、苯甲醇、吲哚、2-苯乙醇、脫氫芳樟醇、香葉醇、（E）-6，10-二甲基-5，9-十一碳烯-2-酮和苯乙醛具有花香或果香，且OAV＞100，是武夷肉桂花果香和甜香的主要貢獻(xiàn)物。

Zheng等[37]研究表明，具有花香的芳樟醇（OAV=50.6）是烏龍茶的特征香氣物質(zhì)，在加工過程中呈現(xiàn)較高的OAV值。Yue等[34]研究表明，β-離子酮、香葉醇、苯乙醛、苯甲酸、甲酯和吲哚是烏龍茶香氣的主要貢獻(xiàn)者。Guo等[38]研究表明，2，5-二甲基吡嗪是武夷巖茶中烘焙風(fēng)味的關(guān)鍵香氣物質(zhì)。本研究發(fā)現(xiàn)，在30種OAV＞1的香氣物質(zhì)中，除具有青味的（Z）-3-己烯醇和（E）-2-己烯醛外，其他香氣物質(zhì)可能對不同加工階段的武夷肉桂的花香和果香特征具有貢獻(xiàn)，芳樟醇、苯甲醇、苯乙醛、香葉醇、β-羅勒烯和δ-癸內(nèi)酯對不同加工階段肉桂花香和果香特征的貢獻(xiàn)顯著，這與前人研究武夷巖茶的關(guān)鍵呈香物質(zhì)結(jié)果相似[1，7，35，39]。此外，搖青在使一些具有脂肪香、青味的物質(zhì)含量下降的同時提高了花香、果香類物質(zhì)含量，改變各香氣物質(zhì)間的組成，部分不愉悅的香氣物質(zhì)散失，促使花果香顯露，起到了純化香氣的作用[35]，這些香氣物質(zhì)在武夷肉桂的加工過程中對其獨(dú)特風(fēng)味品質(zhì)的形成起著重要作用。

2.5 武夷肉桂加工過程中GBVs變化

GBVs通常是單萜醇、芳香醇、脂肪醇的糖或糖的衍生物（稱為糖基）與非糖物質(zhì)（稱為苷元或配基）經(jīng)過脫水縮合連接而成的化合物，這些化合物通常被認(rèn)為是茶葉香氣的前體物質(zhì)[40]，在茶葉香氣形成過程中發(fā)揮著重要作用[11，41]。利用UHPLC-Q-Exactive/MS技術(shù)對武夷肉桂加工過程中GBVs的動態(tài)變化進(jìn)行分析，共檢測到10種GBVs，包括苯甲基葡萄糖苷、苯甲基櫻草糖苷、2-苯乙基葡萄糖苷、2-苯乙基櫻草糖苷、香葉基葡萄糖苷、香葉基櫻草糖苷、順-3-己烯基葡萄糖苷、順-3-己烯基櫻草糖苷、芳樟基葡萄糖苷和芳樟基櫻草糖苷。在加工過程中，葡萄糖苷含量呈上升趨勢，而櫻草糖苷含量呈下降趨勢，糖苷含量總體上趨于穩(wěn)定。在做青后期階段，葡萄糖苷和櫻草糖苷的含量都有下降趨勢，分別從4Y的1 800.61 μg·g-1和874.60 μg·g-1下降至6Y的1 674.36 μg·g-1和655.51 μg·g-1，其中苯甲基櫻草糖苷、2-苯乙基櫻草糖苷、香葉基櫻草糖苷、芳樟基櫻草糖苷和香葉基葡萄糖苷5種揮發(fā)性成分糖苷結(jié)合物在做青后期過程中（4Y至6Y）顯著下降，分別下降了16.00%、83.66%、20.34%、20.41%和64.94%，可能是由于葉片受到機(jī)械損傷，促使糖苷酶和揮發(fā)性成分糖苷結(jié)合物發(fā)生水解反應(yīng)，從而形成相應(yīng)的香氣物質(zhì)，這些物質(zhì)可能在武夷巖茶花果香和甜香的形成過程中起著關(guān)鍵作用。

武夷肉桂初制過程中GBVs含量的變化如圖5所示。從鮮葉到完成初制的過程中，櫻草糖苷含量以及各糖苷單體都發(fā)生了顯著變化。在做青的后期過程中（4Y至6Y），櫻草糖苷呈現(xiàn)明顯下降趨勢，明顯低于鮮葉中的含

量，這表明在搖青階段可能存在GBVs水解為香氣物質(zhì)的反應(yīng)。殺青后，櫻草糖苷含量明顯增加，從做青結(jié)束的655.51 μg·g-1增加到殺青后的774.29 μg·g-1。在毛茶中，櫻草糖苷含量略有下降，相較于鮮葉時下降了31.84%。武夷肉桂加工過程中葡萄糖苷的含量呈波動增加的趨勢，在WD、2Y、4Y和RN階段達(dá)到峰值，但在做青后期階段呈下降趨勢，毛茶中葡萄糖苷含量略有下降，但相較于鮮葉時上升了29.65%。結(jié)果表明，在武夷巖茶的制作過程中，GBVs的合成和酶解反應(yīng)存在某種動態(tài)平衡。通過適度延長萎凋時間可以提高糖苷總量，而通過調(diào)整搖青強(qiáng)度和時間可以改變GBVs的合成，從而增加香氣前體的總量，釋放更多香氣物質(zhì)[19]。

2.6 GBVs與對應(yīng)香氣物質(zhì)的含量變化關(guān)系

對武夷肉桂加工過程中苯甲醇、2-苯乙醇、（Z）-3-乙烯醇、芳樟醇和香葉醇5種香氣物質(zhì)進(jìn)行了定量分析，結(jié)果如表3所示。苯甲醇和2-苯乙醇的含量在加工過程中呈上升趨勢，而芳樟醇、（Z）-3-己烯醇和香葉醇的含量在加工過程中呈現(xiàn)先升后降的趨勢。具體而言，在做青階段，苯甲醇、2-苯乙醇和香葉醇的含量顯著增加，從1Y至6Y分別增加了1.97倍、9.11倍和1.76倍，而在殺青后，芳樟醇、（Z）-3-己烯醇和香葉醇的含量急劇下降。值得關(guān)注的是，這5種香氣物質(zhì)的含量在烘干后均下降。5種香氣物質(zhì)與GBVs的相關(guān)性分析結(jié)果顯示（表4），其總含量與櫻草糖苷含量負(fù)相關(guān)（相關(guān)系數(shù)=–0.850），而與葡萄糖苷含

量正相關(guān)（相關(guān)系數(shù)=0.894），表明櫻草糖苷在武夷巖茶的制作過程中可能發(fā)揮了作用。其中，苯甲基櫻草糖苷和苯甲醇（花香）、2-苯乙基櫻草糖苷和2-苯乙醇（花香、果香、甜香）相關(guān)系數(shù)較小，分別為–0.903和–0.875，呈顯著負(fù)相關(guān)，芳樟基櫻草糖苷和芳樟醇（花香）、香葉基櫻草糖苷和香葉醇（花香、果香、甜香）也呈負(fù)相關(guān)，在毛茶中苯甲醇（OAV=1 673.33，ACI=7.91%）、2-苯乙醇（OAV=563.33，ACI=2.66%）、芳樟醇（OAV=1 801.67，ACI=8.52%）和香葉醇（OAV=242.50，ACI=1.15%）都是關(guān)鍵呈香物質(zhì)，對花果香和甜香貢獻(xiàn)較大，表明GBVs參與了武夷肉桂特征香氣的形成。

對于武夷巖茶中的櫻草糖苷，在搖青過程中，細(xì)胞破裂促使了櫻草糖苷酶與位于液泡中的櫻草糖苷發(fā)生接觸[17，42]，導(dǎo)致兩者發(fā)生水解反應(yīng)，釋放出糖苷中的配位部分。這解釋了櫻草糖苷含量在做青后期呈現(xiàn)明顯下降的趨勢（圖5）。Cui等[20]研究發(fā)現(xiàn)，紅茶揉捻過程中，在制葉受到了嚴(yán)重的機(jī)械組織損傷，櫻草糖苷的含量大幅降低。與此相似，武夷肉桂加工過程中多次搖青也會對葉邊緣造成一定程度機(jī)械損傷，從而促進(jìn)了“綠葉紅鑲邊”的形成。

Cui等[20]和路欣等[18]在研究烏龍茶加工過程中糖苷類物質(zhì)對香氣的貢獻(xiàn)時，采用閩南鐵觀音和鳳凰單叢制作工藝，這兩種茶工藝搖青次數(shù)少（3次），葉片損傷程度低，發(fā)酵程度較輕，與武夷肉桂重?fù)u重發(fā)酵的工藝存在一定差異性，表明GBVs在武夷肉桂加工過程中對香氣的形成具有貢獻(xiàn)。

3 結(jié)論

通過HS-SPME-GC-MS結(jié)合OAV分析武夷肉桂加工過程中11個樣品的香氣物質(zhì)動態(tài)變化，共檢測出已知香氣物質(zhì)276種，包括酯類、醇類、萜類、醛類、烴類、雜環(huán)化合物類、酮類等，其中雜環(huán)化合物類、酯類、萜類、醇類香氣物質(zhì)含量較高。在武夷肉桂萎凋階段，所有類型的香氣物質(zhì)含量都呈現(xiàn)上升趨勢，尤其是酯類、萜類和醇類物質(zhì)的含量上升顯著。進(jìn)入做青階段，香氣物質(zhì)的種類和含量顯著增加，（Z）-3-己烯醇和（E）-2-己烯醛等青氣物質(zhì)開始釋放和發(fā)生轉(zhuǎn)化，而芳樟醇、香葉醇和苯甲醇等富含甜花香和果香的物質(zhì)逐漸揮發(fā)出來。這表明做青工藝在烏龍茶特征香氣的積累中的至關(guān)重要，改變了各香氣物質(zhì)的組成，有助于散失部分不愉悅的香氣物質(zhì)，從而使花果香更加顯著[35]。殺青階段通過熱化學(xué)轉(zhuǎn)化進(jìn)一步穩(wěn)定了揮發(fā)物[30]。在干燥工藝后，武夷肉桂的香氣成分發(fā)生了顯著的變化，（Z）-3-己烯醇和（E）-2-己烯醛的含量減少，而脫氫芳樟醇和苯甲醛的含量增加，青氣被甜香、杏仁香和花香所替代，這種轉(zhuǎn)變可能是由茶葉中的α-亞麻酸、亞油酸和油酸等不飽和脂肪酸的分解引起的[33]。

基于OPLS-DA篩選出50種VIP＞1的香氣物質(zhì)，進(jìn)一步結(jié)合OAV分析篩選出30種特征香氣物質(zhì)（OAV＞1），其中芳樟醇（花香）、苯乙醛（花香、蜜香）、苯甲醇（花香）、（E，E）-3，5-辛二烯-2-酮（果香、青草香）、香葉醇（花香、果香、甜香）、（E）-6，10-二甲基-

5，9-十一碳烯-2-酮（花香、果香、青香、木香）、吲哚（花香）、2-苯乙醇（花香、果香、甜香）、脫氫芳樟醇（花香、甜香、辛香）是武夷肉桂呈現(xiàn)花果香和甜香型特征的重要物質(zhì)，脫氫芳樟醇和α-石竹烯具有辛香的特征，可能是肉桂品種特征香氣桂皮辛香的主要貢獻(xiàn)物。

在武夷肉桂的做青后期，葡萄糖苷和櫻草糖苷的含量均呈下降趨勢，與謝運(yùn)海[19]等研究發(fā)現(xiàn)漳平水仙在加工過程中糖苷類香氣前體減少的情況相符。葡萄糖苷酶分布在細(xì)胞壁中，而櫻草糖苷酶和糖苷則位于液泡內(nèi)[17，42]。搖青導(dǎo)致葉片邊緣的細(xì)胞形態(tài)遭受了一定程度的損傷。在搖青過程中，細(xì)胞的破裂促使櫻草糖苷酶與糖苷發(fā)生接觸，觸發(fā)了水解反應(yīng)，導(dǎo)致櫻草糖苷中的配位部分被釋放，從而引起了櫻草糖苷含量在做青后期的顯著降低。本研究結(jié)果表明，GBVs在武夷肉桂香氣形成中發(fā)揮了一定的作用，部分香氣物質(zhì)可能是由于糖苷的水解產(chǎn)生，參與了武夷肉桂特征香氣的形成。研究結(jié)果對武夷肉桂的特征性風(fēng)味分析和品質(zhì)調(diào)控具有重要的理論和實(shí)踐指導(dǎo)意義。未來需要進(jìn)一步研究如何有效利用和水解茶葉中的揮發(fā)性成分糖苷結(jié)合物，以實(shí)現(xiàn)茶葉的增香效果。

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