徐 璐，張冬雨，王瑞鋒

鄭州大學附屬兒童醫(yī)院/河南省兒童醫(yī)院鄭州兒童醫(yī)院 1.檢驗科 鄭州市兒童感染與免疫重點實驗室；2.消化科，河南 鄭州 450000

幽門螺旋桿菌(Helicobacterpylori,Hp)是一種螺旋形革蘭氏陰性細菌,通過口-口和糞-口途徑傳播和感染,幾乎所有感染的患者都會發(fā)生不同程度的胃炎,它可以從急性/慢性炎性反應、腸化生、慢性萎縮性胃炎、不典型增生發(fā)展至上皮內瘤變,甚至是胃癌[1]。侵入性、內窺鏡檢查和非侵入性方法如呼吸、糞便和血清學檢查用于診斷Hp感染,治療上采用強酸抑制劑與抗生素或鉍的組合,但需要考慮到個人病史和抗生素耐藥性的急劇增加,治療效果有限[2]。茯苓酸(pachymic acid, PA)是一種來自茯苓的羊毛脂三萜化合物,可抑制多種疾病中的炎性反應[3],但在胃炎中的研究較少。磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol 3-kinase, PI3K)參與細胞增殖、分化、凋亡等多種細胞功能的調節(jié),有文獻指出,抑制PI3K及其下游因子蛋白激酶B(protein kinase B, AKT)、激活核因子(nuclear factor, NF)-κB信號可以調節(jié)多種炎性反應,抑制促炎因子的分泌,顯著改善急性胃炎模型小鼠的胃黏膜炎性反應病變[4]。然而,PA能否通過調節(jié)PI3K/AKT/NF-κB信號通路影響Hp相關性胃炎尚不清楚。本研究旨在討論PA對Hp相關性胃炎的影響及PI3K/AKT/NF-κB通路的調控作用,以期為Hp相關性胃炎的治療提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物:SPF級7～8周齡SD雄性大鼠(200～230 g,北京藥康生物科技有限公司[SCXK(京)-2023-0008]),飼養(yǎng)環(huán)境為12 h/12 h光暗循環(huán),溫度(23±1)℃,濕度(55±5)%。研究方案已通過倫理委員會批準,實驗操作遵守相關規(guī)定。

1.1.2 試劑:PA(純度≥98%,DF0001,德思特生物公司);740 Y-P(PI3K激動劑,HY-P0175,MCE公司);白細胞介素-6(interleukin-6,IL-6)、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)、IL-10、誘導型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase,iNOS)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)酶聯(lián)免疫吸附試驗(enzyme linked immunosor-bent assay,ELISA)試劑盒(上?？瓢┥锛夹g有限公司);一抗磷酸化-NF-κB p65(p-NF-κB p65)(ab239882)、NF-κB p65(ab19870)、p-PI3K(ab182651)、PI3K(ab302958)、p-AKT(ab38449)、AKT(ab8805)(Abcam公司)。

1.2 方法

1.2.1 實驗分組:構建Hp相關性胃炎大鼠模型[5]:大鼠禁食12 h,灌胃NaHCO3+消炎鎮(zhèn)痛藥0.5 mL/只,禁食6 h,以含量為109CFU/mL的Hp菌液灌胃(1.5 mL/只),禁食禁水4 h后恢復常規(guī)飼養(yǎng),隔天1次,持續(xù)10 d,恢復常規(guī)飼養(yǎng)。ELISA檢測大鼠血清是否含有HpIgG抗體,有則代表造模成功。

將大鼠隨機分為5組:對照組(CT組)、模型組(M組)、PA低劑量組(PA L組)、PA高劑量組(PA H組)、PA H+740 Y-P組,每組12只。除CT組以外大鼠建立Hp相關性胃炎模型,CT組大鼠灌胃0.9%氯化鈉溶液。造模成功后大鼠常規(guī)飼養(yǎng)4周,PA L組、PA H組大鼠分別腹腔注射3.33、13.32 mg/kg劑量的PA[6];PA H+740 Y-P組大鼠腹腔注射PA 13.32 mg/kg+尾靜脈注射740 Y-P 10 mg/kg[7];CT組和M組大鼠腹腔注射等量0.9%氯化鈉溶液。1次/d,給藥持續(xù)4周,造模和給藥期間損失大鼠及時補充。

1.2.2 胃黏膜損傷指數(gastric mucosal damage index,UI)的評估:每組隨機選6只大鼠,采用吸入乙醚法麻醉大鼠,仰位固定,快速取出胃組織,自胃大彎剪開胃部,使用生理鹽水沖洗干凈,棉簽擦拭,觀察胃黏膜水腫、充血及潰瘍情況。根據GUTH法評價UI[8]:統(tǒng)計胃黏膜各病灶長度之和,≤1 mm記為1分;1 mm～≤2 mm記為2分;2 mm～≤3 mm記為3分;3 mm～≤4 mm記為4分;>4 mm記為5分;病灶寬度>2 mm則UI值加倍。檢測完成的胃組織勻漿后,分裝儲存在-80 ℃冰箱。

1.2.3 電鏡觀察胃黏膜細胞:每組隨機選6只大鼠,麻醉后取胃組織沖洗干凈,一半胃組織固定于4%多聚甲醛中待測,另一半胃組織固定于電鏡固定液中4 h,使用0.1 mol/L的緩沖液漂洗3次,在1%的鋨酸中固定2 h,再次漂洗,依次使用50%、70%、80%、90%、95%、100%乙醇和100%丙酮上脫水;包埋機包埋,置入37 ℃烤箱過夜,切80 nm超薄片;切片使用鈾鉛雙染色(2%醋酸鈾飽和乙醇溶液和枸櫞酸鉛分別染色15 min),室溫下干燥過夜,次日使用透射電子顯微鏡觀察切片并采集圖像。

1.2.4 HE染色觀察胃黏膜病理學變化:將1.2.3固定于多聚甲醛的胃組織石蠟包埋,制作5 μm薄片,脫蠟,蘇木精染色切片15 min,鹽酸乙醇分化10 s,浸入弱堿性溶液中返藍,再置于85%乙醇溶液中,伊紅染色5 min,梯度脫水,封片,顯微鏡下觀察病理學特征。

1.2.5 ELISA法檢測胃組織炎性因子、氧化應激因子水平:取1.2.2中胃組織勻漿液,10 000 r/min離心20 min后,取上清,使用ELISA試劑盒檢測上清中炎性因子IL-6、TNF-α、IL-10以及氧化應激因子iNOS、SOD的水平。

1.2.6 Western blot檢測胃組織蛋白表達:取1.2.2中胃組織勻漿液,使用Western blot法檢測其蛋白表達水平。再次勻漿樣品,蛋白定量并等量點樣在凝膠中,經電泳、轉膜將樣品條帶在PVDF膜上按分子量大小分開,將PVDF膜分別孵育在p-PI3K、PI3K、p-AKT、AKT、p-NF-κB p65、NF-κB p65抗體中,再經過二抗和ECL化學發(fā)光液反應,分析各蛋白的表達水平。

1.3 統(tǒng)計學分析

2 結果

2.1 各組大鼠UI比較

CT組大鼠胃黏膜無損傷情況;與CT組比較,M組大鼠胃黏膜上皮水腫、充血,潰瘍嚴重,UI升高(P<0.05);與M組比較,PA L組、PA H組大鼠潰瘍部位減少,水腫改善,UI呈劑量依賴性降低(P<0.05);與PA H組比較,PA H+740 Y-P組大鼠潰瘍情況嚴重,上皮充血,UI升高(P<0.05)(表1)。

表1 各組大鼠胃黏膜損傷指數(UI)比較

2.2 各組大鼠胃黏膜形態(tài)學比較

CT組大鼠胃黏膜上皮細胞排列整齊,細胞膜完整,細胞器結構正常;M組大鼠胃黏膜上皮細胞固縮,細胞膜出現(xiàn)破裂,細胞器腫脹、游離、空泡變;與M組比較,PA L組、PA H組胃黏膜上皮細胞膜較完整,細胞器腫脹程度改善、結構較正常;與PA H組比較,PA H+740 Y-P組胃黏膜上皮細胞損傷較嚴重,細胞膜破裂(圖1)。

圖1 透射電鏡觀察胃黏膜形態(tài)學Fig 1 Morphology of gastric mucosa observed by transmission electron microscopy

2.3 各組大鼠胃黏膜病理形態(tài)學特征比較

CT組大鼠胃黏膜皺壁正常,未見充血和黏膜糜爛;M組大鼠胃黏膜變薄,黏膜糜爛,部分腺體輕微擴張,可見炎性細胞浸潤;與M組比較,PA L組、PA H組胃黏膜皺壁趨于正常、糜爛改善、少許充血,少量炎性細胞浸潤;與PA H組比較,PA H+740 Y-P組胃黏膜糜爛加重,炎性細胞浸潤增加(圖2)。

圖2 HE染色檢測胃黏膜病理形態(tài)學特征Fig 2 Pathologic characteristics of gastric mucosa detected by HE staining

2.4 各組大鼠胃組織IL-6、TNF-α、IL-10水平比較

與CT組比較,M組IL-6、TNF-α水平升高,IL-10水平下降(P<0.05);與M組比較,PA L組、PA H組IL-6、TNF-α水平下降,IL-10水平升高,且呈劑量依賴性(P<0.05);與PA H組比較,PA H+740 Y-P組IL-6、TNF-α水平升高,IL-10水平下降(P<0.05)(表2)。

表2 各組大鼠胃組織IL-6、TNF-α、IL-10水平比較Table 2 Comparison of IL-6, TNF-α and IL-10 levels in gastric tissue of rats in each pg/mL, n=6)

2.5 各組大鼠胃組織iNOS、SOD水平比較

與CT組比較,M組iNOS水平升高,SOD水平下降(P<0.05);與M組比較,PA L組、PA H組iNOS水平下降、SOD升高,且呈劑量依賴性(P<0.05);與PA H組比較,PA H+740 Y-P組iNOS水平升高、SOD水平下降(P<0.05)(表3)。

表3 各組大鼠胃組織iNOS、SOD水平比較

2.6 各組大鼠胃組織蛋白表達水平比較

與CT組比較,M組p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT、p-NF-κB p65/NF-κB p65蛋白表達水平升高(P<0.05);與M組比較,PA L組、PA H組p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT、p-NF-κB p65/NF-κB p65蛋白表達水平呈劑量依賴性下降(P<0.05);與PA H組比較,PA H+740 Y-P組p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT、p-NF-κB p65/NF-κB p65蛋白表達水平升高(P<0.05)(圖3)。

*P<0.05 compared with CT group; #P<0.05 compared with M group; △P<0.05 compared with PA L group; &P<0.05 compared with PA H group.

3 討論

Hp擁有多種毒力基因,使細菌能夠適應胃部的酸性環(huán)境,并附著在胃上皮細胞上,引起慢性炎性和組織損傷[11]。研究發(fā)現(xiàn),患者感染Hp后IL-6和TNF-α水平升高,促炎因子IL-6可以誘導血管內皮生長因子的產生,而TNF-α具有促進癌細胞增殖、侵襲和轉移以及腫瘤血管生成的潛力,因此Hp引起的胃炎也是胃癌發(fā)生的第一步[12]。Hp利用IL-10的免疫抑制作用來幫助其逃離宿主的免疫系統(tǒng),進而誘導胃部慢性炎性反應[13]。本研究采用Hp菌液灌胃法建立Hp相關性胃炎大鼠模型,發(fā)現(xiàn)Hp相關性胃炎大鼠胃黏膜糜爛,上皮水腫、充血、潰瘍和炎性細胞浸潤嚴重,且胃組織中IL-6、TNF-α水平升高,IL-10水平下降,表明Hp持續(xù)感染促進促炎細胞因子的分泌,誘發(fā)組織損傷;PA有效改善模型大鼠胃黏膜糜爛,上皮水腫、潰瘍及炎性細胞浸潤情況,下調IL-6、TNF-α水平,上調IL-10水平,減輕胃黏膜損傷。此外,細菌分泌的毒力因子激活氧化應激也會介導宿主細胞的慢性炎性反應[14]。iNOS是機體活性氮自由基產生的催化酶,iNOS一旦被激活會持續(xù)較長時間并產生大量NO,刺激氧化應激并引起胃損傷;SOD保護機體免受自由基的損害,SOD水平的降低可能引發(fā)鏈狀脂質過氧化,加劇胃黏膜細胞損傷[15]。在本研究中,模型大鼠胃組織iNOS水平升高、SOD水平下降,說明大量的NO和自由基可能加速胃炎的進展,這種變化可以被PA緩解,提示PA可改善Hp相關性胃炎大鼠胃組織中氧化-抗氧化之間的不平衡。

PI3K介導細胞炎性反應調節(jié)過程,PI3K的激活會促使AKT活化,進而激活NF-κB,誘導多種炎性相關基因的表達[16]。抑制PI3K/AKT/NF-κB通路的活化可減少氧化應激和炎性反應,對胃潰瘍發(fā)揮保護作用[17]。本研究發(fā)現(xiàn),胃炎大鼠胃組織p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT、p-NF-κB p65/NF-κB p65蛋白水平升高,PA能抑制胃炎大鼠PI3K/AKT/NF-κB信號的激活,且PI3K激活劑740 Y-P可減弱PA對胃炎大鼠的胃黏膜損傷的改善作用,提示PA可能通過抑制PI3K/AKT/NF-κB通路,減輕Hp相關性胃炎大鼠胃黏膜損傷。

綜上所述,PA可能通過抑制PI3K/AKT/NF-κB通路發(fā)揮對Hp相關性胃炎大鼠的治療作用。然而,Hp相關性胃炎的病因十分復雜,PA的作用機制還需更加廣泛、深入的探究。